EMBRĐYO TRANSFERĐ. Dr. Numan Akyol Lalahan. lalahanakyol 1

Transkript

1 EMBRĐYO TRANSFERĐ Dr. Numan Akyol Lalahan Hayvancılık k Merkez Araştırma rma Enstitüsü lalahanakyol 1

2 lalahanakyol 2

3 EMBRĐYO TRANSFERĐNĐN AVANTAJLARI Normalden 20 kat daha fazla sayıda yavru Genetiğin %100 ünün kontrolü Projeni test çalışmalarında etkinlik Canlı hayvan nakil zorluğunun ortadan kalkması Taşıyıcı annenin antikorlarından faydalanma Verim yönünün değiştirilebilmesi Etkin gen kaynağı muhafazası imkanı lalahanakyol 3

4 EMBRĐYO TRANSFERĐNĐN AŞAMALARI SÜPEROVULASYON ÖSTRUS SĐNKRONĐZASYONU UTERUS YIKAMASI EMBRĐYO DEĞERLENDĐRME VE SINIFLANDIRMASI EMBRĐYO DONDURULMASI VEYA TAZE TRANSFERĐ lalahanakyol 4

5 Östrus Siklusunda hormon profilleri (Sığır) östrojen progesteron LH FSH hormon konsantrasyonu siklus günleri lalahanakyol 5

6 Pro-östrus siklus günleri Gerileyen bir CL GnRH etkisi ile FSH lalahanakyol 6

7 Östrus 12-18saat süreli Gerilemiş bir CL Fluktuan bir Graaf Follikülü Östrojenik etki lalahanakyol 7

8 Met-östrus Östrus bitiminden sonraki 3gün Gelişmeye aday bir CL Kanlı akıntı lalahanakyol 8

9 Di-östrus Siklusun en uzun dönemi gün Olgun bir CL Uterus gevşek lalahanakyol 9

10 SÜPEROVULASYON lalahanakyol 10

11 SÜPEROVULASYON Fol Fol Fol 7.5MhZ Linear Prob Fol Fol Fol lalahanakyol 11

12 SÜPEROVULASYON Fl Fl Fl Fl Fl Fl Fl 5,0MhZ Linear Prob Fl Fl Fl Fl Fl lalahanakyol 12

13 SÜPEROVULASYON 5,0MhZ Linear Prob lalahanakyol 13

14 SÜPEROVULASYON CL CL 5,0MhZ Linear Prob CL CL CL lalahanakyol 14

15 SÜPEROVULASYON 5,0MhZ Linear Prob lalahanakyol 15

16 SÜPEROVULASYON CL CL CL 5,0MhZ Linear Prob CL CL lalahanakyol 16

17 lalahanakyol 17

18 UTERUS YIKAMASI lalahanakyol 18

19 Embriyo Değerlendirilmesi ve SAFHA sınıflandırılması 16 HÜCRE MORULA...6 GÜN KOMPAKT MORULA...7 ERKEN BLASTOSĐST...7 BLASTOSĐST...8 GENĐŞLEMĐŞ BLASTOSĐST...8 HATCHING BLASTOSĐST HATCHED BLASTOSĐST KALĐTE MÜKEMMEL - ĐYĐ VASAT ZAYIF DEJENERE UFO lalahanakyol 19

20 lalahanakyol 20

21 Embriyo kalite sınıflandırmasında kriterler (G.M.Lindner et al.,1983) Mükemmel : Đdeal embriyodur, küresel, simetrik tarzda, renk ve yapısal açıdan uniformite gösterir. Đyi Vasat Zayıf : Önemsiz birkaç blastomer düzensizliği ve kopmaları, düzensiz bir şekil, gözlenebilen birkaç vezikül varlığı. : Vezikül oluşumu ve ayrılmış birkaç blastomer gibi gözlenen bazı problemlerin varlığı, %10-30 arasında tespit edilen dejenerasyon ve düzensizlik. : Ana embriyo kısmında gözlenen ayrılmalar, bir miktar dejenere hücre, çok miktarda vezkül oluşumu, %30-50 arasında düzensizlik ve dejenerasyon. lalahanakyol 21

22 lalahanakyol 22

23 lalahanakyol 23

24 lalahanakyol 24

25 lalahanakyol 25

26 lalahanakyol 26

27 lalahanakyol 27

28 lalahanakyol 28

29 lalahanakyol 29

30 lalahanakyol 30

31 lalahanakyol 31

32 lalahanakyol 32

33 lalahanakyol 33

34 lalahanakyol 34

35 lalahanakyol 35

36 ÜLKEMiZDE YAPILAN ilk EMBRĐYO TRANSFERĐ ÇALIŞMALARI 1981 TAVŞANLARDA (Kılıçoğlu ve Tekeli) 1983 FARELERDE (Ünal) 1984 KOYUNLARDA (Kılıçoğlu ve ark.) 1986 ĐNEKLERDE (Đleri ve Sayın) 1989 Đneklere dond. emb. Trans. (Sungur ve ark.) 1997 ANKARA KEÇĐLERĐNDE (Kılıçarslan ve Şenünver) 1997 KISRAKLARDA (Ekici) 2001 %70 GEBELĐK (Akyol ve ark.) 2005 Ülkemizin ilk IVF buzağısı (Akyol ve ark.) 2005 Ülkemizin ilk direkt transfer ve vitrifiye embriyo gebelikleri (Kızıl ve ark.) 2005 Ülkemizde ilk OPU çalışması (Akyol ve ark.) lalahanakyol 36

37 ENSTĐTÜMÜZDE YAPILAN EMBRĐYO TRANSFERĐ ÇALIŞMALARI 1989 yılında 64 baş Đsviçre Esmeri düveye dondurulmuş ithal Brangus embriyosu nakli yapıldı ve %32.8 gebelik elde edildi (Sungur ve ark. 1989) 1991 yılında taze nakilden %22.2 gebelik elde edildi (Sungur ve ark. 1991) 1994 yılında 5 baş vericiden 24 adet embriyo alınıp, 17 embriyo dondurulmuş ve 14 donmuş-çözünmüş embriyo naklinden %28.5 gebelik elde edilmiştir. (Sungur, 1994) 2001 yılında 20 uterus yıkaması yapılmış 70 embriyo bulunmuş 10 adet taze nakilden 7 gebelik elde edilmiştir. (Akyol ve ark. 2004) lalahanakyol 37

38 Kısa süreli muhafaza & Embriyo muameleleri lalahanakyol 38

39 Embriyo dondurulmasıyla ilgili gelişmeler Yıl Araştırmacı Sığırlardaki ilk başarılı çalışma 1973 Wilmut & Rowson Freezing of Embryo (DMSO) 1979 Bilton & Moore Freezing of Embryo (Glycerol) 1982 Renard et al. One Step Straw Method 1983 Lehn-Jensen et al. Freezing of Bisected Embryo 1987 Massip et al. Vitrifrication lalahanakyol 39

40 Kısa süreli embriyo muhafazası D-PBS + %10-20 Buzağı Serumu * Embriyo elde edildikten sonra mümkün olduğunca çabuk taşıyıcıya transfer edilmelidir. * Transfer mediumu olarak kullanılabilir. TCM % FCS + 0.1mM beta-mercaptoethanol * Đki gün embriyo kültürü yapılabilir (inkubatör şartlarında) lalahanakyol 40

41 EMBRĐYO ĐLE ÇALIŞIRKEN... a. Steril teknik ve uygulamalar b. Kontaminasyon riski c. Isı değişimleri d. Ultravioleye maruz kalma e. Medium lalahanakyol 41

42 Embriyonun Transferi * Cerrahi metot * Cerrahi olmayan metot Serviks kanalından By-pass (Sugie s method) lalahanakyol 42

43 lalahanakyol 43

44 lalahanakyol 44

45 EMBRĐYO TRANSFERĐNDE BAŞARIYI ETKĐLEYEN BAZI FAKTÖRLER EmbrĐyo kalitesi Transfer tekniği Hijyenik kurallara uygunluk CL tarafına transfer Donor ve taşıyıcı arasındaki östrus sinkronizasyonu farkı Taşıyıcının durumu (Đnek Düve) Taşıyıcının beslenme ve çevresel koşulları lalahanakyol 45

46 Embriyo CL bulunan tarafa transfer edilmeli (ipsilateral transfer) Cerrahi olmayan metotda transfer yerinin derinliğinden ziyade uterus endometriumuna bir zarar verip vermemek kanusu daha önemli Cerrahi olmayan Cerrahi CL lalahanakyol 46

47 KATETERĐN SERVĐKSTEN GĐRĐŞĐ 1 lalahanakyol 47

48 lalahanakyol 48 2

49 Memeli embriyolarının ilk başarılı dondurma çalışmaları Tür Araştırmacı Yıl Fare Whittingham ve ark Rat Whittingham 1975 Tavşan Bank ve Mourer 1974 Sığır Wilmut ve Rowson 1973 At Yamamoto ve ark Koyun Willadsen ve ark Keçi Bilton ve Moore 1976 Đnsan Trounson ve ark lalahanakyol 49

50 Sığır embriyo dondurulmasının tarihçesi Author Year Cryoprotectant Notes Wilmut and Rowson 1973 DMSO First calves Leibo et al Glycerol One step dilution method using sucrose Renard et al Glycerol One step dilution method using sucrose Leibo 1983 Glycerol One step straw method 1984 Suzuki et al Glycerol One step straw method 1985 Willadsen et al DMSO Direct transfer Massip and Van der Zwalmen 1984 Glycero + sucrose Direct transfer Massip et al Glycero + sucrose Direct transfer Suzuki et al Propylene Direct transfer glycol(sucrose) Dochi et al Ethylene glycol Direct transfer Voelkel and Hu 1992 Ethylene glycol Direct transfer lalahanakyol 50

51 EMBRĐYO DONDURULMASI Klasik embriyo dondurulması Buz kristalleri oluşumu Programlı soğutma için dondurma cihazı gerekli Vitrifikasyon Buz kristali oluşmaz Embriyo sıvı azot içerisine direkt olarak alınır, dondurma cihazı gerekmez lalahanakyol 51

52 Dondurma Metotları Aşamalı metot %10 (1.36M) Gliserol (Bilton & Moore, 1979) Direkt Transfer metodu %10 (1.8M) Etilen glikol (Dochi et al, 1991) lalahanakyol 52

53 Embriyo dondurulmasının önemli aşamaları (Embriyo toplanması) Kriyoprotektanlarla ekilibrasyon Soğutma & Seeding LN2 Çözündürme Kriyoprotektanlardan arındırma Canlılık kontrolü (Transfer) Direkt transferde gerekmez lalahanakyol 53

54 lalahanakyol 54

55 S e e d i n g lalahanakyol 55

56 VĐTRĐFĐKASYON NEDĐR? Vitrifikasyon buz kristalleri oluşmadan, embriyonun bulunduğu ortamı cam şeklinde katılaştırmak anlamındadır. Bu amaçla ekstrem bir viskozite (kriyoprotektan yoğunluğu) ve soğutma süresi kullanılır. lalahanakyol 56

57 Çeşitli Vitrifikasyon Solusyonları Araştırmacı Kriyoprotektan Hayvan (yıl) (Aşama) Rall,WF DMSO %20.5 (w/v) Fare & Fahy,GM Asetamid %10.5 (w/v) (8-Hücre) (1985) PG %10 (w/v) PEG %6 (w/v) Scheffen,B. PG %25 (v/v) Fare et al (1986) GL %25 (v/v) (KM, EB) Massip,A. PG %25 (v/v) Sığır et al (1987) GL %25 (v/v) (KM, EB) Kasai,M. EG %40 (v/v) Fare et al(1990) Fikol %18 (w/v) (M) Sakkaroz 0.3 M Yang, et al GL %25 (v/v) Sığır (1992) EG %25 (v/v) (BL-IVF) lalahanakyol 57

58 lalahanakyol 58

59 lalahanakyol 59

60 lalahanakyol 60

61 lalahanakyol 61

62 Embriyo Kültürü lalahanakyol 62

63 Embriyo Kültürü için Kullanılan Mediumlar Posfat Tampon Solusyonu (PBS) Đnkubatör dışındaph değişimlerinden korunmak için oldukça iyi bir tampon Uzun süreli kültür için uygun değil Bicarbonate buffered media Ham's F10 BMOC-3 Menezo's B2 TCM de %5 CO2 inkubasyon lalahanakyol 63

64 Mikrodroplar içerisinde ve inkubatörde kültür için... lalahanakyol 64