Laboratuvar Tekniği. Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 5. Hafta (14.03.

Transkript

1 Laboratuvar Tekniği Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 5. Hafta ( ) 1

2 5. Haftanın Ders İçeriği DNA ekstraksiyonu DNA ekstraksiyonunun amacı DNA ekstraksiyon protokolü basamaklarının ve her aşamanın kimyasal süreç analizi 2

3 5. Haftanın Ders İçeriği DNA ekstraksiyonunun amacı; DNA; PCR, dizilime vb. araştırmalarda kullanılmak üzere saflaştırılarak elde edilmesi gereklidir. DNA İzolasyonu; Organizmaların hücre yapılarında bulunan hücre zarı, çeperi gibi yapıların bazı kimyasal maddeler ve enzimler yoluyla yıkılarak DNA nın elde edilmesine DNA izolasyonu denir. 3

4 DNA ekstraksyion protokolü Birçok DNA ekstraksiyon protokolü iki aşamadan oluşur. 1) Hücre içeriğinin açığa çıkması (Lizis) ve DNA nın çözülmesi 2) Enzimatik yada kimyasal metodlarla proteinlerin, RNA ve makromoleküllerin uzaklaştırılması 4

5 Bitkilerin çekirdek yapısı çekirdek membranı ile çevrilidir. Çekirdek membranından sonra hücre membranı ve hücre çeperi vardır. Hücrenin DNA sının diğer tüm kısımlardan ayırarak saflaştırmak için 4 basamaklı bir yol izlenir. 1) Hücre içeriğinin açığa çıkması (Lizis) 2) Çöktürme (Presipitasyon) 3) Yıkama 4) Resüspansiyon 5

6 Araştırma Laboratuvarı ve Sınıf İçi Uygulama Laboratuvarındaki DNA ekstraksiyon yöntemlerinin karşılaştırılması 6

7 Araştırma Laboratuvarı DNA Ekstraksiyon Yöntemi/Protokolü 1) Lizis: Sıvı Azot (N 2 ) da öğütme ve deterjan kullanma 2) Presipitasyon 1. Kısım: Proteinlerin uzaklaştırılması için fenol/klorofom ektraksiyonu Sıvı faz (Nükleik asitler) Fenol faz (proteinler) 7

8 Araştırma Laboratuvarı DNA Ekstraksiyon Yöntemi/Protokolü 3) Presipitasyon 2. Kısım: DNA nın fosfat larının su ile hidrojen bağlarının bozunması için tuzların ilavesi. 4) Presipitasyon 3. Kısım: DNA nın ortamdaki çözeltiden ayrılması için etanol ilavesi. 5) Yıkama ve resüspansiyon: DNA etanol de yıkanır, kurulanır ve H 2 O yada TE tamponunda yeniden resüspanse hale getirilir. 8

9 Sınıf İçi Uygulama Laboratuvarı DNA Ekstraksiyon Yöntemi/Protokolü 1) Lizis: Havan ve havan eli ile deterjan kullanılır. 2) Presipitasyon 1. Kısım: Kullanılmaz (Kimyasallar Tehlikelidir.) 3) Presipitasyon 2. Kısım: Su ve DNA nın fosfat molekülleri arasındaki hidrojen bağlarının bozunması için tuz ilave edilir. 4) Presipitasyon 3. Kısım: DNA nın ortam çözeltisinden ayrılması için etanol ilave edilir. 5) Yıkama ve resüspansiyon: DNA etanolde yıkanır, kurutulur ve H 2 O ve TE tamponu içinde yeniden resüspanse hale getirilir. 9

10 1) LİZİS a) Bitkilerden DNA ekstraksiyonunda hücre çeperinin yıkılması ve hücresel membranların yıkılması basamakları aşamasıdır (plasma ve nükleer membranlar için önemli olan basamak) b) Hücre çeperi (selüloz yapılıdır) ve mekanik güç uygulayarak bozunması sağlanır (Örneğin yaprakların havan ve havan ile öğütülmesi) 10

11 1) LİZİS devam; c) Daha sonra deterjan ilave edilerek hücre membranları yıkılır. Deterjanlar membranları amphipatic (hem hidrofobik hemde hidrofilik bölgeler) yapıları (hem hücre membranlarının hemde deterjanların) gereği bozabilirler. Deterjan molekülleri membran tabakasını ayırabilirler. Lizis sonucu bitki hücrelerinin içeriği ortam çözeltisine geçer. 11

12 2) Presipitasyon / Çöktürme (Araştırma Laboratuvarı İçin) Araştırma laboratuvarında çöktürmenin ilk aşaması fenol/kloroform kimyasalları ile DNA dan proteinlerin uzaklaştırılmasına yarar. Fenol proteinleri denatüre eder ve yapısını çözer. Kloroformda bir protein denatürantıdır. Bu aşama öğrenci laboratuvarlarında uygulanmamaktadır 12

13 2) Presipitasyon / Çöktürme devam; (Araştırma Laboratuvarı İçin) DNA çöktürmesindeki ikinci aşama Tuzların ilavesidir. Tuzlar su ve DNA molekülleri arasındaki hidrojen bağlarının bozar/kırar. DNA yeniden/ilave olarak protein yapılardan isopropanol yada etanol ile uzaklaştırılır ve çöktürülür. Katyonların varlığında etanol DNA moleküllerinin topaklanması ve çökmesini sağlar. DNA santrifüjelenerek çökeltinin üzerindeki kısmı atılır. 13

14 2) Presipitasyon / Çöktürme devam; (Öğrenci Laboratuvarı İçin) Öğrenci laboratuvarında DNA çöktürmesi tuzların eklenmesiyle başlar. Tuzlar su ve DNA molekülleri arasındaki hidrojen bağlarının bozar/kırar. DNA yeniden/ilave olarak protein yapılardan isopropanol yada etanol ile uzaklaştırılır ve çöktürülür. Katyonların varlığında etanol DNA da yapısal değişikler yaparak, çözeltideki DNA moleküllerinin topaklanarak çökmesini sağlar. Not: Bu protokolde Fenol/Kloroform kimyasalları kullanılmaması nedeniyle öğrenci laboratuvarında izole edilen DNA, araştırma laboratuvarlarında izole edilen DNA lar kadar TEMİZ değildir. 14

15 3) Yıkama Çöktürülen DNA asetat tuzları ile yüklüdür. %70 lik etanol çözeltisi ile yıkanması tuzların ve suda çözünen diğer safsızlıkların yıkanması/ uzaklaştırılması içindir. 4) Resüspansiyon Temizlenen DNA tampon çözelti içinde uzun süreli sabitliğini koruyabilmesi için resüspanse hale getirilmelidir. Bu aşama için kullanılan tampon çözelti TE resüspansiyon tamponudur. 15

16 ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Hücre çeperi ve membran yapısı parçalanır. DNA çözeltisi içindeki katı maddeleri santrifüjlenerek uzaklaştırılır İsopropanol ile DNA çöktürülür. DNA çözdürülür. DNA topakçıkları etanol ile yıkanır ve daha sonra kurutulur. DNA dan çözünmüş tuzlar ve şekerlerin uzaklaştırması için santrifüjlenir. 16

17 DNA nın kalitesinin kontrol edilmesi Düşük kalitedeki DNA PCR da iyi sonuç vermez. DNA nın kalitesini aşağıdaki basit protokolü uygularak bulabilirsiniz. 10 µl DNA yı, 10 µl yükleme tamponu ile karıştırınız. Karışımı %1 lik agaroz jele yükleyiniz. Sonuçları analiz ediniz. 17

18 Araştırma Laboratuvarında DNA nın Kalitesi ile İlgili Beklenen Olası Sonuçlar ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Yanda çeşitli bitkilerden 5 genomik DNA örneğinin agaroz jeldeki görüntüsü verilmiştir. Yüksek moleküler ağırlıklı DNA nın temiz ve kalın bantları net olarak görülmektedir. Bu şekilde net DNA bantları araştırma laboratuvarında optimal koşullarda elde edilmiştir. 1 kbp ve 100 bp kontrolbelirteci 5 farklı tahıl türürüne ait DNA örnekleri 18

19 Sınıf İçi Uygulama Laboratuvarında DNA nın Kalitesi ile İlgili Beklenen Olası Sonuçlar ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Protokolü uygulayarak elde ettiğimiz agaroz jel görüntüsü bir önceki slaytta verilen optimal şartlardaki bantlardan farklı şekilde olur. (Bantların temiz görüntü vermeme nedeni fenol/kloroform basamağının öğrenci laboratuvarında atlanmış olmasıdır.) Bu beklenen bir sonuç olmasına rağmen ekstrakte edilen DNA PCR da çoğaltım için kullanılabilir haldedir. Belirteç A B C D E A bantı: Arpa B bantı: Mısır C bantı: Yulaf D bantı: Pirinç E bantı: Buğday 19

20 Sınıf İçi Uygulama Laboratuvarında DNA nın Kalitesi ile İlgili Beklenen Olası Sonuçlar ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Örneklerin analizi Arpa (A): Örnek sorunsuz Mısır (B): Örnek sorunsuz Yulaf (C): Örnek sorunsuz Pirinç (D): Örnek sorunsuz Buğday (E): Bu örnekte ciddi şekilde bozunma vardır ancak PCR da çalışabilir. Bununla beraber yeniden ekstrakte edilmelidir. Belirteç A B C D E Özellikle buğday da temiz bir bant görüntüsünün ortaya çıkmamasını DNA nın birçok iplikçiğe bölünmesi ile açıklanabilir ( bp aralığında) 100 ile 1000 bp temiz bantlar RNA nın görüntülenebildiği aralıktır. 20

21 Never Stop Thinking! 21