Kozmetik Ürün Bileşimlerinin Kontrolü İçin Gerekli Analiz Yöntemleri Hakkında Tebliğ. Tebliğ No:İEG-2005/ R.G. Sayısı:25862.

Transkript

1 Kozmetik Ürün Bileşimlerinin Kontrolü İçin Gerekli Analiz Yöntemleri Hakkında Tebliğ Tebliğ No:İEG-2005/ R.G. Sayısı:25862 Amaç Madde 1- Bu Tebliğin amacı, saç bakım ürünlerindeki okside edici ajanların tanımlanması ve hidrojen peroksidin saptanması, saç boyalarındaki belirli oksidasyon renklendiricilerinin tanımlanması ve yarı nicel (semi-kantitatif) olarak saptanması, nitritin tanımlanması ve saptanması, serbest formaldehidin tanımlanması ve saptanması, şampuan ve saç losyonlarında rezorsinolün tayini ve etanol ve propan-2-ol ile bağlantılı olarak metanolün saptanması konularındaki analiz yöntemleri ile ilgili usul ve esasları belirlemektir. Kapsam Madde 2- Bu Tebliğ, aşağıdaki analiz metodlarının uygulamalarını kapsar: a) Saç bakım ürünlerindeki okside edici ajanların tanımlanması ve hidrojen peroksidin saptanması EK teki Yöntem I e göre yapılır. b) Saç boyalarındaki belirli oksidasyon renklendiricilerinin tanımlanması ve yarı nicel (semi-kantitatif) olarak saptanması EK teki Yöntem II ye göre yapılır. c) Nitritin tanımlanması ve saptanması EK teki Yöntem III e göre yapılır. d) Serbest formaldehidin tanımlanması ve saptanması EK teki Yöntem IV e göre yapılır. e) Şampuan ve saç losyonlarında rezorsinolün tayini EK teki Yöntem V e göre yapılır. f) Etanol ve propan-2-ol ile bağlantılı olarak metanolün saptanması EK teki Yöntem VI ya göre yapılır. Hukuki Dayanak Madde 3 - Bu Tebliğ, 23/5/2005 tarihli ve sayılı Resmi Gazete de yayımlanan Kozmetik Yönetmeliği nin 16 ncı maddesine dayanılarak hazırlanmıştır. Uyumlaştırılan Avrupa Birliği Mevzuatı Madde 4- Bu Tebliğ, 82/434/EEC sayılı Kozmetik Ürün Bileşimlerinin Kontrolü İçin Gerekli Analiz Yöntemleri Hakkında İkinci Komisyon Direktifi dikkate alınarak

2 Avrupa Birliği mevzuatına uyum kapsamında hazırlanmıştır. Bu Tebliğ, laboratuarların denenmiş ve bilimsel geçerliliği olan yöntemleri kullanmasını engellemez. Yürürlük Madde 5- Bu Tebliğ yayımı tarihinde yürürlüğe girer. Yürütme Madde 6- Bu Tebliğ hükümlerini Sağlık Bakanı yürütür. EK YÖNTEM I- SAÇ BAKIM ÜRÜNLERİNDE OKSİDE EDİCİ AJANLARIN TANIMLANMASI VE HİDROJEN PEROKSİD TAYİNİ KAPSAM VE UYGULAMA ALANI Kozmetik ürünlerde hidrojen peroksidin iyodimetrik tayini sadece, iyodürlerden iyot oluşturan diğer oksitleyici ajanların yokluğunda mümkün olabilir. Sonuç olarak, hidrojenperoksidin iyodimetrik tayininden önce, mevcut olan diğer tüm oksitleyici ajanların saptanması ve tanımlanması önemlidir. Bu tanımlama iki aşamaya ayrılır; birinci aşama persülfatlar, bromatlar ve hidrojen peroksidi kapsar. İkinci aşama baryum peroksidi kapsar. A- PERSULFATLARIN, BROMATLARIN VE HİDROJEN PEROKSİDİN TANIMLANMASI 1. PRENSİP Sodyum persülfat, potasyum persülfat ve amonyum persülfat; potasyum bromat, sodyum bromat ve hidrojen peroksit (baryum peroksitten meydana gelsin veya gelmesin) Kağıt Kromatografisi Yöntemiyle, iki yürütme solvanı kullanılarak yapılır. 2. REAKTİFLER Bütün çözeltiler analitik saflıkta olmalıdır Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalıdır Sodyum persülfat Potasyum persülfat Amonyum persülfat

3 Potasyum bromat Sodyum bromat Hidrojen peroksit 2.2. Yürütme Solvanı A, 80% (v/v) etanol 2.3. Yürütme solvanı B, benzen-metanol-3-metil butan-1-ol-su (34:38:18:10, v/v/v/v) 2.4. Püskürtme reaktifi A, % 10 m/v sulu potasyum iyodür Püskürtme reaktifi B, % 1 m/v nişasta çözeltisi 2.6. Püskürtme reaktifi C, % 10 m/m hidroklorik asit N HCl 3. DÜZENEK VE EKİPMAN 3.1. Kromatografi kağıdı (whatman paper No: 3 ve No: 4 veya eşdeğeri) 3.2. Mikropipet 1 mikrolitre 3.3. Standart balonlar 100 ml Oluklu filtreler 3.5. Kağıt Kromatografisi için gerekli düzenekler 4. ÖRNEK HAZIRLAMA 4.1. Suda çözünebilir ürünler: 1 gr ve 5 gr örnek tartılıp, 100 er ml suda çözünür. Her solüsyondan 1 µl kullanılmak üzere bölüm 5 de bahsedildiği şekilde Kağıt Kromatografisine uygulanır Suda az veya zor çözünen ürünler gr ve 5 gr numune tartılıp, 50 şer ml suda dispers hale getirilir ve su ile 100 ml ye tamamlanır, karıştırılır. Bu iki dispersiyon oluklu filtreden (3.4) süzülür. Süzüntülerin her birinden 1 µl kullanılmak üzere, bölüm 5 de bahsedildiği şekilde Kağıt Kromatografisine uygulanır Bir kez daha her örnekten 1 gr ve 5 gr tartılır. 50 ml distile su içinde dispers hale getirilir ve dilüe HCl (2.7) ile asitlendirilir ve su ile 100 ml ye tamamlanarak

4 4.3. Kremler 5. METOD karıştırılır. Bu karışımlar oluklu filtreden (3.4) isüzülür. Her bir süzüntüden 1 er µl kullanılmak üzere bölüm 5 de bahsedildiği şekilde Kağıt Kromatografisine uygulanır. 5 gr ve 20 gr lık örnekler alınır ve 100 ml suda dispers hale getirilir. Bölüm 5 de bahsedildiği şekilde Kağıt Kromatografisine uygulanır Uygun miktarlarda A (2.2) ve B (2.3) solvanları kağıt kromatografisi uygulanmak üzere iki ayrı yürütme tankına koyularak en az 24 saat doyurulur µl örnek solsüyonundan ve referans solüsyonundan (4 ve 2.1 bölümlerine göre hazırlanmış) kromatografi kağıdına damlatılır. (Whatman No: 3 veya eşdeğeri) 40 cm uzunluğunda 20 cm genişliğinde (3.1) veya diğer uygun formatta açık havada kurutulur Kromatografi kağıdı (5.2) içinde A (5.1) yürütme solvanı bulunan tank içine daldırılır ve 35 cm yüksekliğine kadar (yaklaşık 15 saat) yürütülür (5.2) ve (5.3) bölümünde belirtilen yol izlenerek ve (3.1) de belirtilen whatman No: 4 kromatografi kağıdı veya eşdeğeri kullanılarak damlatma işlemi tekrarlanır ve B yürütme solvanında 35 cm (10 cm) yüksekliğe kadar (yaklaşık 5 saat) yürütülür Yürütme işlemi tamamlandıktan sonra tanktan çıkartılan kromatogramlar havada kurutulur Noktalar aşağıdaki şekilde püskürtme reaktifleri yardımıyla belirlenir Püskürtme reaktif A (2.4) ve arkasından kısa bir süre sonrada püskürtme reaktifi B (2.5) püskürtülerek izlenir. İlk önce persülfatlar belirginleşmeye başlar, arkasından hidrojen peroksit noktaları belirginleşir. Bu noktalar kalemle işaretlenir Yukarıdaki kromatograma (5.6.1) püskürtme reaktif C (2.6) uygulandıktan sonra bromatlar grimsi mavi renkli noktalar halinde kromatogram üzerinden belirginleşeceklerdir Yukarıdaki şartlara göre yürütme solvanı A (2.2) ve yürütme solvanı B (2.3) e göre referans maddelerinin (2.1) Rf değerleri yaklaşık aşağıdaki şekildedir. Yürütme Solvanı Yürütme Solvanı A (2:2) B (2.3) Sodyum persülfat Potasyum persülfat Amonyum persülfat Sodyum bromat Potasyum bromat Hidrojen peroksit

5 B- BARYUM PEROKSİD TANIMLANMASI 1. PRENSİP Baryum peroksit, (A.4.2) deki örneğin asitlendirilmesinden sonra hidrojen peroksit oluşumuna göre ve Baryum iyonları varlığında tanımlanır: 2. REAKTİFLER 2.1. Metanol Persulfatların (A) mevcut olmadığı durumlarda, asidik numune solsüyonunun bir kısmına (B.4.1) dilüe H 2 SO 4 ilave edilerek baryum sülfat beyaz çökelek halinde oluşur. Örnekte (B.4.1) bulunan baryum iyonları aşağıdaki şekilde Kağıt Kromatografisi metoduyla (B.5), tekrar doğrulanır. Eğer baryum peroksit ve persülfatlar birlikte mevcut bulunuyorlarsa (B.4.2), bir alkali içinde solüsyondan (B.4.2) elde edilen bakiye HCl de çözündükten sonra eriyikte (B.4.2.3) yer alan baryum iyonlarını Kağıt Kromatografisi Yöntemiyle veya baryum sülfat çökeleği oluşturularak teşhis edilir % 36 (m/m) konsantre hidroklorik asit N Hidroklorik asit N Sülfürik asit 2.5. Rodizonik asit di sodyum tuzu 2.6. Baryum klorür (BaCl 2-2H 2 O) 2.7. Susuz sodyum karbonat 2.8. % 1( m/v) Baryum klorür çözeltisi 2.9. Yürütme solvanı; metanol-% 36 HC-H 2 O (80:10:10, v/v/v) Püskürtme reaktifi; % 0.1 (m/v) Rodizonik asit disodyum tuzunun sulu çözeltisi (Kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır.) 3. DÜZENEK VE EKİPMAN 3.1. Mikropipet, 5 mikrolitre 3.2. Platin krozeler 3.3. Standart balonlar 100 ml

6 3.4. Schleicher ve Schull 2043b veya eşdeğeri kromatografi kağıtları, yürütme tankında (A.3.5) yürütme solvanı (B.2.9) ile bir gece bekletilerek temizlenir ve kurutulur Oluklu filtre kağıdı 3.6. Genel kullanımlı kağıt kromatografi düzeneği 4. ÖRNEK HAZIRLAMA 4.1. Persülfat içermeyen ürünler gr örnek 50 ml su içinde dispers hale getirilir HCl (B.2.3) kullanılarak ph: 1 civarına ayarlanır Yukarıda dispers hale getirilmiş olun örnek 100 ml ölçülü bir balona transfer edilir. Su ile hacme tamamlanır ve karıştırılır. Bu dispersiyon bölüm 5 de anlatılan kağıt kromatografisinde ve sülfat halinde çöktürülerek baryum teşhisinde kullanılır Persülfat içeren ürünler için gr örnek 100 ml suda dispers hale getirilir ve süzülür Kurutulmuş bakiyenin ağırlığının 7-10 katı kadar sodyum karbonat (B.2.7) karıştırılır ve karışım platin krozede yarım saatte eritilir Eriyik oda sıcaklığına kadar soğutulur, 50 ml suda çözülür ve süzülür (B.3.5) Kalıntı HCl de (B.2.3) çözülür ve su ile 100 ml ye tamamlanır. Bu solüsyon bölüm 5 de anlatıldığı şekilde Kağıt Kromatografisinde ve sülfat halinde çöktürülerek baryum teşhisi yapmak üzere kullanılır. 5. METOD 5.1. Uygun miktarlarda yürütme solvanı (B.2.9) yürütme tankına konulur ve en az 15 saat doyurulur Bölüm (B.3.4) de bahsedilen şekilde işlem görmüş kağıda bölüm (B.4.1.2) ve bölüm (B.4.2.4) e göre hazırlanan solüsyonlardan ve referans solüsyon (B.2.8) dan 5 er µl uygulanır Kağıt havada kurutulur ve tanka konulduktan sonra 30 cm yürütülür Tanktan alınan kağıt havada kurutulur Kağıda (B.2.10) daki püskürtme reaktifi püskürtülür. Rf yaklaşık 0.10 da kırmızı noktalar halinde baryum teşhis edilir. C. HİDROJENPEROKSİT TAYİNİ

7 1. PRENSİP Hidrojen peroksidin iyodimetrik olarak tayini aşağıdaki reaksiyona dayanır. H 2 O 2 + 2H + +2Ι - Ι 2 +2H 2 O Bu reaksiyon yavaş ilerler ama amonyum molibdat eklenerek hızlandırılabilir. Meydana gelen iyot sodyumtiyosülfata karşı titrimetrik olarak tayin edilir ve hidrojen peroksit miktarı hesaplanır. 2. TANIM Aşağıda anlatılacağı şekilde tayin edilen H 2 O 2 miktarı yüzde kütle cinsinden (% m/m) ifade edilir. 3. REAKTİFLER Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalıdır N Sülfürik asit 3.2. Potasyum iyodür 3.3. Amonyum molibdat N Sodyum tiyosülfat 3.5. % 10 (m/v) potasyum iyodür solüsyonu kullanımdan hemen önce taze olarak hazırlanır % 20 (m/v) amonyum molibdat solüsyonu 3.7. % 1 (m/v) nişasta solüsyonu 4. DÜZENEK VE EKİPMAN ml lik beherler ml büret

8 ml lik ölçülü balonlar ve 100 ml lik mezürler ml lik bullu pipetler ml lik erlenler 5. METOD 5.1. Yaklaşık 0.6 gr Hidrojen peroksit ihtiva eden 10 gr örnek 100 ml lik behere tartılır, su ile 250 ml lik ölçülü balona aktırılır ve su ile hacme tamamlanarak karıştırılır Örnek çözeltisinden (5.1) 10 ml alınıp 250 ml lik erlene (4.6) konulur ve üzerine sırayla 100 ml 2N H 2 SO 4 (3.1), 20 ml potasyum iyodür solüsyonu (3.5) ve 3 damla amonyum molibdat solüsyona (3.6) ilave edilir Oluşan iyod hemen 0.1 N sodyum tiyosülfata karşı (3.4) titre edilir ve dönüm noktasına varmadan hemen önce birkaç damla nişasta indikatörü (3.7) ilave edilir. Harcanan 0.1N sodyum tiyosülfat (3.4) mililitre olarak kaydedilir (v) (5.2) ve (5.3) te anlatıldığı şekilde işlem 10 ml örnek çözeltisi yerine 10 ml su ile tekrarlanarak kör deney yapılır. 0.1N Na 2 S 2 O 4 sarfiyatı ml olarak kaydedilir (V o ml). 6. HESAPLAMA % kütle olarak H 2 O 2 miktarı (% m/m) aşağıdaki formülden hesaplanır: % H 2 O 2 = (V-V o ) x x 250 x 100 m x 10 x 1000 = (V-V o ) x m Burada: m = Analiz için tartılan örnek miktarı (5.1) gr olarak V o = Kör için harcanan 0.1 N sodyum tiyosülfat miktarı (5.4) V = Numune için harcanan 0.1 N sodyum tiyosülfat miktarı (5.3)

9 7. TEKRARLANABİLİRLİK (Norm ISO 5725) Yaklaşık % 6 (m/m) H 2 O 2 ihtiva eden ürünlerde paralel olarak çalışılan iki örnek sonucu arasındaki fark % 0.2 yi geçmemelidir. YÖNTEM II-SAÇ BOYALARINDAKİ BELİRLİ OKSİDASYON RENKLENDİRİCİLERİNİN TANIMLANMASI VE SEMİKANTİTATİF MİKTAR TAYİNİ 1. KAPSAM VE UYGULAMA ALANI Bu metod, krem veya likit formundaki saç boyalarında aşağıdaki maddelerinin tanıma veya semikantitatif tayinleri için uygundur. Maddeler Sembol Fenilendiaminler O-Fenilendiamin (OPD) m-fenilendiamin (MPD) P-Fenilendiamin (PPD) Metilfenilendiaminler 4-metil-1,2-fenilendiamin (toluen 3,4-diamin) (OTD) 4-metil-1,3-fenilendiamin (toluen-2,4-diamin) (MTD) 2-metil-1,4-fenilendiamin (toluen-2,5-diamin) (PTD) Diaminofenoller 2,4-diaminofenol (DAP) Hidrokinon 1,4 Benzendiol (H) α-naftol (α-n) Pirogallol 1,2,3 trihidroksibenzen (P) Rezorsinol 1,3-dihidroksibenzen (R)

10 2. PRENSİP Oksidasyon boyaları, ph 10 da % 96 lık etanol ile ekstre edilerek krem yada likit saç boyalarından ayrılır ve İnce Tabaka Kromatografi Yöntemiyle (bir veya 2 boyutlu) teşhis edilir. Bu maddelerin semikantitaf tayini, aynı zamanda ve mümkün olduğunca aynı şartlarda hazırlanmış örnek ve standartların dört ayrı yürütme solvanında gösterdikleri kromatogramlar karşılaştırılarak yapılır. 3. REAKTİFLER Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalıdır Etil alkol (susuz) 3.2. Aseton 3.3. Etil alkol % 96 v/v 3.4. Amonyak solüsyonu % 25 (d 4 20 = 0.91) 3.5. L (+) Askorbik asit 3.6. Kloroform 3.7. Siklohekzan 3.8. Azot, teknik saflıkta 3.9. Toluen Benzen n-butanol butan-2-ol

11 3.13. Hidrofosforus asit %50 v/v solüsyonu Diazo reaktifi: Aşağıdakilerden biri olabilir. 3-Nitro-1-benzendiazonyumklorobenzensülfonat, (stabilize tuz şekli) (Red 2JN-Francolor) gibi 2-Kloro-4 nitro-1-benzendiazonyumnaftalenbenzoat, (stabilize tuz formunda) (NNCD Reaktifi-referans no: Fluka) gibi veya eşdeğeri Gümüş nitrat p-dimetilamino benzealdehit ,5 Dimetilfenol Ferri klorür hekzahidrat Hidroklorik asit çözeltisi % 10 m/v Referans maddeler Referans maddeler paragraf 1 de amaç ve uygulama alanı bölümünde gösterilenlerdir. Amin bileşikleri söz konusu olduğunda referans madde ya hidroklorürü (mono veya di), yada serbest bazı olmalıdır Referans Solüsyonlar % 0.5 (m/v) Bölüm (3.20) de belirtilen referans maddelerin her birinin % 0.5 m/v solüsyonları hazırlanır. 50 mg ± 1 mg referans madde 10 ml lik ölçülü balona tartılır. Üzerine 5 ml % 96 lık etanol (3.3) ve 250 mg askorbikasit (3.5) ilave edilir. Bu solüsyon, amonyak solüsyonu (3.4) ilave edilerek alkali yapılır ve indikatör kağıdı ile kontrol edilerek ph: 10 a ayarlanır. % 96 etanol (3.3) ile 10 ml ye tamamlanır ve karıştırılır.

12 Solüsyon 1 hafta süreyle aydınlık olmayan serin bir yerde muhafaza edilebilir. Bazı durumlarda, askorbik asit ve amonyak ilavesinden sonra, bir çökelti olabilir. Bu durumda işleme başlamadan önce çökmesi için bekletilmelidir Yürütme solvanları Aseton-Kloroform-Toluen (35:25:40,v/v/v) Kloroform-Siklohekzan-mutlak alkol-% 25 amonyak (80:10:10:1, v/v/v/v) Benzen-butan-2-ol-su (50:25:25, v/v/v) Bu karışım iyice çalkalanır ve oda sıcaklığında (20-25 o C) üst faz ayrıldıktan sonra üst faz kullanılır n-butanol-kloroform-reaktif M (7:70:23, v/v/v) Oda sıcaklığında (20-25 o C) dikkatlice ayrılarak alt faz kullanılır. Reaktif M in hazırlanışı: Amonyak solüsyonu % 25 (v/v) 24 hacim Hipofosforus asit % 50 (3.13) 1 hacim Su 75 hacim NOT: Amonyak ihtiva eden yürütme solvanları kullanılmadan hemen önce iyice çalkalanmalıdır İndikatör spreyler (püskürtme solvanı) Diazo Reaktifi (3.14) de seçilen reaktiften % 5 (m/v) sulu çözelti hazırlanır. Bu çözelti kullanılmadan hemen önce taze hazırlanmalıdır.

13 Ehrlich Reaktifi p-dimetilaminobenzaldehitden (3.16) 2 gr alınır ve % 10 HCl (3.19) çözeltisinin 100 ml sinde çözülür dimetilfenol-ferri klorürhekzahidrat Solüsyon 1: 1 gr dimetilfenol (3.17) 100 ml % 96 lık etanol (3.3) de çözülür. Solüsyon 2: 4 gr ferriklorürhekzahidrat (3.18), 100 ml % 96 etanol (3.3) de çözülür Amonyaklı gümüş nitrat % 25 amonyak (3.4), % 5 (m/v) sulu gümüş nitrat (3.15) a çökeltinin çözünmeye başlaması gözlenene kadar ilave edilir. Bu reaktif kullanılmadan hemen önce hazırlanır. Saklanmaz. 4. DÜZENEK 4.1. İnce Tabaka Kromatografisi için gerekli laboratuar düzenekleri Plastik veya cam kaplamalar, kromatografik plak damlatılma ve kuruma esnasında azotla çevrilmiş olacak şekilde yerleştirilir. Belirli renklerin kolay okside olmaları nedeniyle bu önlemin alınması gerekir İğne ucu kare kesilmiş 0,2 µl derecelendirilmiş 10 µl lik mikro şırınga ve plağı azot altında tutacak şekilde kıskaçla tutturulmuş 50 µl lik dağıtıcı Silikagel ince tabaka plakları, kullanıma hazır 0.25 mm kalınlığında 20 x 20 cm ebadında (Macherey and Nagel, Silica G-HR plastik tutucu üzerinde veya eşdeğeri) 4.2. Santrifüj, 4000 devir/dakika 4.3. Santrifüj tüpleri, 10 ml teflon kapaklı veya eşdeğeri 5. İŞLEM 5.1. Test örneği hazırlama yöntemi Tüpten ilk çıkan 2 veya 3 cm.lik krem atılır.

14 Önceden azotla temizlenmiş bir santrifüj tüpüne (4.3) 300 mg askorbik asit, 3 gr krem veya 3 gr homojenize edilmiş likit koyulur. Üzerine ph 10 oluncaya kadar % 25 lik Amonyak çözeltisi (3.4) damla, damla ilave edilir ve % 96 lık (3.3) etanol ile 10 ml ye tamamlanır. Azot altında (3.8) homojenize edilip, ağzı kapatılır ve 4000 devir/dakika da 10 dakika santrifüjlenir. Üstteki likit faz kullanılır Kromatografi Plak damlatma Azot (3.8) atmosferi altında kromatografi plağına (4.1.3) yukarıda tarif edilen referans solsüyonlardan 9 nokta halinde birer µl damlatılır. Damlalar birbiri arası 1,5 cm olacak şekilde ve plağın kenarlarından da 1,5 cm kalacak şekilde damlatılmalıdır. Referans solüsyon noktaları aşağıdaki gibi düzenlenir: R P H PPD DAP PTD OPD OTD MPD MTD α-n Buna ilaveten 10 ve 11. noktalara 2 µl lik (5.1) deki bölümdeki örnek test çözeltilerinden damlatılır. Yürütmeye koymadan önce plak azot atmosferi altında tutulmalıdır Yürütme Tank önceden azot (3.8) ile temizlenip, (3.22) deki 4 solvan sisteminden biri ile doyurulur ve plak, oda sıcaklığında o C de karanlıkta, tabandan 15 cm yükselinceye kadar yürütülür. Plak çıkartılıp, oda sıcaklığında azot (3.8) ile kurutulur.

15 Püskürtme 4 solüsyondan bir tanesi (3.23) derhal plak üzerine püskürtülür Tanımlama Örnek ve referansın Rf seviyeleri ve renkleri mukayese edilir. Tablo 1 de değişik solvan sistemleri ve indikatörlere bağlı olarak maddelerin Rf değerleri ve renkleri verilmektedir. Herhangi bir kararsızlık durumunda ise deney, yeterli miktar referansın örnek ekstraktına ilave edilmesiyle tekrarlanarak çözüme ulaşılabilir Yarı Kantitatif Tayin Yakın konsantrasyonlarda damlatılmış örnek ve referansın lekelerinin renk şiddetleri gözle karşılaştırılır. Eğer bir veya daha fazla madde (örnekte bulunan) konsantrasyonu aşırı görülürse; örnek ekstraktı dilüe edilerek ölçüm tekrarlanır. TABLO I Spreylemeden hemen sonra oluşan renkler ve Rf değerleri Yürütme solvanı Püskürtme spreyi Referans Rf değerleri Sonuçta oluşan renkler Maddeler (3.22.1) (3.22.2) (3.22.3) (3.22.4) Diazo Ehrlich Dimethyl- AgNO (3.23.1) (3.23.2) Fenol (3.23.4) (3.23.3) OPD uçuk kahve uçuk kahve MPD mor kahve sarı uçuk uçuk (*) kahve kahve PPD kahve parlak mor gri

16 kırmızı(*) OTD kahve (*) uçuk turuncu uçuk kahve grimsi kahve MTD kırmızımsı kahve(*) sarı kahve siyah PTD kahve turuncu mor(*) gri DAP kahve(*) turuncu mor kahve H turuncu mor siyah(*) α-n turuncukahve P kahve çok uçuk mor --- mor(*) siyah çok uçuk kahve kahve(*) R turuncu (*) uçuk mor çok uçuk kahve uçuk kahve NOT: 1. OPD sadece zayıf bir şekilde görülür. OPD yi OTD den net bir şekilde ayırabilmek için çözücü (3.22.3) kullanılmalıdır. 2. (*): Oluşan en iyi rengi gösterir. 6. İKİ BOYUTLU İNCE TABAKA KROMATOGRAFİSİ İLE İNCELEME Bu iki boyutlu kromatografi işlemi, ek standartların ve ayraçların kullanılmasını gerektirir Ek referans çözeltiler ve maddeler β-naftol (β-n) aminofenol (OAP) aminofenol (MAP) aminofenol (PAP) nitro-1,4-fenilendiamin (2-NPPD) nitro-1,2-fenilendiamin (4-NOPD) Ek referans çözeltilerinin her birinden, de anlatıldığı şekilde % 0.5 lik (m/v) çözeltisi hazırlanır.

17 6.2. Ek yürütme solvanı Etil asetat-siklohekzan-% 25 lik amonyak (65:30:05, v/v/v) 6.3. Ek belirleme sistemi İnce Tabaka Kromatografisi için, yürütme tankının içine küçük bir beherde 2 gr kadar kristalize iyot konur ve tankın kapağı kapatılır Kromatografi İnce tabaka plağını (4.1.3) kaplanmış yüzeyine, şekil 1 de gösterildiği gibi iki çizgi çizilir Bir azot atmosferi altında (4.1.1) ekstrakt (5.1), taban noktasına 1-4 µl damlatılır (Şekil 1), 2 kenardan da 2 cm uzaklıkta olmalıdır. Kromatogramlardaki (5.2) lekelerin yoğunluğu çözeltinin konsantrasyonuna bağlıdır Şekil 1 deki gibi 5.2 de tamamlanan noktalar arasındaki boşluk 1.5 cm olmalıdır. Referans çözeltilerinden her birinden 6 mikrolitre uygulanması gereken DAP hariç 2 mikrolitre uygulanır. Tüm işlem azot altında yürütülür (6.4.2) deki işlemi 4 ve 5 için tekrarlayın (Şekil 1) ve Kromatografi başlayıncaya kadar plak azot altında tutulur. (Noktalar arasındaki aralık 1.5 cm olmalıdır.) Bir kromatografi tankı azotla yıkanır ve içine uygun bir miktar yürütme solvanı konur, plak (6.4.4) tanka yerleştirilir ve karanlıkta ilk elüsyon yönünde yürütülür (şekil 1). Yürütme solvanı plaktaki işaretli çizgiye ulaşıncaya kadar devam edilir. (Yaklaşık 13 cm) Plak tanktan çıkartılır, solvanını uçurmak için önceden en az 60 dakika boyunca azotla yıkanmış olan kromatografi tankına konulur Azotla yıkanmış tanka uygun bir miktar yürütme solvanı konur. Plak 90 o çevrilerek tanka yerleştirilir (karanlıkta). Çizgiye kadar ikinci yönde yürütülür, tanktan çıkarılır ve havada kurutulur Plak 10 dakika iyot buharlı kromatografi tankına tutulur (6.3) ve aynı anda kromatografiye tabi tutulan referans maddelerinin Rf değerlerinden ve renklerinden yararlanarak iki-yollu kromatogram yorumları yapılır (Tablo II, Rf değerleri ve renk rehberini vermektedir).

18 NOT: Noktaların maksimum renklenmesini sağlamak için, yürütme bittikten sonra plak yarım saat boyunca havada kurutulur de bulunan oksidasyon renklendiricilerinin varlığı, den e kadar olan basamaklarda anlatılan işlemler tekrarlanarak ve de belirlenen örnek miktarı üzerine, de belirlenen referans maddesinden 1 mikrolitre, taban noktası 1 e eklenerek kesin olarak doğrulanabilir de elde edilen kromatogramla karşılaştırıldığında farklı hiçbir başka nokta bulunmazsa kromatogram in yorumu doğrudur. TABLO II Kromatografi sonrası iyot buharı ile saptanan referans maddelerin renkleri Referans maddeler İyot buharı ile saptanan renkler R p α-n β-n H MPD PPD MTD PTD DAP OAP MAP PAP 2-NPPD 4-NOPD Bej Kahverengi Mor Uçuk kahve Mor-kahve Sarımsı kahve Mor-kahve Koyu kahve Sarımsı kahve Koyu kahve Turuncu Sarımsı kahve Mor-kahve Kahverengi Turuncu

19 III- NİTRİT TANI VE TAYİNİ B- TANIMLAMA 1. KAPSAM VE UYGULAMA ALANI Bu metod, kozmetik ürünlerde, özellikle krem ve macunlardaki nitritin tanımlanması için uygundur. 2. PRENSİP Nitritin varlığı, 2-aminobenzaldehidfenilhidrazon (Nitrin ) ile renkli türevlerinin oluşmasıyla saptanır.

20 3. REAKTİFLER Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalıdır Seyreltik sülfürik asit: 2 ml konsantre sülfürik asit (d 4 20 =1.19) 11 ml saf su ile seyreltilir Seyreltik hidroklorik asit: 1 ml konsantre hidroklorik asit (d 4 20 =1.19) 11 ml saf su ile seyreltilir Metanol 3.4. Menatol içinde 2-amino benzaldehid fenilhidrazon (nitrin reaktifi) solüsyonu 2 gr Nitrin tartılır. 100 ml.lik ölçülü balona aktarılır, 4 ml seyreltilmiş hidroklorik asit (3.2) damla damla eklenir ve çalkalanır, hacme kadar metanolle tamamlanır ve çözelti tamamen berrak oluncaya kadar karıştırılır. Çözelti kahverengi bir cam şişede saklanır (4.3). 4. EKİPMAN 4.1. Beherler, 50 ml 4.2. Ölçülü balon, 100 ml 4.3. Kahverengi cam şişe, 125 ml 4.4. Cam plak 10x10 cm 4.5. Plastik spatul 4.6. Filtre kağıdı, 10x10 cm 5. İŞLEM 5.1. İncelenecek örneğin bir kısmı cam plak (4.4) üzerine, 1 cm den daha fazla olmayacak bir kalınlıkta yüzeyi kaplayacak şekilde eşit olarak yayılır Filtre kağıdı (4.6) saf suya batırılır. Örneğin üzerine yayılır ve plastik bir spatül (4.5) ile aşağıya doğru bastırılır.

21 5.3. Bir dakika kadar beklenir ve filtre kağıdının ortasına aşağıdakiler uygulanır: 2 damla seyreltilmiş sülfürik asit (3.1) damlatılır. Bunun ardından da 2 damla Nitrin çözeltisi (3.4) damlatılır Beş, on dakika sonra, filtre kağıdı çıkartılır ve gün ışığına karşı incelenir, Nitritin varlığı kırmızımsı mor bir renklenmeyle belli olur. Nitrit içeriği azsa, kırmızımsı mor renk, beş on saniye sonra sarıya dönüşür. (Eğer nitrit miktarı çok fazlaysa bu renk değişimi sadece 1-2 dakika içinde oluşur.) 6. YORUM Kırmızımsı mor rengin yoğunluğu ve sarı renge dönüşmeden önce geçen zaman numunedeki nitrit miktarının bir göstergesi olabilir. B- TAYİN 1. AMAÇ Bu metod kozmetik ürünlerde nitrit tayini içindir. 2. TANIM Bu metod uyarınca saptanan sodyum nitrit miktarı % kütle cinsinden ifade edilir. 3. PRENSİP Numune suyla seyreltilip berraklaştırıldıktan sonra, mevcut olan nitrit, sülfanilamid ve N-1-Naftiletilendiamin ile reaksiyona sokulur ve elde edilen rengin optik yoğunluğu 538 nm de ölçülür. 4. REAKTİFLER Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalıdır Berraklaştırma Reaktifleri

22 Bu reaktifler hazırlandıktan sonra 1 haftadan daha uzun süre kullanılamazlar Carrez Ι Reaktifi 106 gr potasyum ferrosiyanat (ΙΙ) K 4 Fe(CN) 6.3H 2 O saf suda çözülür ve distile su ile 1000 ml ye tamamlanır Carrez ΙΙ Reaktifi gr çinko asetat, Zn(CH 3 COO) 2.2H 2 O ve 30 ml glasial asetik asit saf suda çözülür ve saf su ile 1000 ml ye tamamlanır Sodyum Nitrit Solüsyonu 1000 ml lik ölçülü balon içinde 0.5 gr sodyum nitrit saf suda çözülür ve saf su ile hacme tamamlanır. Bu stok standart çözeltinin 10 ml si 500 ml ye seyreltilir. İkinci çözeltinin 1 ml si 10 mikrogram NaNO 2 içerir N Sodyum hidroksid çözeltisi 4.4. % 0.2 Sülfanilamide hidroklorür çözeltisi: 2 gr sülfanilamid ısıtılarak 800 ml suda çözülür, soğutulur ve karıştırılarak 100 ml konsantre hidroklorik asit ilave edilir, su ile 1000 ml ye tamamlanır N Hidroklorik asit 4.6. N-1-naftil reaktifi Bu çözelti kullanılacağı gün hazırlanmalıdır. 0.1 gr N-1-naftiletilendiamin dihidroklorür suda çözülür ve su ile 100 ml ye tamamlanır. 5. EKİPMAN 5.1. Analitik terazi 5.2. Volumetrik kaplar, 100, 250, 500 ve 1000 ml.lik

23 5.3. Bullu veya dereceli pipetler 5.4. Mezürler, 100 ml lik 5.5. Nitrit içermeyen oluklu filtre kağıdı 15 cm çapta 5.6. Su banyosu 5.7. Spektrofotometre (1 cm.lik küvetli) 5.8. PH metre 5.9. Mikrobüret, 10 ml.lik Beherler, 250 ml.lik 6. İŞLEM 6.1. Homojenize edilmiş numuneden 0.1 mg doğrulukta 0.5 gr kadar tartılır. Sıcak saf su ile birlikte 250 ml.lik bir behere aktarılır. Saf su ile hacim yaklaşık 150 ml.ye getirilir, yarım saat süresince 80 o C lik su banyosunda tutulur. Bu süre boyunca içerik arada bir karıştırılır Oda ısısında soğutulur ve karıştırılırken sırasıyla 2 ml Karez I (4.1.1) reaktifi ve 2 ml Karez II (4.1.2) reaktifi eklenir PH ı 8.3 e getirmek için 1 N Sodyum hidroksit (4.3) çözeltisi eklenir (PH metre (5.8) kullanılır). İçerik 250 ml lik bir dereceli kaba (5.2) aktarılır ve işaret çizgisine kadar saf su ile tamamlanır İçeriği karıştırın ve oluklu filtre kağıdında süzün (5.5) ml den fazla olmayacak şekilde, berrak süzüntüden uygun bir miktar (V ml) 100 ml lik bir erlen (5.2) içine pipetlenir (5.3) ve 60 ml.ye tamamlayıncaya kadar distile su ilave edilir Karıştırdıktan sonra 10 ml sülfanilamid hidroklorür solsüyonu (4.4) ilave edilir, sonra 6 ml 5 N hidroklorik asit eklenir (4.5). Karıştırılır ve 5 dakika bekletilir. 2 ml N-1 naftil reaktifi (4.6) eklenir, karıştırılır, 3 dakika bekletilir. Su ile hacime tamamlanır ve karıştırılır.

24 ve 6.6 işlemleri tekrarlanarak N-1 naftil reaktifi (4.6) eklemeden bir kör deney yapılır Kör deney çözeltisini (6.7) referans olarak kullanarak (6.6) da elde edilen çözeltinin optik yoğunluğu 538 nanometrede ölçülür (5.7) Çözeltinin, 6.8 de ölçülen optik yoğunluğuna karşılık gelen sodyum nitrit içeriği 100 ml de mikrogram cinsinden kalibrasyon grafiğinden (6.10) okunur (m 1 mikrogram) µg/ml lik sodyum nitrit çözeltisini kullanarak (4.2), 100 ml de 0, 20, 40, 60, 80, 100 mikrogram sodyum nitrit konsantrasyonları için bir kalibrasyon grafiği hazırlanır. 7. HESAPLAMA Aşağıdaki formül yardımıyla sodyum nitrit içeriği, yüzde kütle cinsinden hesaplanır: % NaNO 2 = 250 x m 1 x 10-6 x 100 = m 1 V m V x m x 40 m : Analiz için alınan örneğin gram cinsinden kütlesi m 1 : 6.9 daki sodyum nitrit içeriğinin mikrogram cinsinden ifadesi V : Ölçümde (6.5) kullanılan süzüntünün mililitre cinsinden ifadesi 8. TEKRARLANABİLİRLİK (Norm ISO 5725) Yaklaşık % 0.2 m/m sodyum nitrit içeriği için, aynı örnekte yürütülen iki paralel çalışmanın sonuçları arasındaki fark % i aşmamalıdır. YÖNTEM IV. SERBEST FORMALDEHİT TANI VE TAYİNİ

25 1. KAPSAM VE UYGULAMA ALANI Bu metot formaldehitin varlığına veya formaldehit vericilerinin yokluğuna bağlı olarak iki tayin ve tanınmayı açıklar. Bütün kozmetik ürünlere uygulanır Tanınma 1.2. Pentan 2,4-dion ile kolorimetrik tayini Bu metod formaldehit tek başına ise veya formaldehit vermeyen diğer koruyucular ile birlikte iken uygulanır. Eğer durum böyle değil ise ve sonuçlar izin verilen maksimum konsantrasyonu aşıyorsa, aşağıdaki metod kullanılmalıdır Formaldehit vericilerinin varlığında tayin Yukarıdaki bahsedilen metotta (1.2) türevlendirme işlemi sırasında formaldehit vericileri ayrılır ve yüksek sonuçlara sebebiyet verirler. (Kombine ve polimerize formaldehit) Serbest formaldehiti likit kromatografiyle ayırmak gerekir. 2. TANIM Bu metoda göre numunedeki serbest formaldehit miktarı yüzde kütle olarak verilir. 3. TANIMLAMA 3.1. Prensip Sülfürik asit ortamında serbest ve bağlı formaldehit schiff s reaktifini pembe veya pembeye bakan leylak rengine dönüştürür Reaktifler Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalı ve suda demineralize olmalıdır Fuksin

26 Sodyum sülfit 7H 2 O Konsantre hidroklorik asid (d= 1.19) Sülfürik asit yaklaşık 1 M Schiff reaktifi 100 mg füksin (3.2.1) bir behere tartılır, 75 ml 80 o C de suda çözülür, soğuduktan sonra 2.5 gr sodyum sülfit (3.2.2) ilave edilir 100 ml ye tamamlanır. Bu çözelti iki hafta içinde kullanılmalıdır İşlem ml.lik bir behere 2 gr örnek tartılır damla sülfürik asit (3.2.4) ve 2 ml schiff reaktifi (3.2.5) ilave edilir. Bu reaktif kullanıldığında tamamen renksiz olmalıdır. Çalkalanır ve 5 dakika bekletilir dakika içinde pembe veya pembemsi mor renk görülürse, formaldehit % 0.01 fazlalıkla mevcut anlamındadır ve bu formaldehit serbest ve bağlı metod (4) ile ve eğer gerekirse prosedür (5) ile tayin edilir. 4. PENTANE-2,4 DIONE İLE GENEL KOLORİMETRİK TAYİNİ 4.1. Prensip Formaldehit, amonyum asetat varlığında pentane 2,4 dione ile reaksiyona girer ve 3,5 diasetil-1,4 dihidrolutidin oluşturur. Bu butan-1-ol ile ekstre edilir ve 410 nm de ekstraktın absorbansı ölçülür Reaktifler Kullanılan tüm reaktifler analitik saflıkta olmalı ve suda demineralize olmalıdır Susuz amonyum asetat Konsantre asetik asit d 4 20 = Vakum altında (25 mm Hg 25 o C) taze distillenmiş Pentan-2,4-dion

27 (410 nm de herhangi bir apsorbsiyon vermemelidir.) Butan-1-ol Hidroklorik asit 1 M Hidrklorik asit yaklaşık 0,1 M Sodyum Hidroksid 1M Avrupa Farmakopesine (2. baskı 1980 kısım-i-vii-i-i) göre taze hazırlanmış nişasta çözeltisi (1 gr/50 ml suda) % 37-% 40 w/v formaldehit Standart iyot solüsyonu 0,05M Standart sodyum tiyosülfat solüsyonu 0,1 M Pentan 2,4dion reaktifi: 1000 ml.lik bir ölçülü balona 150 mg amonyum asetat (4.2.1) 2 ml pentan-2,4 dion (4.2.3), 3 ml asetik asit (4.2.2) konulur. Su ile 1000 ml ye tamamlanır. (PH sı yaklaşık 6.4) Bu reaktif taze hazırlanmalıdır Pentan-2,4-dion içermeyen reaktif (4.2.12) Formaldehit Standardı: stok solüsyonu 5 gr formaldehit (4.2.9) 1000ml.lik bir ölçülü balonda 1000 ml su ile tamamlanır.

28 Solüsyon aşağıdaki şekilde ayarlanır. 10 ml alınır, üzerine 25 ml standart iyot solüsyonu (4.2.10) ve 10 ml sodyum hidroksit solüsyonu (4.2.7) eklenir. 5 dakika bekletilir. 11 ml hidroklorik asit (4.2.5) eklenerek asidik ortam sağlanır. İndikatör olarak nişasta solüsyonu (4.2.8) kullanarak standart sodyum tiyosülfat solüsyonu ile iyot fazlası tayin edilir. 1 ml 0.05 M iyot (4.2.10) 1,5 mg formaldehite ekivalandır Formaldehit Standardı: seyreltik solüsyon Formaldehit stok solüsyonu önce 1/20 su ile sonra 1/100 su ile seyreltilir. Bu solüsyonun 1 ml.si 1 µg formaldehit içerir. Kesin miktar hesaplanır Ekipman Standart laboratuar aletleri Faz ayırma filtresi, whatman 1PS (yada eşdeğeri) Santrifüj o C ye ayarlanmış su banyosu Spektrofotometre cm.lik cam küvetler 4.4. İşlem Örnek Solüsyon

29 150 µg formaldehite karşı gelen test örneği tartılır, 0,001 gr hassasiyetle ve 100 ml lik ölçülü balona aktarılır. 100 ml su ile tamamlanır ve karıştırılır (Solüsyon S). (PH kontrol edilir, yaklaşık 6 olmalıdır. Değilse hidroklorik asit solüsyonu ile seyreltilir. (4.2.6)) 50 ml lik erlen içine - 10 ml solüsyon S - 5 ml pentan-2,4 dion reaktifi (4.2.12) eklenir ml ye su ile tamamlanır Referans Solüsyon Oluşabilecek renk etkileşmesi, referans solüsyon kullanılarak elimine edilir. 50 ml lik erlen içerisine - 10 ml solüsyon S ml reaktif (4.2.13) eklenir - 30 ml ye su ile tamamlanır Kör Test 50 ml lik erlen içerisine - 5 ml pentan-2,4 dion reaktifi (4.2.12) eklenir ml ye su ile tamamlanır Tayin

30 , 4.4.2, karışımları çalkalanır, erlenler 60 o C de su banyosunda tam 10 dakika bekletilir, buzlu su banyosunda 2 dakika soğutulur ml butan-1-ol (4.2.4) içeren 50 ml lik ayırma hunilerine transfer edilir. (Erlenler 3-5 ml su ile yıkanır.) 30 sn kadar şiddetlice çalkalandıktan sonra fazların ayrılması beklenir Butan-1-ol fazları ayırma hunilerinden süzgeç kağıdı yardımıyla ölçüm cam küvetine süzülür (4.3.2), gerekirse 5 dakika 3000 g santirfüj edilirler den örnek solüsyonun ekstraktı referans solüsyonunun ekstraktına karşı apsorbansı (A 1 ) 410 nm de ölçülür Benzer şekilde kör solüsyonun ekstraktının (4.4.3) butan-1-ol e karşı apsorbansı (A 2 ) ölçülür. NOT: Bütün bu işlemler, erlenler 60 o C deki su banyosuna yerleştirildiği andan itibaren 25 dakika içinde tamamlanmalıdır Kalibrasyon eğrisi ml lik bir elen içerisine: - 5 ml seyreltik standart solüsyon (4.2.15) - 5 ml pentan-2,4-dion reaktifi (4.2.12) - Demineralize su ile 30 ml ye tamamlanır de tarif edildiği gibi devam edilir ve butan-1-ol e karşı (4.2.4) absorbans ölçülür Aynı işlemi 10, 15, 20 ve 25 ml seyreltik standart solüsyon (4.2.15) ile tekrar edilir Reaktiflerin renklenmesine karşı gelen sıfır değerini elde etmek için uygulanır ve den elde edilen absorbanslardan sıfır değer çıkartıldıktan sonra kalibrasyon eğrisi çizilir. Beer kanunu 30 µg formaldehite kadar geçerlidir Hesaplamalar

31 A 2, A 1 den çıkartılır ve kalibrasyon eğrisinden ( ) numunedeki (4.4.1) formaldehit miktarı (C), µg olarak okunur Aşağıdaki formül yardımıyla örneğin formaldehit miktarı (% m/m) hesaplanır: C formaldehit miktarı % = 10 3.m Burada: m= test edilen örneğin ağırlığı (gr) 4.6. Tekrarlanabilirlik (Norm ISO 5725.) % 0.2 lik formaldehit miktarı için, aynı örnek ile paralel çalışılarak (pentan-2,4- dion kolorimetrik tayini) bulunan iki deney sonuçları arasında fark % i geçmemelidir. Eğer serbest formaldehitin test sonuçları, Kozmetik Yönetmeliğinde bildirilen maksimum konsantrasyondan daha büyükse; a) % 0.05 ve% 0.2 arasında etiketsiz ürününde b) % 0.2 den büyükse etiketli veya etiketsiz üründe 5 de tanımlanan prosedür uygulanmalıdır. 5. FORMALDEHİT VERİCİLERİNİN VARLIĞINDA TAYİN 5.1. Prensip Ayrılmış formaldehit bir post-kolon reaktörde pentane-2,4-dione ile reaksiyona sokularak sarı lutidinic türevi oluşturulur. Elde edilen bu türev 420 nm de saptanır Reaktifler Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalı ve suda demineralize olmalıdır.

32 HPLC veya eşdeğer kalitede su Susuz amonyum asetat Konsantre asetik asit Pentan-2.4-dion (4 o C da tutulan) Susuz disodyum fosfat Ortofosforik asid % 85 (d= 1,7) HPLC kalitede metanol Diklorometan Formaldehit % 37-% 40 w/v M sodyum hidroksit M hidroklorik asit ,002M hidroklorik asit Avrupa Farmakopesine göre taze hazırlanmış nişasta solüsyonu (4.2.8) M standart iyot solüsyonu ,1M standart sodyum tiyosülfat solüsyonu Mobil Faz 0.006M disodyum fosfat sudaki solüsyonu, ph 2.1 e ortofosforik asit ile (5.2.6) ayarlanır Post kolon reaktifi ml.lik ölçülü balon içerisine gr amonyum asetat (5.2.2)

33 - 7.5 ml asetik asit (5.2.3) - 5 ml pentan-2.4-dion (5.2.4) Su (5.2.1) ile 1000 ml ye tamamlanır: Bu reaktif karanlık yerde saklanır. Saklama zamanı: 25 o C de maksimum 3 gün. Renginde bir değişme gözlenmemelidir Formaldehit standardı: stok solüsyonu 10 gr formaldehit 1000 ml likölçülü balona tartılır ve su ile hacme tamamlanır. Solüsyon aşağıdaki şekilde ayarlanır: Bu solüsyondan 5 ml alınır, üzerine 25 ml standart iyot solüsyonundan (5.2.14) ve 10 ml de sodyum hidroksit solüsyonundan (5.2.10) ilave edilir. 5 dakika dinlenmeye bırakılır. 11 ml hidroklorik asit ile (5.2.11) asitlendirilir, nişasta (5.2.3) indikatörü kullanılarak iyot fazlası standart tiyosülfat solsüyonu ile titre (5.2.15) edilir. 1 ml iyot solüsyonu (5.2.14), 1,5 mg formaldehide ekivalandır Formaldehit standardı: seyreltik solüsyon Stok solüsyon 1/100 oranında mobil faz (5.2.16) ile seyreltilir. Bu solüsyonun 1 ml.si yaklaşık 37 mg formaldehit içerir. Tam miktarı hesaplanır Ekipman

34 Standart laboratuar ekipmanları HPLC pompa, vuruntusuz Reaktif için düşük basınçlı vuruntusuz pompa (veya 2. bir HPLC pompası) µl lup lu enjeksiyon valfi Aşağıdaki parçalarla beraber Post-kolon reaktörü + 1 adet 1 litrelik 3 boyunlu balon + 1 adet 1 litrelik balon ısıtıcısı + 2 adet min. 10 plakalı vigreux kolonu, 2 hava soğutuculu + Paslanmaz çelik tüp (ısı transferi için) 1.6 mm-iç çap 0.23 mm, uzunluk 400 mm mm teflon tüp-iç çapı 0.3 mm, uzunluğu 5 m (Fransız örgüsü) (EK 1 e bakınız.) + 1 adet ölü hacimsiz T borusu (Valco veya eşdeğeri) + Ölü hacimsiz üç birleşme veya: 1 ml reaktörlü 1 adet post-kolon modülü. Applied Biosystems PCRS 520 veya eşdeğeri Membran filtre, 0.45 µm SEP-PAK R C 18 kartuş veya eşdeğer Kullanıma hazır kolonlar: Bischoff hypersil RP 18 (type NC referans C ). ( 5 µm, uzunluk: 250 mm, iç çap: 4.6 mm) veya Dupont, Sorbax ODS

35 (5 µm, uzunluk: 250 mm, iç çap: 4.6 mm) veya Phase SEP, spherisorb ODS 2 (5 µm, uzunluk: 250 mm, iç çap: 4.6 mm) Pre-kolon Bischoff K 1 hypersil RP 18 (referans K1G ) (5 µm, uzunluk: 10 mm veya eşdeğeri) Kolon ve prekolon Ecotube sistemi, vasıtasıyla birleştirilmiştir. (Referans A Bischoff) veya eşdeğeri Ek 2 deki blok diyagramda gösterildiği şekilde (5.3.5) düzenek kurulur. Enjeksiyon sonrası bağlantılar mümkün olduğu kadar kısa olmalıdır. Bu durumda reaktör çıkışı ile dedektör girişi arasındaki paslanmaz çelik tüp, dedeksiyon öncesi karışımın soğuması içindir. Dedektör içindeki sıcaklık bilinmez, fakat sabittir UV-VIS dedektör Kaydedici Santrifüj Ultrasonik banyo Titreşimli karıştırıcı (vortex veya eşdeğeri) 5.4. İşlem Kalibrasyon Eğrisi Kalibrasyon eğrisi, formaldehit seyreltik standardının oluşturduğu pik yüksekliklerinin konsantrasyona karşı oluşturulan eğrisidir. Formaldehit referans solüsyonu (5.2.19) mobil faz (5.2.16) ile seyreltilerek aşağıdaki standart solüsyonlar elde edilir.

36 ml (5.2.19) çözeltisi 20 ml ye seyreltilir. (Yaklaşık 185 µg/100 ml) ml (5.2.19) çözeltisi, 20 ml ye seyreltilir (Yaklaşık 370 µm/100 ml) ml (5.2.19) çözeltisi, 25 ml ye seyreltilir. (Yaklaşık 740 µg/100 ml) ml (5.2.19) çözeltisi, 20 ml ye seyreltilir. (Yaklaşık 925 µg/100 ml) Standart çözeltiler yaklaşık 1 saat laboratuar sıcaklığında tutulmalı ve taze hazırlanmalıdır. Kalibrasyon eğrisinin linearitesi 1.00 ile µg/ml arasındaki konsantrasyonlar için iyidir Örneklerin Hazırlanması Emülsiyonlar (kremler, make up base, eye liner) 100 ml lik kapaklı erlene gr hassasiyetle 100 µg formaldehit içerdiği düşünülen miktarda örnek (mg) tartılır. 20 ml diklormetan (5.2.8) ve 20 ml HC (5.2.12) tam olarak ilave edilir. Ultrasonik banyoda karıştırılır (5.3.15). Santrifüjle 2 faz ayrıştırılır (3000 g iki dakika). Bu arada bir kartuş (5.3.7) 2 ml metanol ile (5.2.7) yıkanır ve 5 ml su ile (5.2.1) şartlandırılır. Ekstraktın sulu fazının 4 ml si bu kartuştan geçirilir ilk 2 ml si atılır, geri kalan süzüntü kullanılır Losyon ve Şampuanlar 100 ml lik kapaklı ölçülü balona gr hassasiyetle 500 µg formaldehit içerdiği düşünülen miktardaki örnek (mg) tartılır. Mobil fazla (5.2.16) ile hacme tamamlanır. Solüsyon bir filtre (5.3.6) yardımıyla süzülür ve daha önceki gibi ( ) şartlandırılmış kartuştan (5.3.7) geçirilir. Tüm solüsyonlar hazırlandıktan sonra hemen enjekte edilmelidir Kromatografik şartlar

37 - Mobil faz, akış hızı: 1 ml/dak. - Reaktif, akış hızı: 0.5 ml/dak. - Dedektör çıkışı toplam akış: 1.5 ml/dak. - Enjeksiyon hacmi: 10 µl - Kolon sıcaklığı: Zor ayırımların olduğu durumlarda, kolon buzlu su banyosuna daldırılır ve ısının stabil olması için dakika beklenir. - Post-kolon reaksiyon sıcaklığı: 100 o C - Saptama dalga boyu: 420 nm NOT: Tüm kromatografik sistem ve post-kolon analizden sonra su ile yıkanmalıdır (5.2.1). Eğer sistem 2 gün içinde tekrar kullanılmayacaksa, sudan sonra metanol geçirilmelidir (5.2.7). Sistemi tekrar şartlamadan önce kristallenmeyi önlemek için su geçirilir Hesaplama Emülsiyonlar ( ) Formaldehit miktarı % (m/m) C = C m 5 m Losyon ve Şampuanlar: C = C.10-4 m m Burada: m= Analiz edilen örnek kütlesi gr olarak ( ) C= Kalibrasyon eğrisinden okunan (5.4.1) formaldehit konsantrasyonu µg/100 ml cinsinden.

38 5.6. Tekrarlanabilirlik (Norm ISO 57) - % 0.05 lik formaldehit içeriği için, örnekteki 2 paralel tayin sonucu arasındaki fark % i geçmemelidir. - % 0.2 formaldehit içiriği için, örnekteki iki paralel tayin sonucu arasındaki fark % i geçmemelidir. EK 1 FRANSIZ ÖRGÜSÜ GEREKLİ MALZEMELER - Bir tahta makara Merkez boyunca açılmış 1.5 cm çaplı deliğe sahip 5 cm dış çap 4 çevik çivi yerleştirilir (Şekil 1 ve 2 de gösterildiği gibi), 2. çivi arasındaki mesafe 1.8 cm ve delikten uzaklığı 0.5 cm olmalıdır. - Bir bükülmeyen iğne (tığ tipi) (Teflon boruyu ilmeklemek için) - İç çapı 0.3 mm olan 1.6 mm teflon borudan 5 m PROSEDÜR Fransız örgüsüne başlarken, teflon boru mavnanın tepesinden sonuna kadar merkezi delik yolu ile geçirilir (örgü prosesi sırasında zincirin çekilmesini kolaylaştıracak şekilde tüpü makaranın altından 10 cm dışarı çıkararak); sonra şekil 3 de gösterildiği gibi boruyu 4 çivi etrafından sırasıyla sarın, fransız örgüsünün üstü ve altı metal halka ve sıkıştırma vidaları ile korunur. Sıkı çekerken teflonu ezmemeye dikkat edilir. Boruyu her bir vidanın etrafında ikinci defa sarın ve aşağıdaki gibi dikişler yapın. - Aşağıdaki boruyu çengelle yukarıdaki boruya asın (Şekil 4 e bakın); 5 m veya istenilen uzunluktaki örgü elde edilinceye kadar bu prosesi her bir çivi üzerinde sırasıyla tekrarlayın (1, 2, 3, 4 saat yönünün tersine) - 10 cm boruyu zinciri kapatmak için ayırın. Boyu her dört ilmekten geçirin ve zinciri kapatın.

39 NOT: Fransız örgüsü post-kolon reaktörleri için (Supelco tarafından üretilmiş olup, piyasada mevcuttur.)

40 EK-2 1- Likit kromatografi pompası 2- Enjeksiyon valfi 3- Prekolonlu kolon 4- Reaktif pompası 5- T-boru (ölü hacimsiz) T-boru (vortex) Birleşme (ölü hacimsiz) 7- Fransız örgüsü Reaktör 8-3 boyunlu kaynama su erleni 9- Erlen ısıtıcısı 10- Soğutucu 11- Paslanmaz çelik ısı transfer tüpü Eşanjör 12- UV-VIS dedektör 13- PCRS 520 post-kolon modülü

41 YÖNTEM V- ŞAMPUAN VE SAÇ LOSYONLARINDA REZORSİNOL TAYİNİ 1. KAPSAM VE UYGULAMA ALANI Bu yöntem, şampuan ve saç losyonlarındaki rezorsinolün gaz kromatografisi ile tayinini kapsar. Bu metot örnekte % kütle olarak % 0.1 den % 2 ye kadar olan konsantrasyonlar için uygundur. 2. TANIM Bu yöntemle saptanan örnekteki rezorsinol miktarı % kütle cinsinden belirtilir. 3. PRENSİP

42 Rezorsinol ve internal standart olarak kullanılan 3.5 dihidroksitoluen, (5-metil rezorsinol) ince tabaka kromatografisi ile ayrılır. Her iki bileşenin lekeleri kazınarak metanol ile ekstre edilir, kurutulur, silanize edilir ve gaz kromatografi ile tayin edilir. 4. REAKTİFLER Kullanılan tüm kimyasallar analitik saflıkta olmalıdır Hidroklorik asit % 25 (m/m) 4.2. Metanol 4.3. Etanol % 96 (v/v) 4.4. Floresans indikatörlü hazır TLC plaklar (plastik yada alüminyum) aşağıdaki gibi deaktive edilir: Silika kaplı plaklar üzerine, parlayıncaya kadar su püskürtülür. Su püskürtülmüş plaklar oda ısısında bir-üç saat havada kurumaya bırakılır. NOT: Plaklar deaktive edilmezse silika üzerine geriye dönüşümsüz adsorbsiyondan dolayı rezorsinol kaybı meydana gelir Yürütme solvanı Aseton-kloroform-asetik acid (20:75:5 v/v/v) 4.6. Rezorsinol standart solüsyonu 400 mg rezorsinol 100 ml % 96 lık etanol (4.3) içinde çözülür. (Bu çözeltinin 1 ml.si 4000 mikrogram rezorsinol içerir.) 4.7. İnternal standart solüsyonu 400 mg 3.5-di-hidroksitoluen DHT i 100 ml % 96 lık etanol (4.3) içinde çözülür. (Bu çözletinin 1 ml si 4000 mikrogram DHT içerir.) 4.8. Standart karışım

43 10 ml çözelti (4.6) 10 ml çözeltide (4.7) alınıp, 100 ml lik bir ölçülü balona konulur. Hacme kadar %96 lık etanol (4.3) ile tamamlanır ve karıştırılır. (Bu çözeltinin 1 ml.si 400 mikrogram rezorsinol ve 400 mikrogram DHT yi içerir.) 4.9. Silanize edici ajanlar N, 0-bis-(trimetilsilil) trifluoroasetamid (BSTFA) Hekzametildisilazan (HMDS) Trimetilklorosilan (TMCS) 5. EKİPMAN 5.1. İnce tabaka düzenekleri ve gaz kromatografisi cihazı 5.2. Cam malzeme 6. İŞLEM 6.1. Örneğin hazırlanışı ml likbir erlen içine yaklaşık mg rezorsinol içeren örnekten tam tartım alınır Karışım asidik hale gelinceye kadar hidroklorik asit (4.1) ilave edilir (yaklaşık 2-4 ml gereklidir). İnternal standart çözeltisinden (4.7) 10 ml (40 mg DHT) eklenir ve karıştırılır. Etanol (4.3) ile birlikte 100 ml lik bir balona aktarılır, hacme kadar etanol ile tamamlanıp, çalkalanır Çözelti (6.1.2) den 250 mikrolitre deaktive edilmiş bir silika plağa (4.4) yaklaşık 8 cm uzunluğunda düz çizgi halinde damlatılır. Çizginin dar olması için özen gösterilir Standart karışım (4.8) den 250 mikrolitre aynı plağa aynı şekilde uygulanır (6.1.3) Plak yürütüldükten sonra lokalizasyona yardım için 4.6 ve 4.7 solüsyonlarından 5 er µl iki nokta halinde başlangıç çizgisine damlatılır Plak, solvent 4-5 içeren doyurulmamış tank içerisinde damlatma çizgisinden itibaren 12 cm yürütülür. Genelde bu 45 dakika alır. Hava ile kurutulur ve UV 254 nm altında rezorsinol/dht lekeleri tespit edilir. Bu iki bileşen yaklaşık aynı Rf değerlerine sahiptir. Lekeler kazınır ve 10 ml.lik şişelere alınır.

44 Örneği ve standart karışımı içeren absorbanların her biri aşağıdaki yolla ekstre edilir: 2 şer ml metanol ilave edilip, 1 saat karıştırılır, süzülür ve ekstraksiyon 2 ml metanol ile 15 dakika tekrarlanır Ekstraktlar birleştirilir ve bir gece boyunca solvanı uygun bir desikan madde içeren vakum desikatöründe uçurulur. Herhangi bir ısı uygulanmaz Bakiyeler (6.1.8) veya deki gibi silanize edilir Bir mikroenjektörle 200 µl BSTFA (4.9.1) eklenir ve karışım 12 saat oda ısısında kapalı bir kapta tutulur Bir mikro enjektörle sırasıyla 200 µl - HMDS (4.9.2) ve 100 µl TMCS (4.9.3) eklenir ve karışım kapalı bir kapta 30 dakika 60 o C de ısıtılır, karışımı soğutulur Gaz Kromatografi Kromatografi koşulları Kolonun rezolüsyonu (R) aşağıdaki formülle hesaplandığında 1,5 veya daha büyük olmalıdır. R= 2d 1 (r 2 -r 1 ) w 1 + w 2 Burada: r 1 ve r 2 : iki pikin dakika cinsinden alıkonma zamanları w 1 ve w 2 : aynı piklerin yarı yükseklikte milimetre cinsinden genişlikleri d 1 : kağıt hızı, mm/dakika cinsinden Aşağıdaki kolon ve gaz kromatografisi koşulları uygun bulunmuştur: Kolon materyali: Paslanmaz çelik Uzunluk: 200 cm

45 İç çap: 3 mm Dolgu materyali: % 10 OV-17 chromosorb WAW mesh Alev iyonizasyon dedektörü: Sıcaklıklar: Kolon: 185 o C (Izotermal) Dedektör: 250 o C Enjeksiyon portu: 250 o C Taşıyıcı gaz: Azot Akış: 45 ml/dakika Hidrojen ve hava akımı için üreticinin talimatlarına uyulur da elde edilen çözeltilerden 1-3 mikrolitre gaz kromatografına enjekte edilir. Her çözelti (6.1.9) için 5 enjeksiyon yapılır, alanlar ölçülür, ortalaması alınır ve pik alan oranı S: rezorsinol pik alanı/dht pik alanı hesaplanır. S= Rezorsinolun pik alanı/dht nin pik alanı. 7. HESAPLAMA Örnekteki rezorsinol konsantrasyonu % kütle (m/m) olarak aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır. % rezorsinol= 4 x S örnek M S standart karışım Burada; M = Gram cinsinden test miktarı (6.1.1)

46 S örnek = Örnek çözelti için ye göre ortalama pik alan oranı S standart karışım = Standart karışım için ye göre ortalama pik alan oranı 8. TEKRARLANABİLİRLİK (Norm ISO 57) Yaklaşık % 0.5 lik bir rezorsinol içeriği için, aynı örnekte yürütülen iki paralel deney sonuçları arasındaki fark % i aşmamalıdır. YÖNTEM VI. ETANOL YADA PROPAN-2-OL İLE BAĞLANTILI OLARAK METANOL TAYİNİ 1. KAPSAM VE UYGULAMA ALANI Bu metod her tür kozmetik üründe (aerosoller dahil) metanolün gaz kromatografisi ile analizini tarif eder. % 0-10 relatif seviyeler saptanabilir. 2. TANIM Bu yöntem metanol miktarını etanol yada propan-2-ol ile bağlantılı olarak, metanolü % kütle cinsinden ifade eder. 3. PRENSİP Tayin, gaz kromatografisi ile yürütülür. 4. REAKTİFLER Kullanılan kimyasallar analitik saflıkta olmalıdır Metanol 4.2. Absolü etanol 4.3. Propan-2-ol