Koagülaz Negatif Stafilokoklarda Slime Faktör Yap m n n İki Ayr Yöntem ile ve Farkl Atmosfer Ortamlar nda Araşt r lmas

Transkript

1 Deneysel Çal şma Koagülaz Negatif Stafilokoklarda Slime Faktör Yap m n n İki Ayr Yöntem ile ve Farkl Atmosfer Ortamlar nda Araşt r lmas İlknur KALELİ, Melek DEMİR Pamukkale Üniversitesi T p Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dal, DENİZLİ ÖZET Çeşitli klinik örneklerden soyutlanan 100 koagülaz negatif stafilokok (KNS) suşunun slime faktör oluşturması Kongo kırmızılı agar ve Christensen yöntemi ile aerobik, %5-10 CO 2 li ve anaerobik ortamlarda araştırıldı. Kongo kırmızılı agarda slime oluşumu aerob, %5-10 CO 2 li ve anaerob ortamlarda sırasıyla %51, %36, %30 iken Christensen yönteminde %32, %25 ve %17 olarak bulunmuştur. Slime oluşumunun en iyi aerob ortamda ve Kongo kırmızılı agarda saptandığı gözlendi (p<0.01). KNS suşları arasında ise slime oluşumunun en sık S.epidermidis de olduğu belirlendi. Anahtar Kelimeler: Koagülaz negatif stafilokok, slime, atmosfer ortamı, kongo kırmızılı agar, Christensen yöntemi SUMMARY The Investigation of Slime Production in Coagulase-Negative Staphylococci by Two Methods and Different Incubation Condition Slime production of 100 coagulase negative staphylococci isolated from various clinical samples have been investigated by Christensen and Congo red agar methods in various atmospheric conditions, such as aerobiosis, 5-10% CO 2, and anaerobiosis. Slime production rates were found as follows respectively for aerobiosis, 5-10% CO 2, and anaerobiosis 51%, 36%, 30% by Congo red agar. The rates, however, are found as 32%, 25% and 17% by Christensen method. It has been observed that slime production was best detected by Congo red agar in aerobic condition. S.epidermidis is the most strain that slime producing in coagulase negative strains. Key Words: Coagulase negative staphylococi, slime, atmosphere condition, congo red agar, Christensen method GİRİŞ Eskiden klinik önemi az ve kontaminan mikroorganizmalar olarak kabul edilen koagülaz negatif stafilokoklar (KNS) son 20 y lda etyolojide önemli rol oynayan ajanlar olarak değerlendirilmeye başlanm şt r (1). Kardiyoloji, ortopedi ve yenidoğan yoğun bak m ünitelerine yatan hastalarda KNS lerin neden olduğu hastane kaynakl infeksiyonlar geliştiği bildirilmiştir (2). Hastane kaynakl veya toplumdan kazan lm ş üriner sistem infeksiyonlar nda, immün sistemi bask lanm ş erişkinlerde ve prematür yenidoğanlarda 226

2 oluşan bakteriyemilerde ve cerrahi sonras oluşan yara infeksiyonlar nda etkenler aras nda KNS ler s kl kla sorumlu tutulmaktad r. Özellikle intravenöz katateri, prostetik kalp kapakç ğ, eklem protezi, serebro-spinal şant, kardiak pace-maker, periton dializ katateri bulunan hastalardaki infeksiyonlarda, cerrahi sonras protez ile ilişkili osteomyelitte ve cerrahi sonras endoftalmitlerde s kl kla etken KNS lerdir (1,2). Elektron mikroskopik ve immünolojik incelemeler KNS suşlar n n, yabanc cisimlerin plastik yüzeyine bakteriyel adhezyonu başlatan ve artt ran hücre yüzey ve ekstrasellüler makromoleküller ürettiğini göstermiştir (1). Adherensin başlamas ndan sonraki basamak bakterinin yüzeye kolonizasyonu ve glikokaliks üretimidir. Bu glikokaliks Ekstrasellüler Slime Substans (ESS) olarak tan mlanmaktad r (1). Bu molekül patojeniteden sorumlu tutulmaktad r (1,3). İnvitro ESS üretimi PH, CO 2 bas nc, Ca ++, Mg ++, fosfat ve vasat n protein ve agar kompozisyonu gibi çeşitli kültür koşullar na bağl d r (1). Slime faktör varl ğ n n gösterilmesinde çeşitli yöntemler kullan lmaktad r. Kongo k rm z l agar ve Christensen yöntemi en s k kullan lan yöntemlerdir. Çal şmam zda bu iki farkl yöntemle slime faktör oluşumunun gösterilmesi ve çeşitli atmosfer koşullar n n slime üretimi üzerine etkisinin araşt r lmas amaçlanm şt r. MATERYAL ve METOD Pamukkale Üniversitesi T p Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dal Laboratuvar nda çeşitli klinik örnekten soyutlanan 100 KNS suşu çal şma kapsam na al nd. Stafilokok- mikrokok ayr m bacitrasin (0.04 Ü) disk testi ile yap ld (1). KNS suşlar lamda ve tüpte koagülaz yöntemi kullan larak ay rtedildi. Suşlar n tiplendirilmesi Knapp ve Washington taraf ndan tan mlanm ş treholase mannitol broth (1), laktoz, sukroz, maltoz fermentasyonu, üreaz, ornitin dekarboksilaz aktivitesi, novobiocin, polimiksin B 300 direncine bak larak ve APİ STAPH sistemi ile yap ld. Tiplendirilmesi yap lm ş KNS suşlar nda slime üretimi, aerob, anaerob ve %5-10 CO 2 li ortamlarda Kongo k rm z l agar ve Christensen yöntemi ile araşt r ld. Christensen yönteminde, kanl agarda üretilmiş taze KNS ler, 5 ml Trypticase Soy Broth (TSB) içeren tüplere ekilerek 48 saat 37 C de aerob, %5-10 CO 2 li ve anaerob ortamlarda inkübe edildi. 48 saat sonra tüp içeriği boşalt ld ve tüplere 1 ml safranin konulup 5 dakika bekledikten sonra tüp içeriği tekrar boşalt ld. Tüpler kurutma kağ d üzerine ters çevrilerek bekletildi. Tüp duvar nda gözle görünür bir film tabakas n n oluşmas slime pozitif olarak kabul edildi. Hava ile temas eden k s mda halka şeklinde oluşan tabaka negatif olarak değerlendirildi (4). Kanl agarda üretilmiş taze KNS lerden Kongo k rm z l agara tek koloni ekimi yap ld. K rksekiz saat 37 C de aerob, %5-10 CO 2 li ve anaerob ortamlarda inkübe edildi. Siyah koloni oluşturan suşlar slime faktör pozitif olarak değerlendirildi (5). BULGULAR Çeşitli klinik örnekten soyutlanan 100 KNS suşu çal şma kapsam na al nd. Bu örneklerin 30 u kan, 42 si yara, 15 i idrar, 11 i BOS ve 2 si kataterdi. Tiplendirme sonucu 100 KNS suşunun 68 i Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis), 12 si S. haemolyticus, 8 i S. hominis, 4 ü S. saprophyticus, 2 si S. warneri, 2 si S. simulans, 2 si S. xylosus, 2 si S. sciuri olarak belirlendi. Atmosfer koşullar na göre değerlendirildiğinde slime oluşumunun en iyi aerob ortamda olduğu gözlendi (Tablo l). İstatistiksel olarak slime oluşumu bak m ndan ortamlar aras ndaki fark anlaml bulundu (p<0.01). İleri analiz yap ld ğ nda fark n aerob ortamdan kaynakland ğ saptand. Yöntemlere göre değerlendirildiğinde aerob ve anaerob ortamlarda Kongo k rm z l agarda slime oluşumunun, Christensen yöntemine göre daha yüksek oranda olduğu bulundu (s ras yla p<0,01, p<0.05). %5-10 CO 2 li ortamda slime oluşumu bak m ndan Kongo k rm z l agar ile Christensen yöntemi aras nda fark bulunmad (p>0.05) (Tablo l). Tablo 1. Slime faktör pozitifliğinin çeşitli atmosfer ortam na göre dağ l m. Atmosfer ortamı Slime faktör pozitifliği (Kongo kırmızısı) Slime faktör pozitifliği (Christensen) Aerob %5-10 CO 2 li ortam Anaerob

3 Kaleli İ, Demir M Tablo 2. Aerob ortamda slime faktör pozitifliğinin klinik örneklere dağ l m. Örnek Sayı Slime faktör pozitifliği (Kongo kırmızısı) % Slime faktör pozitifliği (Christensen) % Kan Yara İdrar BOS Katater Toplam Slime faktör oluşumunun klinik örneklere göre dağ - l m Tablo 2 de gösterilmiştir. KNS ler aras nda slime yap m türlere göre incelendiğinde ise S. epidermidis de aerob ortamda Kongo k rm z l agarda %57.3, Christensen yönteminde %39.7 oran nda pozitif olduğu saptand (Tablo 3). Kongo k rm z l agarda aerob ortamda slime pozitif 51 suşun 39 u (%76.5) S. epidermidis idi. Christensen yönteminde slime pozitif bulunan 32 suşun 27 si (%84.4) S. epidermidis idi (Tablo 4). TARTIŞMA Başlang çta klinik önemi az olan KNS ler, yatan hastalara uygulanan invaziv girişimlerin artmas ile birlikte önem kazanmaya başlam şlard r. İmmün bask lanm ş hastalarda, yenidoğan yoğun bak m ünitelerinde, çeşitli cerrahi yoğun bak m ünitelerinde yatan hastalarda oluşan bakteriyemilerde en s k soyutlanan etkenler aras nda KNS ler yer almaktad r (6,7). KNS lerin farkl bir çok türü olmas - na rağmen bunlardan bir kaç insanlarda hastal ğa neden olur (1). Bu nedenle patojen ve patojen olmayan KNS lerin belirlenmesi önemlidir. Bir virulans faktörü olan slime faktör bakterinin plastik ve metal yüzeylere adherensini art r r ve bu yüzeyler üzerinde bir film tabakas oluşturarak mikroorganizmay antimikrobiyal ajanlardan korur. Slime faktör ayn zamanda PGE2 indüksiyonu ile periferal T lenfosit ve monosit proliferasyonunu inhibe eder, ayr ca polimorf nüveli lökositlerin hücre kemotaksisini inhibe ederek fagositozu engeller (1, 8). Bu özellikleri nedeniyle slime faktör patojeniteden sorumlu bir faktördür (8). Slime üretiminin yayg n olarak S. epidermidis suşlar nda görüldüğü bildirilmekle birlikte, S. saprophyticus, S. simulans, S. lugdunensis gibi diğer baz KNS suşlar taraf ndan da ESS benzeri substanslar üretildiği belirtilmektedir (1). KNS lerde slime faktör yap m çeşitli yöntemler ile araşt r lm şt r. Christensen yöntemi ile Akova ve ark. (9) %21.1, Elçi ve ark. (10) %56.5 ve Songur ve ark. (11) %37 oran nda slime faktörü pozitif bulmuşlard r. Ayd nl ve ark. (12) Kongo k rm z l agarda 131 KNS suşunun 62 sinde (%47) slime faktörü pozitif bulmuşlard r. Nourizadeh ve Sultan (13) çal şmalar nda Kongo k rm z l agar yöntemi ile %50, Christensen yöntemi ile %53 oran nda slime oluşumu belirlemişlerdir. Akyar ve ark. (14) 100 Tablo 3. Çeşitli KNS suşlar na göre aerob ortamda slime faktör pozitifliğinin dağ l m. KNS Sayı Slime faktör pozitifliği (Kongo kırmızısı) % Slime faktör pozitifliği (Christensen) % S. epidermidis S. haemolyticus S. hominis S. saprophyticus S. warneri S. simulans S. xylosus S. sciuri Toplam

4 Tablo 4. Aerob ortamda kongo k rm z s ve christensen yöntemine göre slime faktör pozitifliğinin çeşitli KNS suşlar na dağ l m. KNS Slime faktör pozitifliği (Kongo kırmızısı) (n=51) % Slime faktör pozitifliği (Christensen ) (n=32) % S. epidermidis S. haemolyticus S. hominis S. saprophyticus S. warneri S.simulans S. xylosus S. sciuri KNS da slime faktör yap m n standart tüp, Christensen yöntemi ve Kongo k rm z l agar yöntemi kullanarak araşt rm şlard r. Standart tüp yönteminde %42, Kongo k rm z l agar ile %43, Christensen yöntemi ile %42 oran nda slime faktör üretimi saptam şlard r. Bizim çal şmam zda aerob ortamda Kongo k rm z l agarda 100 KNS suşunun 51 inde slime faktör pozitif bulunmuştur. Christensen yönteminde ise 32 suşta slime faktör yap m gözlenmiştir. Çal şmam zda slime üretiminin aerob ortamda Kongo k rm z l agarda daha fazla olduğu görüldü. Kongo k rm z l agar n h zl, duyarl ve kolay uygulanabilir bir yöntem olduğu düşünüldü. Slime yap m n n ph, CO 2 gibi çeşitli kültür koşullar na bağl olduğu bildirilmiştir (1). Denyer ve ark. (15) CO 2 varl ğ nda ph daki ufak düşüşlerin metabolik ve yüzey değişikliklerine neden olabileceğini belirttikleri çal şmalar nda %5 CO 2 li ortamda adherensin azald ğ n göstermişlerdir. Berker ve ark. (16) anaerob ortamda aerob ortama göre slime oluşumunun daha az olduğunu göstermişlerdir. Songur ve ark. (11) slime oluşumunda aerobik ve %5-10 CO 2 li ortam n ayn etkiyi gösterdiklerini ancak anaerobik ortam n slime oluşumunu anlaml ölçüde azaltt ğ n saptam şlard r. Bizim çal şmam zda atmosfer ortamlar n n slime üretimi üzerine etkisi değerlendirildiğinde, Kongo k rm z l agarda aerob ortamda 100 KNS suşunun 51 inde slime oluşumu pozitif bulunmuş iken, %5-10 CO 2 li ortamda 36 suşta ve anaerob ortamda da 30 suşta pozitif bulunmuştur. Christensen yönteminde aerob ortamda 32, %5-10 CO 2 li ortamda 25 ve anaerob ortamda da 17 suşta slime oluşumu pozitif bulunmuştur. İstatistiksel olarak fark anlaml bulunmuştur (p<0.01). Diğer araşt rmac lara benzer şekilde, çal şmam zda slime oluşumunun en iyi aerob ortamda olduğu saptanm şt r. Çal şmam zda 30 kan örneğinin 13 ünde (%43.3) ve 42 yara örneğinin 22 sinde (%52.3) slime üretimi pozitif olarak saptanm şt r. Ayd nl ve ark. (12) yara örneklerinde %45, kan örneklerinde %57 oran nda slime faktörü pozitif belirlemişlerdir. Akyar ve ark. (14) çal şmalar nda 22 cerrahi yara örneğinin 10 nunda, 30 kan örneğinin 15 inde slime faktör pozitifliği saptam şlard r. Çal şmam zda ve diğer araşt rmalarda, kan ve yara örneklerinden soyutlanan KNS lerde slime oluşumunun oldukça yüksek oranlarda olduğu görülmüştür. KNS ler aras nda en s k S. epidermidisin soyutland - ğ ve slime yap m n n en çok bu türler taraf ndan oluşturulduğu belirtilmiştir (1). Kleeman ve ark. (17) mikrobiyoloji laboratuvar nda soyutlanan 500 KNS un %64.5 nin, S. epidermidis, %13.4 ünün S. haemolyticus, %7.4 nün S. hominis, %4 ünün S. warneri, %2.8 inin S. simulans, %1.6 s n n S. saprophyticus olduğunu bulmuşlard r. Bu sonuçlar bizim çal şmam zla uyumlu idi. Akyar ve ark. (14) slime pozitif KNS lerin %60.4 ünü S. epidermidis, %30.2 sini S. saprophyticus, %4.6 s n S. cohnii, %4.6 s n S. haemolyticus olarak belirlemişlerdir. Çal şmam zda Kongo k rm z l agarda aerob ortamda slime pozitif 51 suşun 39 u (%76.5), Christensen yönteminde aerob ortamda slime pozitif 32 suşun 27 si (%84.4) S. epidermidis idi. Bu oran S.haemolyticus da Kongo k rm z l agarda %9.8, Christensen yönteminde %3.1, S. saprophyticus da Kongo k rm z l agarda %3.9, Christensen yönteminde %3.1 idi. Slime üretiminde iki yöntemin çeşitli atmosfer ortamlar nda karş laşt r ld ğ çal şmam zda, slime oluşumunun en iyi aerob ortamda olduğu, Kongo k rm z l agar n kolay uygulanabilir duyarl bir yöntem olduğu düşünüldü. KNS lar aras nda en çok S. epidermidis de slime oluşumu görülmekle birlikte diğer türlerin de slime oluşturduklar saptand. 229

5 Kaleli İ, Demir M KAYNAKLAR 1. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC (eds). The gram-positive cocci: Part I: Staphylococci and related organisms. In: Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 5 th edit. Philadelphia: JB Lippincott Company, 1997: Baird D. Staphylococcus: Clustur forming gram positive coci. In: Colle JG, Fraser AG, Marmion BP, Simmons A (eds). Practical Medical Microbiology, 14th Edition. London: Churchill Livingstone, 1996: Christensen GD, Simpson WA, Bisno WA, Beachy EH. Adherence of slime producing strains of Staphylococcus epidermidis to smooth surfaces. Infect Immun 1982; 37: Christensen GD, Simpson WA, Younger JJ, et al. Adherence of coagulase negative staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative mode for the adherence of staphylococci to medical devices. J Clin Microbiol 1985; 22: Freeman DJ, Falkiner FR, Keane CT. New method for detecting slime production by coagulase negative staphylococci. J Clin Pathol 1989; 42: Szumala A, Szezapa J, Kornacka M. Incidence and antibiotic resistance of coagulase negative staphylococci in a neonatal intensive care unit. Gynekol Pol 1994; 65: Kloos WE, Bennerman TL. Update on clinical significance of coagulase negative staphylococci. Clin Microbiol Rev 1994; 7: Ruben FL, Norden CW. Staphylococcal Infections. In: Evans AS, Brachman PS (eds). Bacterial Infections of Humans, Epidemiology and Control. 2nd Edition. New York: Plenum Medical Book Company, 1991: Akova M, Gür D, Akal n HE, Baykal M. Klinik önemi olan Staphylococcus epidermidis suşlar n n saptanmas nda slime testinin yeri. İnfeksiyon Dergisi 1989; 3: Elçi S, Gül K, Özel F, Suay A, Mete Ö. Koagulaz negatif stafilokoklarda makro ve mikro yöntemle slime oluşumunun saptanmas ve antibiyotik direncinin araşt r lmas. İnfeksiyon Dergisi 1996; 10: Songur M, Sayan M, Yüce A, Yuluğ N. Koagulaz negatif stafilokoklarda slaym üretimi ile değişik inkübasyon ortamlar n n ilişkisi. İnfeksiyon Dergisi 1998; 12: Ayd nl A, Durmaz G, Akgün Y. Koagulaz negatif stafilokoklarda slime faktör yap m n n Kongo k rm - z l agar yöntemiyle araşt r lmas. Flora Dergisi 1997; 2: Nourizadeh E, Sultan N. Koagulaz-negatif stafilokoklarda slaym (slime) faktör yap m n n çeşitli yöntemlerle gösterilmesi. İnfeksiyon Dergisi 1993; 7: Akyar I, Fidan I, Rota S, Türet S. Koagulaz negatif stafilokoklarda slime faktör yap m n n üç farkl yöntemle araşt r lmas, tür tayini ve antibiyotik direnci. Mikrobiyol Bülteni 1998; 32: Denyer SP, Davies MC, Evans JA, et al. Influence of carbon dioxide on the surface characteristics and adherence potential of coagulase negative staphylococci. J Clin Microbiol 1990; 28: Berker LP, Simpson WA, Christensen GD. Differential production of slime under aerobic and anaerobic conditions. J Clin Microbiol 1990; 28: Kleeman KT, Bannerman TL, Kloos WE. Species distribution of coagulase-negative staphylococal isolates at a community hospital and implications for selection of staphylococcal identification procedures. J Clin Microbiol 1993; 31: YAZIŞMA ADRESİ: Yrd. Doç. Dr. İlknur KALELİ Saltak Cad. Alper Apt. No: 57/7 DENİZLİ 230