Hayvan deneylerine alternatifler

Transkript

1 Hayvan Deneylerine Alternatifler; Hücre Kültürü Doç. Dr. Yasemin BASKIN Dokuz Eylül Üniversitesi Onkoloji Enstitüsü Temel Onkoloji AD Hayvan deneylerine alternatifler Hayvan deneylerinin mümkün olduğunca az yapılması Hayvan deneylerine alternatiflerin geliștirilmesi Russel ve Burch (1959) tarafından tanımlanan 3 R formülü Azaltma (Reduction) Geliștirme (Refinement) Yer değiștirme (Replacement) Đn vitro deney modelleri Đn silico simulasyonlar 1

2 Tanımlar Hücre kültürü, hücrelerin kontrollü șartlar altında yetiștirilmesi sürecidir. Pratikte hücre kültürü terimi, çok hücreli ökaryotlardan özellikle hayvan hücrelerinden kaynaklanan hücrelerin kültürlenmesi için kullanılmaktadır. Hücre kültüründe belirli bir hücre hattından çoğaltılan hücrelerde çeșitli çalıșmalar yapılarak canlı ortamında (in vivo) yapılamayan denemeler yapılabilir Tarihçe Doku ve hücre kültürü çalıșmaları yüz yılı așkın bir süredir yapılmakta, doku kaynaklarından ayrılan sürdürülebilir yașayan hücre hatları kavramı 19. yüzyılda ortaya konmuștur. 19. yüzyılda Đngiliz fizyolog Sydney Ringer tuz çözeltileri 1885'de Wilhelm Roux tavuk embriyosu nöral plağının doku kültürünü Ross Granville Harrison, 1907 doku kültürünün metodolojisi 1913 te Carrel aseptik (steril) koșullar Earle 1948 de L hücre hattından koloni olușumu 1940 ve 50'lerde viroloji araștırmalarında önemli ölçüde geliștirilmiștir de Gey HeLa hücre hattını, bir insan servikal karsinomasından sürekli hücre hattı 1986 da Martin ve Evans fareden pluripotent embryonik kök hücre 1998 de Thomson ve Gearhart, insan embryonik kök hücreleri 2

3 Kullanım alanları Fonksiyonel genomik, post genomik araștırmalar Hastalıkların in vitro modellerinin olușturulması (kanser araștırmaları gibi) Đlaç etkilerinin araștırılması (sitotoksisite testleri gibi) Klinik olarak kullanılabilir doku/organların üretimi. Hücre kültürünün temel ekipmanı Laminar kabinet vertikal Đnkübatör C for insect & 37 C for mammalian cells, CO2 2-5% & 95% air at 99% relative humidity Soğutucular ve sıvı Azot Liquid media kept at 4 C, enzymes (e.g. trypsin) & media components (e.g. glutamine & serum) at -20 C, cells in N Đnverted mikroskop 10x,100x Doku kültür kapları polystyrene 3

4 Hücre kültürünün temel ekipmanı Laminar kabinet Vertikal UV DEÜ Deney Hayvanları Sertifikasyon Kursu Hücre kültürünün temel ekipmanı Đnkübatör C for insect & 37 C for mammalian cells, CO2 2-5% & 95% air at 99% relative humidity DEÜ Deney Hayvanları Sertifikasyon Kursu 4

5 Hücre kültürünün temel ekipmanı Soğutucular ve sıvı Azot Liquid media kept at 4 C, enzymes (e.g. trypsin) & media components (e.g. glutamine & serum) at -20 C, cells in N Hücre kültürünün temel ekipmanı Đnverted mikroskop 10x,100x Fluoresan Fotoğraf-video DEÜ Deney Hayvanları Sertifikasyon Kursu 5

6 Hücre kültürünün temel ekipmanı Đnverted mikroskop «Micro injection» DEÜ Deney Hayvanları Sertifikasyon Kursu Uygun bir kap Basit flask Single cell Doku kültür kapları polystyrene Bilgisayar kontrolünde izlenen gelișmiș biyoreaktörler 6

7 Uygun bir kap.. Collagen I coated, 96-well plate xcelligence RTCA DP Instrument.The CIM-Plate Metastaz-invazyon modelleri Hücre kültürü yapmak için ne gerekir? Hücre kaynağı taze hazırlanmıș stok hücre hattı 7

8 Hücre Kaynağı PRĐMER KÜLTÜRLER Taze dokudan alınırlar Kültürde yașam süreleri sınırlıdır Proteolitik enzimlerle ișlenirler (Trypsin) Hücreler tek tek ayrılırlar epitelyal hücreler, Fibroblastlar SÜREKLĐ HÜCRE HATLARI Dönüștürülerek üretilebilirler(transformed) Büyüme kontrolü ile ilișkili faktörlere düșük duyarlılık gösterirler Ölümsüzleștirilerek üretilebilirler (immortalised) Kanserlerden üretilebilirler (neoplastic) Sıklıkla tutunmaya bağımlılık kaybolur Kültürleri kolaydır. Büyüme ortamı Șeker Su Amino Asitler Tuzlar Glikoz konsantrasyonu 5-10 mm arasındadır. Tüm aminoasitler L formundadır ve bir iki istisna dışında konsantrasyonları 0,1-0,2 mm dır. Vitaminlerin konsantrasyonu ise 100 kat daha az yaklaşık 1 μm dır. Serumun (at ya da dana serumu kullanılır) total hacme oranı % 10 olarak ayarlanır. Antibiyotikler bakteri üremesini önlemek için ortama katılır. Fenol kırmızısı ortam ph sını 7,4 e ayarlamak için bir gösterge olarak kullanılır. Serum kullanılmadan kimyasal olarak koşulları belirlenmiş bir besiyerine ise, serum yerine hücre çoğalmasını uyaran büyüme faktörleri ve hücreye demir taşıyan transferrin gibi proteinler eklenir. 8

9 Amino asitler Vitaminler Tuzlar Diğerleri Proteinler (serum yerine) Arjinin Biotin NaCl Glukoz Đnsülin Sistin Kolin KCl Penisilin Transferrin Glutamin Folat NaH 2 PO 4 Streptomisin Büyüme faktörleri Histidin Nikotinamid NaHCO 3 Fenol kırmızısı Đzolösin Pantotenat CaCl 2 Tam serum Lösin Pridoksal MgCl 2 Lizin Tiamin Metiyonin Riboflavin Fenilalanin Treonin Triptofan Tirozin Valin Büyüme ortamı DMEM Dulbecco/Vogt modified Eagle's (Harry Eagle) minimal essential medium. RPMI Roswell Park Memorial Institute medium. 9

10 Gaz değişimi için seçenekler Oksijen/Azot (ortam havası) Karbondioksit Hayvansal kaynaklı serum Fötal Bovine Serum (FBS) Hücre çoğalması için gereklidir. %5 - %10 oranında büyüme ortamı içinde bulunmalıdır. 10

11 Göstergeler Atık ürünler ph değișikliğine neden olurlar. Fenol Kırmızısı gibi bir ph göstergesi kullanılmalıdır. Değișim kırmızıdan sarıya olur. Fenol kırmızısı (ph indikatörü) 6,6 8,0 fenolsülfonftalein) Isı ve ph kontrol et 37.5 O C ph

12 Hücre çoğalmasının/sayısının ölçülmesi Kültürdeki hücreleri sayarak (haemocytometer, Flow Cytometry, FACS) Optik yoğunluğun spektrofotometrede ölçülmesi (yapısal, fonksiyonel boyalar) Eș Zamanlı gözlemle ölçümler (mikro elektrotlarla direnç değișiminin ölçülmesi) Sayımla Thoma lamı Neuber lamı 12

13 Metabolizmasının Ölçülmesi Fonksiyonel boyalar Radyonüklid. Mikro elektrotlarla direnç değişiminin ölçülmesi 13

14 Kültürde bulaş Kimyasal Kimyasal bulașı saptamak güç, görünmezler Endotoksinler, plastik malzeme kökenliler, metal iyonları, dezenfektanlar.. Biyolojik Biyolojik bulaș etkisi görülür, daha kolay saptanır Mikoplazma, maya, bakteri, mantar yada bir diğer hücre Enfeksiyonun önlenmesi Antibiyotikler 10,000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 μg amphotericin B per ml, sterile-filtered, Gentamicin solution 10 mg/ml in deionized water, liquid, sterile-filtered,.. Sterilizasyon Gaz UV Sterilizatörler. 14

15 Hücrelerin kinetiği Yapıșma Fazı Çoğalma Fazı Dejenerasyon Fazı Hücrelerin saklanması Hücre soylarının mikroorganizmalar tarafından kontaminasyonunu önlemek Gerektiğinde kullanılmak üzere depolamak ve diğer araștırıcılara vermek 15

16 Hücrelerin sürdürülmesi HEp2 KELLY Hücrelerin tutunma özellikleri Tutunmaya Bağımlı Tutunmadan - Bağımsız 16

17 Tutunmadan bağımsız hücreler Vücut sıvılarına ilișkin hücreler kan hücreleri Süspansiyon kültür Zamanla alt kültürleri alınmalıdır. Tutunmaya Bağımlı hücreler Çoğu hayvansal kaynaklı hücre Tek tabaka olușturacak șekilde kültür kabının tabanına yapıșır. Tüm taban yüzeyi kaplandığında çoğalma durur (sıkıșma) Bu dönemde alt kültüre alınırsa çoğalma yeniden bașlar 17

18 Hücre hattı Köken aldığı tür Köken aldığı doku Hücre morfolojisi 3T3 Mouse Bağ doku Fibroblast Yok Süspansiyon kültürde üreme CHO BHK21 Chinese Hamster Syrian Hamster Over Epitelyal Var Böbrek Fibroblast Var HeLa Human Servikal karsinom Epitelyal Var Hücre Hattı Hücre tipi ve kökeni 3T3 BHK21 MDCK HeLa PtK1 L6 PC12 SP2 COS 293 CHO DT40 R1 E14.1 T24 HepG2 HEK293 HL60 SH-SY5Y H1, H9 S2 BY2 fibroblast (fare) fibroblast (hamster) epitel hücresi (köpek) epitel hücresi (insan) epitel hücresi (rat) miyoblast (rat) kromaffin hücresi (rat) plazma hücresi (fare) böbrek (maymun) böbrek (insan), adenovirüsle transforme edilmiş over (hamster) lenfoma hücresi (civciv) embryonik kök hücreler (fare) embryonik kök hücreler (fare) mesane epitel hücresi (insan) karaciğer epitel hücresi (insan) böbrek epitel hücresi (insan) lösemi (lenfoblastik benzeri) hücresi (insan) nöroblastoma hücresi (insan) embryonik kök hücreler (insan) makrofaj benzeri hücreler (Drosofila) farklılaşmamış meristematik hücreler (tütün) 18

19 Neden hücre kültürü yaparız? Avantajlar? Dezavantajlar? Avantajlar Belirlenmiș/tanımlanmıș bir hücre izole edilebilir ve klonlanabilir. Mutant bir hücre Hücre büyümesinin/ölümünün araștırılması Hücre fonksiyonlarının araștırılması Biyoteknoloji uygulamaları için gereken hibrit hücreler 19

20 Apoptosis Annexin V- TUNEL FACS-single cell PCR Önemli ilaçların üretimi Așılar Hormonlar Hedefe yönelik anti kanser ilaçlar Tanı ve sağaltımda kullanılan monoklonal antikorlar 20

21 Tanı ve tedavide monoklonal antikorlar Dezavantajlar Đn vivo ya göre Đmmun sistem etkileri? Kokültürler?? Organlarda hücrelerin çok katlı yapısı? 3D kültürler?? Organlarda tek tip olmayan hücre bileșeni? Metabolizma? Organ sistemlerinin dinamik etkileșimi? 21

22 Kalite kontrol???? Misidentified Cross-contaminated Cultured under poor conditions Contaminated And what about passage number? Teşekkür ve Anma Prof. Dr. E. Julio CELIS Arianna CELIS 22