Etanol ile Oluşturulan Gastrik Hasarda Radikal Temizleyiciler ve Antioksidanlar n Mide Mukozas n Koruyucu Etkisi

Transkript

1 Türkiye Tıp Dergisi 1999; 6(3): Deneysel Çal şma Etanol ile Oluşturulan Gastrik Hasarda Radikal Temizleyiciler ve Antioksidanlar n Mide Mukozas n Koruyucu Etkisi Yüksel KOÇYİĞİT BAYLAN*, M. Orhan DENLİ*, M. Ayd n KETANİ** * Dicle Üniversitesi T p Fakültesi, Fizyoloji Anabilim Dal ** Dicle Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dal, DİYARBAKIR ÖZET Çalışmada, yüksek dozlarda mide hasarı oluşturan absolü etanolün, sıçanların mide dokularında lipiddperoksit düzeyleri ve oluşan hasarın histolojik incelemesi ile radikal temizleyici ajan allopurinol, sukralfat ve antioksidan E vitamininin bu hasara karşı etkinliğinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla 45 adet gr ağırlığında Wistar albino sıçan kullanıldı. Deney hayvanları eşit olarak 5 gruba bölündü. Grup I: Deney hayvanları kontrol grubu olarak, Grup II: Etanol, Grup III: Vit E + etanol, Grup VI: Allopurinol + etanol, Grup V: Sukralfat + etanol grupları olarak kullanıldı. Kontrol grubuna hiçbir girişim yapılmadan sakrifiye edildi. Etanol grubuna 24 saat açlığı takiben 1 ml % 96 lık etanol orogastrik sonda ile uygulandı. Diğer her bir gruba bir hafta süreyle allopurinol, sukralfat ve vitamin E verildi. Deney hayvanlarının deney sonunda, eter anestezisi altında sistemik perfüzyonları yapılarak mide dokuları alındı ve %10 luk nötral formalin (ph:7.4) solüsyonunda fiksasyonu yapıldı. Rutin histolojik takiplerle elde edilen 5 mm kalınlığında parafin kesitleri Hemotoksilen-Eozin ile boyanarak ışık mikroskobik değerlendirilmesi yapıldı. Kalan materyalden her bir grup için 0.5 gr mide dokusu alındı ve bütün deney gruplarında malondialdehit (MDA) tayini yapıldı. Çalışma sonucunda doku lipid peroksidasyonunun bir göstergesi olan MDA miktarı, kontrol grubunda 85.4 ± 17.7 nmol/gidi. Sadece etanol verilen grupta 190.7± 16.7 nmol/g iken, allopurinol + etanol grubunda 91.9 ± 15.7 nmol, vit E + etanol grubunda 79.6 ± 15.4 nmol/g, sukralfat + etanol grubunda ise ± 16.4 nmol/g idi. Sonuç olarak, etanol ve sukralfat + etanol uygulanan grupta kontrol grubuyla karşılaştırıldığında mide mukoza erozyonlarının ve lipid peroksit düzeylerinin arttığı gözlendi. Özellikle vit E, allopurinol ve sukralfat ile profilaksi yapılan gruplar sadece etanol verilen grup ile karşılaştırıldığında radikal giderici ajanların hem makroskobik hem histolojik düzeyde hem de lipid peroksidasyonu yönünden koruyucu oldukları gözlendi. Bunlara göre sukralfat daha az etkiliydi. Anahtar Kelimeler: Etanol, mukozal hasar, antioksidanlar SUMMARY The Protective Effect of Radical Scavenger and Anti-oxidant on Gastric Mucosa Injured by Ethanol The aim of this study was to investigate the effect of absolute ethanol at high doses on gastric injury, and to examine lipid peroxide levels and histological effects on gastric tissues in rats. The protective effect of such radical scavenger agents as a allopurinol, sucralphate and anti-oxidant vitamin E on gastric damage were also 151

2 Koçyiğit Baylan Y, Denli MO, Ketani MA investigated. Forty-five wistar albino rats, each weighing gr were used. Experimental animals were equally divided into 5 groups, as following; Group-I: control group, Group-II: Ethanol, Group-III: Vit E + ethanol, Group-VI: Allopurinol+ethanol, Group-V: Sucralphate+ethanol. The control group was sacrifced without any experimentation, while 1 ml of 96% ethanol was administered to ethanol group by orogastric following 24 hours of starvation. Allopurinol, sucralphate and vitamin E were administered to other group for one week. After the experimental period, the animals were sacrificed under ether anesthesia, and their gastric tissues were removed by systemic perfusions. The tissues were then fixed with 10% neutral formalin solution ( ph: 7.4). Five µm parafine sections were taken routinely and stained with Hematoxylen-Eosin and later observed under light microscobe. 0.5 gr of tissue dissected from this materials was used to determine Malondialdehyde (MDA) levels in all groups. MDA levels, an indicator of tissue lipid peroxidation were found to be 85.4±17.7 nmol/g in control group, 190.7±16.7 nmol/g in ethanol group, 91.9±15.7 nmol/g in Allopurinol+ethanol group, 79.6±15.4 nmol/g in Vit E+ethanol group and 131.9±16.4 nmol/g in sucralphate+ethanol group. As a result, gastric mucosal erosions and lipid peroxide levels were observed to increase in ethanol and sucralphate+ethanol groups, compared to control group. In particular, radical scavenger agents such as vit E, allopurinol and sucralphate were found to reduce lesion formation at histological and microscopical level, and to be protective for lipid peroxidation formation. Sucralphate, however, was found to be less effective respect to these agents. Key Words: Ethanol, mucosal damage, antioxidants GiRiŞ Etanol al m n n birçok dokuda, özellikle karaciğer ve midede metabolik değişikliklere ve patolojik bozukluklara yol açt ğ bilinmektedir (1,2). Yap bak m ndan farkl birçok kimyasal madde, insan ve deney hayvanlar n n gastrik mukozas nda hasar yapmakta ve midenin asit salg layan bölgelerinin mukozal epitelinde nekroz ve hemoraji gibi ortak histopatolojik elemanl lezyonlara sebep olmaktad r. Bu bozukluklar n oluşumundan sorumlu faktörler tam olarak bilinmemekle birlikte, etanolün kendisinden çok metabolizma ürünleri arac l ğ yla etkili olduğu benimsenmektedir (1-3). Serbest oksijen radikallerinin son zamanlarda, iskemi/reperfüzyon, soğuk/stres, etanol ve nonsteroidal antienflamatuar ilaçlar n neden olduğu gastrik hasar n patogenezinde primer bir faktör olduklar gösterilmiştir (2,3). Ancak gastrik mukozal hasara neden olabilen oksijen radikallerinin gerçek mekanizmas aç k değildir. Oksidan maddeler; poliansatüre yağ asitleri, sülfürlü amino asit içeren proteinler ve nükleik asitlerle kolayl kla reaksiyona girer. Bu da memran n hayati özelliklerini değiştirebilir, epitel ve endotelin bariyer yeteneğine hasar verebilir. Süperoksit anyon ve hidroksil radikali gibi oksijen kaynakl serbest radikaller sitotoksiktirler ve doku hasar n n oluşmas n teşvik ederler. Buna ilaveten radikaller epitelyal membran n temel komponenti olan hiyalüronik asidin y k m na neden olarak mukozal hasar oluşumunu uyar rlar (3). Deneysel olarak etanol uygulanmas ve oluşan mukozal hasar n giderilmesinde vit E, allopurinol ve sukralfat n etkileri karş laşt r ld. Bu maddeler, serbest radikaller ve lipid peroksidasyonunu gidererek hücre ve doku y k m n önlemektedirler (4). Çal şmada bu bilgilerin ş ğ alt nda, doku lipid peroksidasyonunun bir göstergesi olan MDA düzeyleri tiobarbitürik asit (TBA) testi (5) ile ölçülerek %96'l k etanolün intragastrik uygulanmas ile oluşan gastrik mukozal hasar n gelişimi ve radikal temizleyicilerinin de bu etkileri ne şekilde giderebildiği incelendi. MATERYAL ve METOD Araşt rmam z, Dicle Üniversitesi Sağl k Bilimleri Araşt rma ve Uygulama Merkezi (DÜSAM)'nde gerçekleştirdik. Deney hayvanlar 12 saat karanl k, 12 saat ayd nl k ortamda ve optimal oda s s nda bar nd r ld. Hayvanlara deney süresince pelet yem ve içme sular verildi. Araşt rmada 45 adet g ağ rl ğ nda Wistar albino s çan kullan ld. Deney hayvanlar eşit olarak 5 gruba bölündü. Bir hafta süre ile her gruba kendi kar ş m olmak üzere 160 mg/kg sukralfat 50 mg/kg allopurinol, 100 mg/kg vit E verildi. Bütün gruplar laparatomi öncesi 24 saat süreyle sadece su alacak şekilde aç tutuldu. Sukralfat distile suda, allopurinol 0.1 M NaOH'de ve Vit E ise zeytinyağ nda çözüldü. 1. Kontrol grubu: Hiçbir girişim yap lmadan sakrifiye edildi. 2. Etanol grubu: 24 saat açl ğ takiben orogastrik yoldan 1 ml etanol verildi. 90 dk sonra sakrifiye edildi. 3. Vit E+etanol grubu: 24 saat açl ğ takiben yine vit E verip 120 dakika sonrada absolü etanolden 1 ml verip 90 dakika sonra sakrifiye edildi. 152

3 Türkiye Tıp Dergisi 1999; 6(3): Allopurinol+etanol grubu: Bu gruptakiler 3. gruptaki s çanlara uygulanan işlemlerin ayn s allopurinol için yap ld. 5. Sukralfat+etanol grubu: Bu gruptaki s çanlar 24 saatlik açl k sonras 160 mg/kg sukralfat uygulamas n takiben 120 dakika sonra 1 ml absolü etanol uyguland. 90 dakika sonra sakrifiye edildi. Laparatomi yap ld ğ nda mide gastroözofagial bileşke ve pilor hizas ndan olacak şekilde ç kar ld ve s - çanlar sakrifiye edildi. Mide dokusunun bir k sm al - n p %10'luk nötral formalinde fiksasyonu yap ld. Rutin histolojik takiplerle elde edilen 5 µm kal nl - ğ ndaki parafin kesitleri Hematoksilen-Eozin ile boyanarak ş k mikroskobik değerlendirilmesi yap ld (6). Eldeki materyalden 0.5 g mide dokusu al nd. Bütün deney gruplar nda midenin histolojik incelemesi ile mide dokusunda MDA tayini yap ld (5). İstatistiksel değerlendirmede Student - t ve Mann-Whitney U testi kullan ld. Resim 2. Alkol grubuna ait mide kesiti. İleri derecede mukozal tahribat (ok ile işaretli), submukozada ödem, hemorajik alanlar (+ ile işaretli) izlenmektedir (Hematoksilen-Eozin, X16). BULGULAR Resim 1. Kontrol grubuna ait mide kesiti. Tunica mucosa tabakas n n normal görünümü (Hematoksilen-Eozin, X16). Resim 3. E vitamini+etanol grubuna ait mide kesiti. Mukozal hasar n önlendiği (ok ile işaretli) izlenmektedir (Hematoksilen-Eozin, X16). Kontrol grubu ile deney grubu mide kesitlerinin mukoza tabakas n n karş laşt r lmas ve uygulanan antioksidanlar n hücresel ve mukozal tabakas yerindeki etkinliği aşağ daki şekildedir: Grup I: Bu gruptaki mide kesitlerinde herhangi bir patolojiye rastlanmad (Resim 1). Grup II: Alkol grubuna ait mide kesitlerinde yayg n mukozal tahribat, submukozada ödem, hemorajik alanlar, akut inflamasyon izlendi (Resim 2). Grup III: Vit E ve etanol verilen grupta mikroskobik olarak, mukoza bütünlüğünü koruduğu, submukozada ödem ve lamina propriada hafif ödem ve yayg n erozyonun azald ğ dikkati çekmektedir (Resim 3). Grup IV: Allopurinol ve etanol verilen grupta ise mikroskobik olarak yayg n erozyonun yerini yer yer fokal erozyona b rakt ğ gözlendi (Resim 4). Grup V: Sukralfat ve etanol grubunda mikroskobik lezyonlar n devam ettiği, fakat mukoza tabakas nda tahribat n vit E ve allopurinol gruplar na göre daha fazla olduğu görüldü (Resim 5). MDA düzeyi her denek için 1 g mide dokusuna düşen nanomol cinsinden hesaplanan MDA miktar, kontrol grubunda 85.4±17.7 nmol/g idi. Sadece etanol verilerek gastrik mukozal harabiyet oluşturulan grupta 190.7±16.7 nmol/g iken, s ras yla allopurinol+etanol verilen grupta 91.9±15.7 nmol/g, vit E+etanol grubunda 79.6±15.4 nmol/g, sukralfat+etanol grubunda ise 131.9±16.4 nmol/g idi (Şekil 1). 153

4 Koçyiğit Baylan Y, Denli MO, Ketani MA a) Kontrol grubuna göre değerlendirildiğinde: Etanol ve sukralfat+etanol gruplar nda lipit peroksit düzeylerinde anlaml art şlar gözlenirken (p<0.001), allopurinol+etanol ve vit E + etanol gruplar nda istatistiksel olarak önemli bir değişiklik gözlenmedi (p>0.05). b) Etanol grubuna göre değerlendirildiğinde; Tüm deney gruplar ndaki mide MDA düzeylerinde anlaml art şlar bulundu (p<0.001). c) Allopurinol grubuna göre değerlendirildiğinde; vit E+etanol grubunda bir değişiklik bulunmazken (p>0.05), sukralfat+etanol grubunun anlaml düzeyde artt ğ saptand (p<0.001). d) E vitamini grubuna göre değerlendirildiğinde ise Sukralfat+Etanol grubunda önemli düzeyde art şlar gözlendi (p<0.001). Resim 4. Allopurinol+etanol grubuna ait mide kesiti. Mukozal tahribat n azald ğ (ok ile işaretli) lamina propriada fokal erozyon odaklar (+ ile işaretli) izlenmektedir (Hematoksilen-Eozin, X16). Resim 5. Sukralfat+etanol grubuna ait mide kesiti. Fokal erozyon alanlar (ok ile işaretli), submukozada ödem (S ile işaretli) ve intramukozal hemorajik alanlar (+ ile işaretli) izlenmektedir (Hematoksilen- Eozin, X16). TARTIŞMA Akut etanol uygulamas ndan sonra, oksijenle ilgili serbest radikal oluşumunda art şlar olduğu ileri sürülmektedir (7-11). Lipid peroksidasyonunu başlat c özellikte olabilen bu radikallerin, etanol ve asetaldehidin metabolizmas s ras nda oluştuğu bildirilmektedir (8). Etanolün lipid peroksidasyonunu uyarmas n n hidroksil radikali art ş na bağl olduğu, akut etanol uygulamas ndan sonra NADPH oksidaz aktivitesininde artt ğ ve bununda süperoksid radikali arac l ğ ile hidroksil radikali oluşumuna katk da bulunduğu öne sürülmüştür (10). Kronik etanol uygulamas ndan sonra, Mikrozomal Etanol Oksidleyici Sistem (ME- OS) ve NADPH oksidaz aktivitelerindeki art şlar n daha belirgin olduğu saptanm ş ve bu aktivasyonun daha şiddetli lipid peroksidasyon uyar s na neden olabileceği bildirilmiştir (12). Bu nedenle etanol toksisitesi, baz araşt r c lar taraf ndan oksidatif stresle aç klanmaya çal ş lm şt r (1,13). Çeşitli yollarla oluşturulan stresin ve alkolün insanlarda ve deney hayvanlar nda akut eroziv gastritlerin oluşumunda rol ald ğ ve irritatif etki yapt ğ, gastrik mukozada erozyona kadar varan lezyonlar oluşturduğu yap lan çeşitli araşt rmalardan anlaş lm şt r (13). Serbest oksijen radikallerinin kalp, akciğer, karaciğer,böbrek ve ince barsak iskemik doku hasar patolojisinde de rol oynad ğ ileri sürülmüştür (14,15). Ancak gastrik mukozal hasar n patogenezi hala tam olarak bilinmemektedir (16). Etanol, gastrik mukozada mast hücrelerinin degranülasyonu ve lezyonlar na sebep olur. Etanole bağl mukozal hasar peptik ülserlere karş koruyucu mekanizmalar araşt rmak için standart bir model olarak kullan lmaktad r. Çeşitli faktörlerin sebep olduğu peptik ülserlerin patogenezi, artm ş lümen asiditesi, azalm ş mukozal kan ak m ve gastrik mukozal bari- 154

5 Türkiye Tıp Dergisi 1999; 6(3): Doku MDA (nmol/g yaş W) Kontrol Etanol Alopurinol + E vitamini+ Sukralfat+ Etanol Etanol Etanol Gruplar Şekil 1. Kontrol ve deney gruplar n n mide MDA düzeyleri. yerin y k m ndan oluşan benzer mekanizmalar içerirler. Baz araşt r c lar %14 konsantrasyonun üzerindeki etanolün mukozal bariyeri k rd ğ ve %25 etanolün gastrik mukozada hasar başlatt ğ n göstermişlerdir(10). Ancak Mizui ve Doteucki (17) tipik gastrik lezyonlar n %40 n üzerindeki etanolle oluşabildiğini belirtmişlerdir. Vasküler lezyonlar n oldukça erken dönemlerde oluştuğu bilinmektedir, ancak Galli ve ark. (18) lezyonlar n tam bir saatte maksimuma ulaşt ğ n bildirmişlerdir. Araşt rmac lar tüm deney gruplar nda, çoğu histopatolojik olarak submukozal ödem, hiperemi, inflamatuar hücrelerin infiltrasyonu ve mukozal erozyonlar gibi bulgular gözlemlemişlerdir (1,9). Çal şmam zda, taze mide homojenatlar nda MDA ölçümüne dayanan bir yöntemle, absolü etanol uygulamas n n lipid peroksid düzeyleri üzerine etkisi incelendi. Etanol ile oluşturulan mukozal tahribatta, mukozada erozyon ve hemoroji yayg n olarak izlendi. Özellikle vitamin E nin mukozal tahribat önlediği, hücresel yap lar koruduğu saptanm şt r. Sukralfat n mukozal lezyonlar k smi olarak önlediği, bu etkisinin diğer gruplara oranla sekonder olduğu gözlendi. Baz araşt r c lar sukralfat n yararl etkileri olduğunu bildirirken (19), baz lar fazla etkili olmad ğ n ileri sürmektedirler (20). Ancak bu ilac n etki mekanizmas hala bilinmemektedir (21). Bu maddenin hidroklorik asid sekresyonunu nötralize ederek mide ve ince barsakta koruyucu etkinliği görüldüğü halde (22) bizim çal şmam zda ileri derecede bir etkinlik göstermemiştir. Sonuç olarak, serbest radikal temizleyici ajan allopurinol ve antioksidan alfa tokoferolün etanolle oluşturulan hemorojik gastritte lezyon oluşumunu azaltt ğ ve lipid peroksidasyonu oluşumunu bloke ettiklerini saptad k. Böylece serbest radikallerin etanolle oluşturulan hemorojik gastrit etiyopatogenezinde tek baş na değilse de rol oynad klar görüşüne ulaşt k. Ancak bu hasar n oluşumunda serbest radikallerin kesin rolünü araşt rmak için daha ileri çal şmalara gereksinim olduğu kan s nday z. KAYNAKLAR 1. Mutoh H, Hiraishi H, Ota S, Terano A, Ogura K, Luey KJ, Sugimolo T. Relationships between metal ions and oxygen free radikals in ethanol-induced damage to cultured rat gastric mucosal cells. Dig Dis Sci 1995; 40: Miller TA. Protective effects of prostaglandins against gastric mucosal damage: Current knowledge and proposed mechanims. Am J Physiol 1983; 245: Epstein FH. Mechanisms of disease. Eng J Med 1988; 319: Mozsik G, Süto G, Garamszegi M, et al. Oxygen free radicals and gastric mucosal damage in rats treatment with ethanol and HCI. J Gastroenterology and Hepatology 1991; 10: Ohkawa H, Ohishi N, Yagi N. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbitüric acid reaction. Analytical Biochem 1979; 95: Sam F, Reitmen S, Sonnenwirth A, Growoh' : Clinical Laboratory Methods and Diagnosis 1970; 1:

6 Koçyiğit Baylan Y, Denli MO, Ketani MA 7. Kuietys RP, Twoh g B, Danzell J, Specian RD. Ethanol-induced injury to the rat gastric mucosa. Role of erytrophils and xanthine oxidase derived radicals. Gastroenterology 1990; 98: Lutncki K, Wrobel J, Ledwozyw A, Trebas-Pietras E. The effect of calcium ions on the intensity of peroxidation processes and the severity of ethanol-induced injury to the rats gastric mucosa. Arch Vet Pol 1992; 32: Yüncü M, Kalkan S, Çerçi M, Duman S, Aktan M, Cüce H. The effect of acute ethanol intake on gastric mast cells of rats. Türkiye T p Dergisi 1996; 3: Kohut A, Mojzis J. Effect of allopurinol and superoxide dismutase on indomethacin- induced gastric lesions in the rat. Physiol Res 1993; 42 : İto H, Asahi H, Horiuchi S. Role of oxygen radicals in the pathogenesis of acute gastric mukosal lesion under obstructive jaundice. Nippon Geka Gakkai Zasshi 1993; 94: Kuk elka E, Cederbaum AI. The effect of chronic ethanol consumption on NADH and NADPH dependent generation of reactive oxygen intermediates by isolated rat liver nuclei. Alcohol Alcohol 1992; 27: Matsumoto T, Moriguchi R, Yamada H. Role of polymorpho-nuclear leucocytes and oxygen-derived free radicals in the formation of gastric lesions induced by HCL / ethanol and a possible mechanism of protection by anti-ulcer polysaccharide. J Pharm Pharmacol 1993, 45: Gürsoy M, Kayabola M, Hazar H, ve ark. S çanlarda oluşturulan stres ülserlerinde serbest oksijen radikallerinin ve radikal temizleyicilerinin rolü. Ulusal Cerrahi Dergisi 1992; 8: Bukley GB, Ranger DN. Role of oxygen derived free radicals in digestive tract diseases. Surgery 1993; 94: Rachmilewitz D, Karmeli F, Okan E, Samuni A. A novel antiulcerogenic stable radical prevents gastric mucosal lesions in rats. Gut 1994; 35: Mizui T, Doteuchi M. Lipid Peroxidation: A possible role in gastric damage induced by ethanol in rats. Life Sci 1986; 33: Galli SJ, Wershil BK, Bose R, Walker PA, Szabo S. Ethanol-induced acute gastric injury in mast cell-deficient and congenic normal mice. Am J Pathol 1987; 128: Kinoshita M, Yamasaki K, Kokusenya Y, Yamaki H. Relationship between gastroprotective effect of locally acting antiulcer agent ecabet sodium and its binding to gastric mucosa in rats. Dig Dis Sci 1995; 40: Konturek SJ, Brzozowski T, Majka J, Sclachcic A, Czarnobilski K. Nitric oxide in gastroprotection by sucralfate, mild irritant and nocloprost. Role of mucosal blood flow. Dig Dis Sci 1994; 39: Singh K, Nain CK, Singh V, Ganguly NK. Effect of sucralfate on gastric bicarbonate secretion in patients with duodenal ulcer. Indian S Gastroentorology 1995; 14: YAZIŞMA ADRESİ: Dr. Yüksel KOÇYİĞİT BAYLAN Dicle Üniversitesi T p Fakültesi, Fizyoloji Anabilim Dal DİYARBAKIR 156