Yo un Bak m Ünitesinde Ço ul Dirençli Pseudomonas aeruginosa ya Ba l Bir Hastane nfeksiyonu Salg n n n ncelenmesi #

Transkript

1 Hastane nfeksiyonlar Dergisi 2002; 6: Hastane İnfeksiyonları Yo un Bak m Ünitesinde Ço ul Dirençli Pseudomonas aeruginosa ya Ba l Bir Hastane nfeksiyonu Salg n n n ncelenmesi # Dr. Zeynep GÜLAY*, Dr.. Mehmet Ali ÖKTEM*, Dr. Tuncer TOKLU*, Dr. Ayfle YÜCE** * Dokuz Eylül Üniversitesi T p Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal, ** Dokuz Eylül Üniversitesi T p Fakültesi, Klinik Bakteriyoloji ve nfeksiyon Hastal klar Anabilim Dal, zmir. ÖZET May s 1997 de 1 haftal k bir zaman diliminde anestezi ve reanimasyon yo un bak m ünitesinde yatan 7 hastan n ço ul dirençli Pseudomonas aeruginosa ile infekte veya kolonize oldu u belirlenmifltir. Olgular n zaman ve yer aç s ndan gruplaflmalar nedeniyle, bir hastane salg n olufltu u düflünülmüfl ve el y kama ile ilgili önlemlerin artt r lmas ile dirençli suflun yay l m kontrol alt na al nm flt r. Salg n döneminde stoklanan izolatlar n antibiyotik duyarl l klar, beta-laktamaz paternleri ve Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) ile makrorestriksiyon profilleri retrospektif olarak incelenmifl ve bu salg n s ras nda antibiyogram paternleri ayn olan iki farkl klonun izole edildi i saptanm flt r. Anahtar Kelimeler: Pseudomonas aeruginosa, Makrorestriksiyon Analizi, Hastane nfeksiyonu. SUMMARY Evaluation of a Nosocomial Outbreak Due to Multi-Resistant Pseudomonas aeruginosa in Intensive Care Unit During a week s period in May 1997 seven patients who were hospitalized in the intensive care of the anesthesiology and reanimation unit were either colonized or infected by multiresistant Pseudomonas aeruginosa. Space and time clustering of the cases indicated an outbreak and the transmission of the resistant isolate ceased after strict application of hand washing practices. Typing of the isolates by antibiotyping, identification of beta-lactamase patterns and macrorestriction analysis by Pulsed Field Gel Electrophoresis revealed that two distinct clones were involved in the outbreak. Key Words: Pseudomonas aeruginosa, Macrorestriction Analysis, Nosocomial Infection. # Bu çal flma, XXVIII. Türk Mikrobiyoloji Kongresi (1998 Belek, Antalya) nde sunulmufltur. zolatlar n PFGE analizi Dr. Zeynep GÜLAY taraf ndan Edinburgh Üniversitesi, Moleküler Direnç Laboratuvar nda yap lm flt r. G R fi Pseudomonas aeruginosa, özellikle yo un bak m hastalar nda kolonizasyona ve yaflam tehdit edici boyuttaki infeksiyonlara yol açabilmektedir (1,2). Bu izolatlar n ço unlukla ço ul dirençli olmas bu infeksiyonlar n sa alt m n da güçlefltirmektedir (1-3). May s 1997 de hastanemiz anestezi yo un bak m ünitesinden gönderilen bir yara kültüründe, amikasin hariç tüm antipsödomonal antibiyotiklere (imipenem, meropenem, 3. kuflak sefalosporinler, aztreonam, siprofloksasin ve gentamisin) dirençli bir P. aeruginosa suflu üretildi. zolat n amikasin duyarl l ise orta (intermediate) olarak de erlendirildi. Bu ilk 87

2 Gülay Z, Öktem MA, Toklu T, Yüce A. Yo un Bak m Ünitesinde Ço ul Dirençli Pseudomonas aeruginosa ya izolasyonu izleyen 3. günden bafllayarak 1 haftal k bir zaman diliminde ayn ünitede yatan 6 hastadan gönderilen çeflitli örneklerden de antibiyogram paterni ayn olan 8 P. aeruginosa suflu izole edildi. Ço ul dirençli bir suflun ayn ünitede yatan farkl hastalardan izole edilmesi bir hastane salg n olarak de erlendirildi. Bunun do rulanmas amac yla, dirençli izolatlar stoklanarak fenotipik ve genotipik özellikleri çeflitli yöntemlerle incelendi. Bu amaçla, izolatlar n çeflitli antibiyotiklere duyarl l klar ve izoelektrik odaklama yöntemi ile beta-laktamaz tipleri saptand. Bunlar n yan s ra, de iflimli alan elektroforezi [Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)] yöntemi ile Xba I makrorestriksiyon analizi yap larak izolatlar n klonal yak nl araflt r ld. MATERYAL ve METOD Hastanemiz, 724 yatakl bir üniversite hastanesi olup anestezi yo un bak m ünitesi 11 yatak içermektedir. Bakteriler Çal flmaya klinik mikrobiyoloji laboratuvar nda 15 May s May s 1997 tarihleri aras nda anestezi yo un bak m ünitesinde yatan 7 hastadan izole edilen 9 P. aeruginosa suflu al nd. zolatlar n 4 ü trakeal sekret, 2 si yara, 2 si kan, 1 i ise periton s v s ndan üretildi. Bakteriler koloni yap s, pigment oluflumu ve biyokimyasal özelliklerine göre tan mland. Tür tayinleri API 20NE (BioMerieux) ile do ruland. Antibiyotik Duyarl l k Testleri zolatlar n imipenem, meropenem, seftazidim, sefotaksim, aztreonam, siprofloksasin, gentamisin ve amikasine duyarl l klar, disk difüzyon ve/veya agar dilüsyon testi ile incelendi. Antibiyotik duyarl l k testlerinin uygulanmas nda National Committee for Clinical Laboratory Standarts (NCCLS) n önerilerine uyuldu (4,5). Beta-Laktamazlar n De erlendirilmesi Bakterilerin nutrient agardaki (oxoid) kültürleri 1 ml 50 mm fosfat tamponu ile y kanarak topland. Bakteriler sonikatörde (soniprep 150) parçaland. Sonikat 4 C de, rpm de, 10 dakika santrifüj edilerek beta-laktamazlar içeren üst s v topland ve -20 C de sakland. Sonik ekstrede beta-laktamaz varl nitrosefin yöntemi ile saptand. Bu amaçla 30 µl sonik ekstre, 100 µl nitrosefin (Glaxo, Greenwood, UK) çözeltisi (50 µg/ml) ile karfl laflt r larak substrat n renginin sar dan k rm z ya dönüflümü izlendi (6). Beta-laktamazlar izoelektrik odaklama [Isoelectric Focusing (IEF)] yöntemi ile incelendi (6). Sonik ekstre, poliakrilamid jelde, güç 1 watt, voltaj 500 V, ak m 20 mamp olacak flekilde yürütüldükten sonra, enzim bantlar nitrosefin yard - m yla görünür hale getirildi. zoelektrik noktalar (pi) referans enzim (TEM-1 pi: 5.4) ve proteinler (pi calibration kit, BDH) ile karfl laflt r larak saptand. PFGE Analizi Makrorestriksiyon analizi için bakteriler 10 ml nutrient broth içerisine aktar ld ve sürekli çalkalanarak 37 C de 16 saat inkübe edildi. nkübasyon süresi sonunda besiyerleri santrifüje edilerek dipteki bakteri çöküntüsü iki kez SE tamponu (100 mm NaCl, 25 mm EDTA, ph 7.5) ile y kand ve yine ayn tampon içerisinde süspansiyon haline getirildi. Bakteri yo unlu u, spektrofotometre yard m yla (Spectronic 20, Bausch & Lomb) optik dansitesi 1.0 e eflit olacak flekilde ayarland. Bakteri süspansiyonlar 1:1 oran nda %1 agaroz ile kar flt r larak kal plar içine aktar ld. Kal plardaki agaroz kat lafl nca, agaroz-bakteri kar fl m steril tüplere aktar ld ve bakterilerin parçalanmas n sa lamak amac yla tüp içerisine proteinaz K içeren lizis tamponu eklenerek 56 C de su banyosunda 2 gece bekletildi. Bu süre sonunda agaroz parçalar TE tamponu (10 mm tris, 10 mm disodyum EDTA, ph 7.5) ile 5 kez y - kand ve steril bir mikrosantrifüj tüpü içine aktar larak Xba I ile (37 C su banyosunda, 1 gece tutularak) agaroz içindeki bakteri DNA s n n kesilmesi sa land. Parçalar, %1 PFGE agarozuna aktar larak elektroforez uyguland. Bu amaçla CHEF DR II sistemi (Bio-Rad Lab) kullan ld. Elektroforez sonunda ürünler etidyum bromür ile boyan p görsel olarak de erlendirildi. zolatlar, tüm bantlar uyumluysa ayn sufl; 1-3 bant aç - s ndan farkl ise ayn suflun alt tipleri; 4-6 bant aç s ndan farkl ise olas l kla iliflkili sufllar; 7 ve daha fazla bant aç s ndan farkl ise de iflik sufl olarak kabul edildi (7,8). BULGULAR Disk difüzyon yöntemiyle izolatlar n tümü amikasin orta duyarl ; imipenem, meropenem, sefotaksim, seftazidim, aztreonam, siprofloksasin ve gentamisin dirençli olarak de erlendirildi. Agar dilüsyon testi ile antibiyotik duyarl l klar incelendi inde, bakterilerin tümünün seftazidim, sefotaksim ve siprofloksasine dirençli ol- 88 Hastane nfeksiyonlar Dergisi 2002; 6: 2

3 Yo un Bak m Ünitesinde Ço ul Dirençli Pseudomonas aeruginosa ya Gülay Z, Öktem MA, Toklu T, Yüce A. du u saptand. mipenem ve meropenem minimal inhibitör konsantrasyonu (M K) de erlerinin ise, orta duyarl ve dirençli kategorileri aras nda de iflti i gözlendi (Tablo 1). Beta-laktamaz de erlendirilmesinde sufllar n 7 (%78) sinde pi 5.2, 6.4, 8.5 ve/veya 8.7 olan enzimler saptand. ki suflun ise pi 8.5 olan enzimlerin oluflturdu u silik bir bant görülmekle birlikte esas olarak pi 6.2 olan bir beta-laktamaz üretti i belirlendi (Resim 1). Bakteri DNA s n n Xba I makrorestriksiyon paternleri incelendi inde iki ana patern saptand (Resim 2). Bu iki grup aras nda antibiyotiplere göre belirli bir ayr m yap lamamaktayd. Buna karfl n, makrorestriksiyon paternleri farkl olan sufllar n (protokol no ve 11877) beta-laktamaz tiplerinin de farkl oldu u, ayr ca bunlar n ayn hastan n farkl kültürlerinden izole edildi i belirlendi. Bu bulgulara dayanarak, k sa bir süre içinde ayn ünitede yatan 11 hastan n 7 sinden ayn kökenin üretilmesi, dirençli suflun klonal yay l m lehinde yorumland. DNA makrorestriksiyon ve beta-laktamaz analizlerine iliflkin bulgular m z Tablo 1 de özetlendi. TARTIfiMA Son y llarda, oksiminosefalosporinler ve karbapenemler gibi genifl spektrumlu beta-laktam ajanlara dirençli gram-negatif nonfermentatif basillerin etken oldu u hastane infeksiyonlar giderek artan oranlarda bildirilmektedir (1,9,10). Bu etkenler aras nda en önde geleni P. aeruginosa d r. P. aeruginosa n n beta-laktam ajanlara direnç mekanizmalar aras nda AmpC tipi kromozomal beta-laktamazlar n ve PER-1, TEM-24, SHV-2a gibi genifllemifl spektrumlu beta-laktamazlar n üretimi, d fl membran proteinlerinin kayb veya de iflimi ve beta-laktam ajanlar n hücre içerisinde etkin konsantrasyona ulaflmas - n engelleyen aktif pompa sistemleri say labilir (11-16). Karbapenem direncinin ise özellikle OprD mutasyonlar na ve/veya kromozomal betalaktamazlar n afl r üretimine ba l oldu u bildirilmektedir (1,17). Çal flmam zda, 1997 y l nda 1 haftal k bir zaman diliminde yo un bak m hastalar ndan izole edilen ve amikasin duyarl l n n orta olmas d - fl nda tüm antipsödomonal antibiyotiklere dirençli bulunan 8 P. aeruginosa izolat n n birbirleri ile benzerli i çeflitli yöntemlerle araflt r lm fl, böylelikle hem izolasyon s kl ndaki art fl n bir salg n göstergesi olup olmad n n saptanmas hem de kullan lan yöntemlerin birbirleri ile k - yaslanmas amaçlanm flt r. Çal flmaya al nan sufllar n antibiyogramlar n n benzer oldu u gözlenmifl, seftazidim ve imipenem M K 50 de erleri s - ras ile > 128 mg/l ve 32 mg/l olarak bulunmufltur. zolatlar n beta-laktamaz paternleri ise iki farkl tiptedir. Bunlardan ilkinde esas olarak pi de eri 6.2 olan bir enzim üretilmektedir. Farkl 6 hastadan izole edilen di er sufllar n ise pi 5.2, 6.4, 8.5 ve 8.7 olan beta-laktamazlar içerdi i gözlenmifltir. Literatürde bildirilenden biraz daha düflük bulunmakla birlikte pi 5.2 olan enzimin Türkiye kökenli sufllarda görülebilen PER-1 enzimi; pi 6.2 ve 6.4 olan enzimlerin ise yine geniflle- Tablo 1. Pseudomonas aeruginosa Sufllar n n Duyarl l k, PFGE ve IEF Sonuçlar. M K (µg/ml) zolat no CAZ IMP MEM CTX CIP PFGE IEF > I 5.2, 6.4, > I 5.2, 6.4, > > IIa < I 5.2, 6.4, > > II > > I 5.2, 6.4, > > I 5.2, 6.4, > > Ia 5.2, 6.4, > > I 5.2, 6.4, CAZ: Seftazidim, IMP: mipenem, MEM: Meropenem, CTX: Sefotaksim, CIP: Siprofloksasin. Hastane nfeksiyonlar Dergisi 2002; 6: 2 89

4 Gülay Z, Öktem MA, Toklu T, Yüce A. Yo un Bak m Ünitesinde Ço ul Dirençli Pseudomonas aeruginosa ya Resim 1. Pseudomonas aeruginosa Sufllar n n Beta-Laktamazlar (izolat no: , , , , , , , , ) Resim 2. zolatlar n PFGE Paternleri (izolat no: , , , , , , , , ). mifl spektrumlu beta-laktamlara etkili OXA tipi enzimler olabilece i düflünülmüfltür (18-20). Ayr ca çal flmam zda, enzimlerle ilgili olarak miktar ve DNA dizgi tayinleri yap lmam fl olmas na ra men, IEF deki bantlar n yo unlu u incelendi inde sufllar n ço unlu u taraf ndan üretilen pi olan enzimlerin oldukça aktif oldu u gözlenmifltir. Bu enzimlerin karbapenem direncinden sorumlu kromozomal enzimler olabilece i düflünülmüfltür. Senda ve arkadafllar da, P. aeruginosa sufllar nda karbapenem direncini inceledikleri çal flmalar nda, karbapenemaz niteli indeki IMP-1 enziminin (pi 9.5) bulunmad imipenem dirençli sufllarda, bu direncin kromozomal enzimlerin afl r üretiminden kaynakland n belirtmektedir (21). Sufllar n PFGE sonuçlar incelendi inde, beta-laktamaz profilleri ile uyumlu olarak iki ayr patern saptanm flt r. Sufllar n ço unda (7 sufl) I ve Ia paterni gözlendi i için dirençli suflun klonal yay l m düflünülmüfltür. Hastanemiz, 724 yatakl bir üniversite hastanesi olup, anesteziyoloji ve reanimasyon ünitesi yo un bak m nda 11 yatak bulunmaktad r. Ocak 1997-Haziran 1997 tarihleri aras nda bu ünitede yatan hastalar n çeflitli örneklerinden amikasin d fl ndaki tüm antipsödomonal ajanlara dirençli 17 P. aeruginosa suflu izole edilmifltir. May s ay nda daha önce sözü edilen 1 haftal k zaman diliminde izolat say s n n çok artt ve ünitede yatan hastalar n 7 (%64) sini etkiledi i gözlenmifltir. Çal flmam zda bu hastalardan elde edilen izolatlar n klonal yak nl de erlendirilmifltir. Laboratuvar kay tlar n n retrospektif incelenmesinde de ayn ünitede benzer özellikteki izolatlar n 1996 bafl ndan beri ayda bir izolat s kl nda üredi i, 1997 y l bafl ndan itibaren s kl n ayda 2-3 olacak flekilde artt belirlenmifltir. Bu dönemlerde olgu tan m, tan mlama ve sürveyans teknikleri ile ilgili bir de ifliklik yap lmam flt r. Erken dönemde fark edilmesi nedeniyle çal flmam zda bildirdi imiz yay l m, el y kama ve bariyer önlemlerinin artt r lmas ve kontrolü ile önlenmifl, izolat say s endemik düzeye (0-1 izolat/ay) inmifltir. Bu endemik dönemde izole edilen sufllar n da önceki sufllar gibi yine tüm antipsödomonallere dirençli oldu u gözlenmifltir. Bir baflka deyiflle, endemik dönem izolatlar n n antibiyotik duyarl l k paternleri incelenen dönemdeki izolatlarla ayn d r. Salg n düflünülen dö- 90 Hastane nfeksiyonlar Dergisi 2002; 6: 2

5 Yo un Bak m Ünitesinde Ço ul Dirençli Pseudomonas aeruginosa ya Gülay Z, Öktem MA, Toklu T, Yüce A. nemde, personelden ve ortamdan tarama kültürleri yap lmas na ra men benzer antibiyotik paterninde bir sufl izole edilmemifltir. Bu nedenle kesin kaynak saptanamam flt r. Ancak, el y kama önlemleri ile yay l m n kontrol alt na al nmas yay l m n personelin elleri arac l yla olabilece ini düflündürmüfltür. Teknik nedenlerle endemik dönemdeki izolatlarda PFGE uygulanamam fl bu nedenle de salg n klonlar ile karfl laflt r lmas mümkün olmam flt r. Sonuç olarak, çevre flartlar n n uygunlu u ve hastalar n klinik özellikleri nedeniyle, yo un bak m ünitelerinde çoklu dirençli mikroorganizmalarla salg nlar oluflabilmektedir. Burada sunulan olguda görüldü ü gibi, klinik mikrobiyoloji laboratuvarlar nda antibiyotipleri benzer bakterilerin normalden yüksek s kl kta izole edilmesi böyle bir salg n aç s ndan uyar c olabilmektedir. Ancak, izolatlar n ayn köken olup olmad n n saptanmas nda antibiyotik duyarl l klar yan s ra PFGE ile DNA analizi gibi genotipik yöntemlerin kullan lmas gereklidir. KAYNAKLAR 1. Hancock REW. Resistance mechanisms in Pseudomonas aeruginosa and other nonfermentative gramnegative bacteria. Clin Infect Dis 1998;27(Suppl 1): Pollack M. Pseudomonas aeruginosa. In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (eds). Principles and Practice of Infectious Diseases. New York: Churchill Livingstone, 1995: Wolff M, Brun-Buisson C, Lode H, Mathai D, Lewi D, Pittet D. The changing epidemiology of severe infections in the ICU. Clin Microbiol Infect Dis 1997;3(Suppl 1): National Committee for Clinical Laboratory Standarts. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. 4 th ed. Approved standart, M7-A4, Wayne Pa National Committee for Clinical Laboratory Standarts. Performance standarts for antimicrobial disk susceptibility tests. 6 th ed. Approved standart, M2-A6, Wayne Pa Shanahan PMA, Thomson CJ, Amyes SGB. Betalactam resistance in aerobic commensal faecal flora. Int J Antimicrob Agents 1994;3: Maslow J, Slutsky AM, Arbeit RD. The application of pulsed field gel electrophoresis to molecular epidemiology. In: Persing DH, et al (eds). Diagnostic Molecular Microbiology; Principles and Applications. Washington DC: ASM Press, 1993: Tenover RC, Arbeit RD, Goering RV, et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed field gel electrophoresis criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 1995; 33: Harris A, Torres-Viera C, Venkataraman L, de Girolami P, Samore M, Carmeli Y. Epidemiology and clinical outcomes of patients with multiresistant Pseudomonas aeruginosa. Clin Infect Dis 1999;28: Hsueh PR, Teng LJ, Yang PC, Ho SW, Luh KT. Persistance of a multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa clone in an intensive care burn unit. J Clin Microbiol 1998;36: Chen HY, Yuan M, Livermore DM. Mechanisms of resistance to beta-lactam antibiotics amongst Pseudomonas aeruginosa isolates collected in UK in J Med Microbiol 1995;43: Nordmann P, Ronco E, Naas T, Duport C, Michel- Briand Y, Labia R. Characterization of a novel extended spectrum beta-lactamase from Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 1993; 37: Marchandin H, Jean-Pierre H, de Champs C, et al. Production of a TEM-24 plasmid mediated extended spectrum beta-lactamase by a clinical isolate of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 2000;44: Naas T, Philippon L, Poirel L, Ronco E, Nordmann P. An SHV-derived extended spectrum beta-lactamase in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 1999;43: Büscher KH, Callman W, Dick W, Opferkuch W. Imipenem resistance in Pseudomonas aeruginosa resulting from diminished expression of an outer membrane protein. Antimicrob Agents Chemother 1987;31: Köhler T, Hamzehpour MM, Epp SF, Pechere JC. Carbapenem activities against Pseudomonas aeruginosa: Respective contributions of OprD and efflux systems. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43: Quinn JP. Imipenem resistance among gram-negative bacilli. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994; 13: Vahabo lu H, Öztürk R, Aygün F, et al. Widespread detection of PER-1 type extended spectrum beta-lactamases among nosocomial Acinetobacter and Pseudomonas aeruginosa isolates in Turkey: A nation wide multi-center study. Antimicrob Agents Chemother 1997;41: Hall LMC, Livermore DM, Gür D, Akova M, Akal n HE. OXA-11 an extended spectrum variant of OXA- 10 beta-lactamase from Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 1993;37: Danel F, Hall LMC, Gür D, Livermore DM. OXA-14 another extended spectrum variant of OXA-10 (PSE-2) beta-lactamase from Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 1995;39: Senda K, Arakawa Y, Nakashima K, et al. Multifocal outbreaks of metallo-beta-lactamase producing Pseudomonas aeruginosa resistant to broad spectrum beta-lactams, including carbapenems. Antimicrob Agents Chemother 1996;40: YAZIfiMA ADRES Doç. Dr. Zeynep GÜLAY Dokuz Eylül Üniversitesi T p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal nciralt - ZM R Makalenin Gelifl Tarihi: Kabul Tarihi: Hastane nfeksiyonlar Dergisi 2002; 6: 2 91