F. Ferda Tunçkanat Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Ebat: px
Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "F. Ferda Tunçkanat Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı"

Transkript

1 Deri ve Yumuşak Doku Örneklerinin Laboratuvarda Değerlendirilmesi F. Ferda Tunçkanat Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı 1

2 Örneklerin Laboratuvarda Değerlendirilmesi Örneklerin kabulü Örneklerin işlenmesi Direkt inceleme Kültür Aerop Kültürlerin değerlendirilmesi Bakterilerin tanımlanması Anaerop Anaerop duyarlılık testleri uygulama endikasyonları 2

3 Örneklerin Kabulü Laboratuvara Ulaşan Örnekler Aspirasyon materyali (doku sıvısı, derinden alınan püy, apse materyali) Drenaj materyali (apse örnekleri) Doku örnekleri Sürüntü örnekleri Sürüntü örnekleri genellikle etken mikroorganizmaları yansıtmaz 3

4 Örneklerin Kabulü Ret Kriterleri Genel ret kriterleri Etiket bilgileri yok veya eksik Uygun şekilde alınmamış örnekler (anaerop kültür) Laboratuvara uygun koşullarda ulaştırılmamış örnekler Kurumuş eküvyon, formalin içinde doku örnekleri..vb Örnek kalitesinin yetersiz olması Sürüntü örneklerinin direkt incelemesinde bol miktarda skuamöz epitel hücrelerinin görülmesi Anaerop örnekler için işlemler tiyoglikolat besiyerinde yapılır 4

5 Örneklerin Kabulü Ret KriterleriKriterleri- Anaerop bakteriler Aspirasyon materyali Laboratuvara iletilme süresi < 1 ml ~ 1 ml > 2 ml 10 dk 30 dk 2-3 st (8-24 st.e kadar) Doku örnekleri Steril kapta Anaerop ortam, transport by.de Anaerop eküvyon Tüpte, nemli anaerop atmosferde Anaerop transport by.de 30 dk 2-3 st 1 st 2-3 st 5 Isenberg HD, Garcia LS (eds), Clinical Microbiology Procedures Handbook , 3rd ed. ASM press, Washington D.C.

6 Örneklerin İşlenmesi Örnekler işlem yapılıncaya kadar oda sıcaklığında bekletilmelidir Fazla miktarda non-pürülan materyal santrifüj edilir Pürülansı çok fazla örnekler vortekslenir Doku örnekleri 1 ml sıvı besiyerinde ezilir Eküvyon 0,5 ml sıvı besiyerinde iyice çalkalanıp, eküvyondaki fazla sıvı akıtılır 6

7 Direkt İnceleme Makroskopik Makroskopik inceleme: Pürülans Kan ve nekrotik doku Kötü koku Sülfür granülleri 7

8 Direkt İnceleme Mikroskopik Mikroskopik inceleme amaçları Örnek kalitesinin değerlendirilmesi (özellikle sürüntü örnekleri için) Enfeksiyon varlığı ve etken mikroorganizmalara ilişkin bilgi sağlaması (PMNL+mikroorganizma) Kültür yöntemlerinin seçilmesinde / kültür sonuçlarının yorumlanmasında yol gösterici olması Gerektiği durumlarda klinisyenin yönlendirilmesi 8

9 Olgu 1 Soru -Kültür için gönderilen örneğin Gram yaymasında epitel hücresi görülmüyor, elastin fibrilleri ve gram pozitif koklar, çok nadir lökosit izleniyor. Ne düşünelim- enfeksiyon? kolonizasyon? Enfeksiyon!!! Elastin fibrilleri nekroz göstergesi 9

10 Olgu--2 Olgu Soru 1-Travmaya sekonder gelişen ve hızla ilerleyen selülit olgusundan aerop kültür için gönderilen örneğin Gram yaymasında PMNL ve iri gram pozitif sporsuz basiller izleniyor. Ne düşünelim? Klinisyeni nasıl yönlendirelim? C.perfringens? Klinisyen acil olarak yayma sonucundan haberdar edilmeli En kısa sürede anaerop kültür için yeni örnek istenmeli 10

11 11

12 12

13 13

14 PMNL + mikst bakteri görünümü ANAEROP ENFEKSİYON 14 14

15 ANAEROP ENFEKSİYON 15

16 Kültür Aerop kültür Anaerop kültür Gerektiğinde Aerop kültür isteği yapılmamış olsa bile örnekler aerop olarak da ekilmelidir 16

17 Kültür Aerop kültür Besiyerleri Seçici olmayan zengin besiyeri (% 5 kanlı agar) Seçici besiyeri (McConkey, EMB, Endo) Diğer (gerekirse) (Çikolata, Löwenstein-Jensen, SDA..) Normal atmosfer % 5-10 karbondioksit (gerektiğinde) 17

18 Kültür Aerop kültür kültür--değerlendirme Değerlendirmede önemli noktalar Örnekten üreyebilecek mikroorganizmalara ilişkin bilgi sahibi olunması Gram yayma bulgularının dikkate alınması Mikroorganizmaların göreli olarak üreme yoğunluğu Potansiyel patojenlerin, normal flora üyelerinden ve/veya kolonize eden mikroorganizmalardan ayırdedilmesi önemli 18

19 Kültür Aerop kültür kültür--tanımlama Klasik yöntemler Koloni özellikleri Gram boyama Katalaz Koagülaz Oksidaz testi Biyokimyasal testler ve diğerleri Otomatize sistemler 19

20 Kültür Anerop kültür Anaerop besiyerleri Besiyerleri, * Hemin ve vitamin K ile zenginleştirilir * Günlük hazırlanmalıdır Anaerop atmosfer 20

21 Kültür Anerop kültür Anaerop besiyerleri Katı besiyerleri Sıvı besiyerleri Genel üretim besiyerleri (anaerop kanlı agar) Tiyoglikolat besiyeri veya kıymalı besiyeri Schaedler agar,brucella agar, BHIA, Columbia.. (% 5 koyun kanı) Seçici ve tanımlayıcı besiyerleri Fenil etil alkol (FEA) agar Bacteroides safra eskülin (BSE)agar Kanamisin-vankomisin lize kanlı (KVLK) agar 21

22 Soru Tiyoglikolat besiyerini ne şekilde değerlendirelim, ne kadar süre ve hangi ortamda bekletelim? Anaerop katı besiyerinde üreme (+) tiyoglikolat besiyerini değerlendirmeye gerek yok. Katı besiyerinde üreme (tiyoglikolata dönülüp, bütün işlemler tekrarlanır (aerop kültür (+) olsa bile) Katı besiyerinde üreme (-) aerop kültür (-), tiyoglikolatta gözle görülür üreme (-anaerop pasaj 22

23 Kültür Anerop kültür Anaerop atmosfer Anaerop atmosfer % N2, %5-10 H2, %5-10 CO2 Anaerop kavanoz Sulu sistem- GasPak Kuru sistem-aneorogen Anaerop kabin 23

24 Anaerop kavanoz sistemleri 37 oc de en az 48 saat Bazı türler için 2 haftaya kadar inkübasyon İ 24

25 Anaerop kabin 24 Saatte üreme kontrol edilir 25

26 Kültür Anerop kültür kültür--değerlendirme Eş zamanlı yapılan aerop kültür ile karşılaştırma Seçici besiyerlerinin değerlendirilmesi Aerotolerans testi 26

27 Kültür Anerop kültür kültür--değerlendirme Eş zamanlı yapılan aerop kültür ile karşılaştırma Aerop Anaerop 27

28 Kültür Anerop kültür kültür--değerlendirme Seçici besiyerlerinin değerlendirilmesi FEA agar Fakültatif bakterileri baskılar Kolonilerin yayılmasını önler 28

29 Kültür Anerop kültür kültür--değerlendirme Seçici besiyerleri BSE agar >1 mm siyah koloniler Bacteroides fragilis grubu Safraya dirençli diğer bakteriler Bilophila wadsworthia, Sutterella wadsworthensis, Alistipes türleri, enterokoklar 29

30 Kültür Anerop kültür kültür--değerlendirme Seçici besiyerleri KVLK agar Gram pozitif bakteriler, enterikleri baskılayıcı etki Bacteroides, Prevotella, Alistipes ve bazı Fusobacterium türleri ürer. Porphyromonas türleri üreyemez (vankomisine duyarlı) Pigmentli Prevotella türlerinin pigment oluşturmasını 30

31 31 Kültür Anerop kültür kültür--değerlendirme Aerotolerans testi Anaerop kanlı agarda üreyen her farklı koloniden pasaj yapılır Anaerop ortamda 48 saat Anaerop kanlı agara %5-10 CO2 li ortamda saat Çikolata besiyerine Anaerop kanlı agarda üreme var Çikolata besiyerinde üreme yok Anaerop bakteri 31

32 Çikolata besiyeri Aerotolerans test Anaerop kanlı agar 32

33 Anaerop kanlı agar 33 Aerotolerans test Çikolata agar 33

34 Kültür Anaerop kültür kültür--tanımlama Klasik yöntemler Yarı otomatize sistemler Moleküler yöntemler (16SrRNA) Gaz likit kromatografi, yağ asiti analizi MALDI-TOF 34

35 Kültür Anaerop kültür kültür--tanımlama Klasik yöntemler Koloni morfolojisi Gram boyama Uzun dalga boyu UV altında (366 nm) floresans Tanımlama disklerine duyarlılık Katalaz Spot indol Lesitinaz, lipaz Nitrat, üreaz, diğer 35

36 Pophyromonas gingivalis Fusobacterium nucleatum Prevotella intermedia F. necrophorum F. mortiferum 36

37 Bacteroides fragilis Actinomyces israelii Campylobacter ureolyticus Actinomyces odontolyticus 37

38 Kültür Anaerop kültür kültür--tanımlama Klasik yöntemler Koloni morfolojisi Gram boyama Uzun dalga boyu UV altında (366 nm) floresans Tanımlama disklerine duyarlılık Katalaz Spot indol Lesitinaz, lipaz Nitrat, üreaz, diğer Metanol ile hızlı fiksasyon 38

39 Bacteroides fragilis Fusobacterium nucleatum Prevotella F. mortiferum 39

40 C. tetani Actinomyces C.perfringens 40 Propionibacterium acnes

41 Kültür Anaerop kültür-tanımlama Klasik yöntemler Koloni morfolojisi Gram boyama Uzun dalga boyu UV altında (366 nm) floresans Tanımlama disklerine duyarlılık Primer plaklar/ subkültürler Katalaz Spot indol Lesitinaz, lipaz Diğer 41

42 Porphyromonas gingivalis 42

43 43

44 Kültür Anaerop kültür-tanımlama Klasik yöntemler Koloni morfolojisi Gram boyama Uzun dalga boyu UV altında (366 nm) floresans Tanımlama disklerine duyarlılık Katalaz Spot indol Lesitinaz, lipaz Diğer Anaerop gram negatif basiller 44

45 Kanamisin (1000 μg) Vankomisin (5 μg) Kolistin (10 μg) Bacteroides fragilis 45

46 Prevotella intermedia 46

47 Kültür Anaerop kültür-tanımlama Klasik yöntemler Koloni morfolojisi Gram boyama Uzun dalga boyu UV altında (366 nm) floresans Tanımlama disklerine duyarlılık Katalaz Spot indol Lesitinaz, lipaz Diğer % 15 hidrojen peroksit p-dimethyaminocinnamadehyde (DMACA) Yumurta sarılı agar 47

48 Spot indol testi 48

49 Yumurta sarılı agarda lesitinaz ve lipaz aktiviteleri Lesitinaz Lipaz 49

50 Olgu--2 Olgu Soru 2- Bu olgunun aerop kültüründe üreme olmadı. Anaerop kanlı agarda hemolitik koloniler üredi. Tanımlama??? Aerotolerans testi? Kanlı agarda çift hemoliz zonu Hareket ø Spor ø Katalaz (-) Spot indol (-) Lesitinaz (+) 50

51 Kültür Anaerop kültür-tanımlama Klasik yöntemler Yarı otomatize sistemler Biyokimyasal sistemler: Bir gece inkübasyonu gerektirir (API 20A, AN Mikroplak) Hızlı enzimatik sistemler: Bir gece inkübasyon gerekmez. Birkaç saatte sonuç verirler (Rapid ID 32A, Crystal ANR ID) Moleküler yöntemler (16SrRNA) Gaz likit kromatografi, yağ asiti analizi MALDI-TOF 51

52 Anaerop duyarlılık testleri Rutin olarak uygulanması önerilmemekte Uygulama endikasyonları Ciddi ve yaşamı tehdit eden enfeksiyonlarda tedavinin yönlendirilmesi Belirli merkezlerde / bölgelerde belirli aralıklarla duyarlılık paternlerinin saptanarak izlenmesi Yeni antibiyotiklere duyarlılıkların saptanması 52

53 Duyarlılık testlerinin uygulanmasın ygulanmasınaa karar verilirken dikkat edilecek noktalar Örnek alınırken normal flora ile kontaminasyon söz konusu ise, duyarlılık testlerinin uygulanması tedaviyi yanlış yönlendirir Patojen olma potansiyeli olan birden fazla bakteri izole edildiğinde duyarlılık testlerinin Dirençli olduğu bilinen Bakterileri kapsaması gerekir Bacteroides türlerini Yüksek virülanslı mutlaka kapsamalıdır 53

54 Sonuç Deri ve yumuşak doku örneklerinin mikrobiyolojik incelemesinde ve sonuçların değerlendirilmesinde önemli noktalar Örneğin nereden alındığının bilinmesi Doğrudan mikroskopik incelemenin yapılması Uygun kültür yöntemlerinin seçilmesi Etken olan bakteri yorumunun yapılabilmesi 54