Termofilik Bakteri İzolatlarının Antibakteriyal Aktivite Spektrumları ve 16S rrna Dizi Analizi ile Tanılanmaları

Transkript

1 Araştırma Makalesi Termofilik Bakteri İzolatlarının Antibakteriyal Aktivite Spektrumları ve 16S rrna Dizi Analizi ile Tanılanmaları Gamze BAŞBÜLBÜL 1*, H.Halil BIYIK 1 1. Adnan Menderes Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, AYDIN- TÜRKİYE * gbasbulbul@adu.edu.tr Özet: Bu çalışmada, Aydın, Denizli ve Muğla illerindeki çeşitli sıcak su kaynakları, termal çamur ve toprak örneklerinden izole edilen termofilik bakterilerde antibakteriyal aktivite taraması yapılmıştır. İzole edilen 201 termofilik bakteriden, Geobacillus stearothermophilus DSMZ 22 bakterisine karşı inhibitör etki gösteren 13 tanesinin antibakteriyal aktivite spektrumu ve 16S rrna gen bölgelerinin kısmi dizi analizleri belirlenmiştir. Sekanslar kullanılarak GenBankasında yer alan diğer termofilik türlerle dizi benzerlikleri karşılaştırılmıştır. İzolatların en yüksek homoloji gösterdiği termofilik bakteri türleri Geobacillus toebii (2), Anoxybacillus flavithermus (2), Geobacillus pallidus (5), Geobacillus thermodenitrificans (2) ve Geobacillus caldoxylosilyticus (1), Anoxybacillus kestanboliensis (1) olarak saptanmıştır. Anahtar kelimeler: 16S rrna, Anoxybacillus, Antibakteriyal madde, Geobacillus, termofilik bakteri, Antibacterial Activity Spectra of Thermophilic Bacterial Isolates and Their Identification by Using 16S rrna Sequence Analysis Abstract: In this study, antibacterial activity screening of thermophilic bacteria isolated from various hot springs, thermal mud and soil samples collected around the cities of Aydın, Denizli and Muğla, Turkey was achieved. Of the total 201 thermophilic bacteria isolated, partial 16S rrna sequence analysis and antibacterial activity spectra determination were carried out for 13 of them those showed inhibitory effect against Geobacillus stearothermophilus DSMZ 22. These sequences were then compared with the reference strains of thermophilic bacteria held in Genbank. The thermophilic species those had the highest similarity with the isolates were Geobacillus toebii (2), Anoxybacillus flavithermus (2), G. pallidus (5), G. thermodenitrificans (2) and G. caldoxylosilyticus (1), A. kestanboliensis (1). Keywords: 16S rrna, Anoxybacillus, Antibacterial substance, Geobacillus, thermophilic bacteria. Giriş Prokaryotlar tarafından üretilen ve pek çok alanda kullanım potansiyeli taşıyan ürünlerden bir tanesi de antimikrobiyal ürünlerdir. Genel anlamıyla antibiyotikler, bir organizma tarafından üretilen ve diğer bazı organizmaların gelişimi açısından zararlı kimyasallar olarak düşünülebilirler. Fakat, pratik anlamda antibiyotikler, nispeten düşük konsantrasyonlarda gelişimi önleyen sekonder metabolitlerdir. Bu özellikleriyle, amonyak, organik asitler ve hidrojen peroksitler gibi metabolik yan ürünlerden farklıdırlar. Bakteriyosinler ise, enfeksiyona karşı, klasik anlamda bir koruyuculukları olmasa da aynı çevrede bulunan bakterilerin, diğer bakterileri öldürerek, besin için rekabet etmesinde avantaj sağlarlar (Hancock ve Diamond 2000). Bu çalışmanın bir bölümü Biyoloji Eğitiminde Evrim 2007 sempozyumunda poster olarak sunulmuştur

2 Günümüzde patojen bakterilerin antibiyotiklere karşı direçlerinin artması halk sağlığı açısından oldukça problem oluşturmaktadır. Hastanelerde enfeksiyona neden olan bakterilerin %70 i tedavilerde en çok kullanılan ilaçlardan en az bir tanesine dirençlidir ve yeni antibiyotiklerin araştırılması devam etmektedir (Todar 2009). Gıda sanayinde ise, üretim, işleme ve gıdaların korunması ile ilgili teknolojik gelişmeler günümüzde oldukça gelişmiş olmasına rağmen, gıdaların bozulması ve gıda kaynaklı hastalıklar henüz tam anlamıyla önlenememiştir. Gıda bilimindeki pek çok araştırma, yeni koruma teknolojilerinin geliştirilmesi üzerine yoğunlaşmıştır, fakat bunlardan pek azı endüstriyel anlamda kullanılabilir hale getirilmiştir (Galvez ve ark. 2007). Mikroorganizmalar, antimikrobiyal madde üretimi açısından hala başlıca kaynakları oluşturmaktadırlar. Fakat, gelişen teknolojiye rağmen, varolan mikroorganizmalar yeni, etkili antimikrobiyal bileşikler açısından yetersiz kalmaktadırlar. Bu sebeplerden dolayı, etkili antagonistik kaynaklar için yeni mikroorganizmaların tanımlanmasına aciliyetle ihtiyaç duyulmaktadır (Horikoshi 1995). Ekstremofil mikroorganizmalar arasında yer alan termofilik bakteriler, özellikle ısıya dayanıklı pek çok enzimleri ve metabolitlerinden dolayı günümüz için oldukça potansiyel bir kaynaktır. Literatürde mezofilik bakterilerin özellikle laktik asit bakterilerinin ürettikleri antibiyotiklere dair pek çok veri olmasına rağmen, termofilik türlerle yapılan bu tür araştırmalar nispeten nadirdir. Çalışmamızda çeşitli sıcaksu kaynakları, birikinti ve toprak örneklerinden termofilik bakteri izolasyonu, antibakteriyal etki taraması ve inhibitör özelliği olan izolatların tanılanması gerçekleştirilmiştir. Materyal ve Yöntem Termofilik bakterilerin izolasyonu Termofilik bakterileri izole etmek amacıyla Denizli, Aydın ve Muğla illerindeki toplam 20 istasyondan su, birikinti ve toprak örnekleri alınmıştır (Çizelge 1). Örnekler alınırken, ph metre (WTW, Multiline P4) ile suyun sıcaklığı ve ph sı ölçülerek su örnekleri ml lik steril koyu renkli şişelere, toprak örnekleri steril poşetlere, birikintiler ise steril kaplara aktarılmıştır. Örneklerden zenginleştirme amacıyla sıvı Thermus ortamlarına inokule edilmiştir. Su örneklerinden 5 ml alınarak, 250 ml lik erlenlerde bulunan steril 45 ml Thermus ortamlarına; toprak, çamur ve birikinti örneklerinden ise steril spatül ile alınarak aynı şekilde hazırlanmış sıvı Thermus ortamlarına ekim yapılmıştır. İnokule edilen erlenler inkübatörde (Selecta, Spain) termofilik bakterilerin seçimi için 65 C de 48 saat inkübe edilmiştir. 48 saat inkübasyondan sonra erlenlerde gelişen kültürlerden steril distile suda 10-4 e kadar seyreltmeler hazırlanarak bu seyreltmelerden 1 ml alınmış ve 45 C ye kadar soğutulmuş Caso Agar ile karıştırılarak dökme plaka yöntemi ile ekim yapılmıştır. Petriler 65 C de 24 saat inkübe edildikten sonra Caso Agar ortamında gelişen karışık kültürlerden, her seferinde özeyi yakarak izolatların saf kültürleri elde edilmiştir. Bu amaçla kolonilerden en az iki kez saflaştırma yapılmıştır

3 Çizelge 1. Örneklerin alındığı istasyonlar İstasyon Sıcaklık ph Ortakçı (Aydın) 48 C 7,5 İmamköy-Ilıca (Aydın) 35 C 6,4 Kuşadası-Sümerbank mevkii (Aydın) 23 C 6,8 Kuşadası-Radon kaplıcası (Aydın) 42 C 6,2 Alangüllü (Aydın)1. İstasyon 73 C 6,8 Alangüllü (Aydın) 2. İst. 50 C 6,7 Alangüllü (Aydın) 3. İst. 50 C 7,4 Ortaklar-Gümüş kaplıcası (Aydın) 37 C 6,5 Kızıldere (Denizli) 1. İst. 45 C 7,0 Kızıldere (Denizli) 2. İst. 82 C 7,0 Kızıldere (Denizli) 3. İst. 40 C 6,9 Gölemezli (Denizli)1. İst 55 C 7,1 Gölemezli (Denizli) 2. İst 42 C 7,1 Kabaağaç (Denizli) 1. İst. 56 C 6,7 Kabaağaç (Denizli) 2. İst. 48 C 6,7 Karahayıt (Denizli) 55 C 6,7 Pamukkale (Denizli) 35 C 6,7 Yenice (Denizli) 1. İst. 55 C 7,2 Yenice (Denizli) 2. İst. 55 C 7,0 Dalyan (Muğla) 38 C 6,4 İzolatlardan antibakteriyal aktivite taraması İzolatların antimikrobiyal madde üretimi araştırılırken indikatör mikroorganizma olarak Geobacillus stearothermophilus DSMZ 22 suşu kullanılmıştır. Ön tarama amacıyla Martirani ve ark (2002), tarafından kullanılan metot kısmen modifiye edilmiştir. Caso Agar plaklarına steril kürdanla izolatların skim milkdeki kültürlerinden çizgi ekimler yapılarak plaklar, 65 ºC de 24 saat inkübe edilmiştir. Ertesi gün plaklar, UV cihazı (UVP-UVGL-58) kullanılarak 15 dakika 254 nm UV ye maruz bırakılmıştır. UV uygulanan plakların üzerine 45 ºC ye kadar soğutulmuş ve içerisine indikatör suş eklenmiş soft Caso Agar dökülmüştür. İndikatör suşun yoğunluğu 0.5 MacFarland standardına (10 8 cfu/ml) gore ayarlanarak bu süspansiyondan soft agara 100 µl eklenmiştir. Plaklar G. stearothermophilus DSMZ 22 suşu için 55 ºC de, yaklaşık 18 saat inkübe edilmiştir. G. stearothermophilus DSMZ 22 suşuna karşı etkin bulunan bakteriler, Bacillus sp., Bacillus sphaericus DSM 396, Bacillus cereus ATCC 11778, Bacillus thrungiensis, Bacillus mycoides DSM 299, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Micrococcus luteus ATCC 9341, Streptococcus - 3 -

4 vestibularis DSM 5636, Lactobacillus plantarum DSM 20174, Enterococcus faecalis ATCC ve Listeria sp. bakterilerine karşı aynı yöntemle denenmiştir ve plaklar bakterilerin optimum gelişim sıcaklığında saat inkübe edilmiştir. İnkübasyondan sonra, izolatların petrideki kültürleri etrafında oluşan zonlara göre değerlendirme yapılmıştır. Güçlü antimikrobiyal aktivite, +++; orta derecede antimikrobiyal aktivite ++, zayıf antimikrobiyal aktivite + olarak değerlendirilmiştir. 16S rrna dizi analizi 16S rrna dizi analizini yapabilmek için öncelikle izolatların genomik DNA ları fenolkloroform yöntemiyle izole edilmiştir (Ronimus ve ark. 1997). Genomik DNA lar izole edildikten sonra 341F (5 -CCT ACG GGA GGC AGC AG3 ) - 985R (5 GTA AGG TTC TTC GCG TT 3 ) primerleri kullanılarak 16S rrna geni PCR ile çoğaltılmıştır. PCR reaksiyonu karışımı 100 µl için Taq buffer (10X) 10 µl, dntp (10 mm) 2 µl, MgCl 2 (25 mm) 8 µl, Primer (100 mm) 0,4 µl, Taq polimeraz 0,6 µl, steril distile su 79 µl olacak şekilde hazırlanmıştır. PCR tüplerine karışımdan 30 µl dağıtılmış ve 2 µl DNA eklenmiştir. Tüm amplifikasyon koşulları 94 ºC de 5 dakikalık ön denaturasyon, 94 ºC de 30 sn denaturasyon, 50 ºC de 30 sn bağlanma ve 72 ºC de 10 sn uzamadan oluşan 35 siklusluk amplifikasyon ve 72 ºC de 15 dakikalık final uzamadan oluşacak şekilde programlanmıştır (Techne TC-3000). Tüm sekans işlemlerinde sekanslanacak genler standart protokollere göre saflaştırılarak, Macrogen (Kore) de, (ABİ 3730 XL) sekans cihazında dizi analizi yaptırılmıştır. Sekanslar gen bankası ( adresinde yer alan Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn) programı kullanılarak karşılaştırılmış ve homolojiler belirlenmiştir. Bulgular ve Tartışma Aydın, Muğla ve Denizli illerinde bulunan sıcak su kaynakları, termal çamur ve birikinti örnekleri ve toprak örneklerinden toplam 201 adet termofilik bakteri suşu izole edilmiştir. İzolatlara ADÜ Biyoloji Bölümü Mikrobiyoloji stoklarında HBB kodlu numaralar verilerek tümü % 20 lik skim milk içeren cryotüplerde (-80) ºC de muhafaza edilmiştir. Termofilik izolatların büyük çoğunluğunu çamur, çamur havuzları ve birikinti örneklerinden izole edilenler oluşturmaktadır (%61). Toprak örneklerinden izole edilen termofilik suşlar, genel toplamın %31 ini oluşturmakta ve bunu su örneklerinden izole edilenler izlemektedir (%8). İndikatör bakteri olarak kullanılan G. stearothermophilus DSMZ 22 bakterisi, 55 C de gelişen ve konserve gıdalarda bozulmaya neden olan termofilik bir bakteridir. Bu bakteriye karşı antagonistik özelliği olan izolatların diğer bakterilere karşı etkinliği araştırılmış ve izolatların en az bir bakteriye karşı etkili olduğu bulunmuştur (Çizelge 2). Hassas bakteriler arasında Enterococcus faecalis, Listeria sp. Bacillus cereus gibi bakterilerin bulunması, bu izolatların patojenlerle veya gıdalardaki saprofitlerle mücadelede kullanılmak üzere araştırılması gerektiğini göstermektedir

5 Antibakteriyal etki gösteren 13 izolatın boyama sonuçlarına göre tümü Gram pozitif çubuk morfolojide bakterilerdir. Çizelge 2. İzolatların antibakteriyal etki spektrumları Test edilen bakteriler* İzolat no G.st. B.sp. B.sph. B.c. B.th. B.my. S.au. M.lu. S.ve. L.p E.fa. L.sp. HBB HBB HBB HBB HBB HBB HBB HBB HBB HBB HBB HBB HBB (*G. st: Geobacillus stearothermophilus DSMZ 22; B. sp: Bacillus sp.; B.sph: Bacillus sphaericus; B. th: Bacillus thrungiensis; B.my: Bacillus mycoides; S. au: Staphylococcus aureus; M. Lu: Micrococcus luteus; S. ve: Streptococcus vestibularis; L.pl: Lactobacillus plantarum; E. fa: Enterococcus faecalis; L. sp: Listeria sp) 16S rrna dizi analizi sonuçlarına göre, izolatlar en yüksek Geobacillus toebii (2), Anoxybacillus flavithermus (3), Geobacillus pallidus (5), Geobacillus thermodenitrificans (2) ve Geobacillus caldoxylosilyticus (1) türleri ile homoloji göstermişlerdir (Çizelge 3). Şu anki bilgilerimize göre bu türlerin antibakteriyal etkileri ile ilgili literatürde herhangi bir veri bulunmamaktadır ve çalışmamız bu açıdan ilk niteliktedir. Termofilik bakterilerin özellikle bakteriyosin ve bakteriyosin benzeri antibakteriyal maddeleri Geobacillus stearothermophilus, Bacillus licheniformis, Bacillus thermoleovorans ve Thermus rubens türlerindeki bakterilerde çalışılmıştır (Fikes ve ark. 1983, Becker ve ark. 1986, Martirani ve ark. 2002; Novotny ve Perry 2002, Pokusaeva ve ark. 2009)

6 Çizelge 3. Termofilik izolatların diğer termofilik türlerle olan 16S rrna dizi benzerlikleri İzolat no En yakın tür % Homoloji HBB-215 Geobacillus toebii 99 HBB-218 Geobacillus toebii 99 HBB-225 Anoxybacillus flavithermus 97 HBB-226 Anoxybacillus flavithermus 91 HBB-229 Geobacillus thermodenitrificans 92 HBB-234 Geobacillus pallidus 95 HBB-244 Geobacillus pallidus 98 HBB-245 Geobacillus pallidus 97 HBB-246 Anoxybacillus kestanboliensis 99 HBB-270 Geobacillus thermodentirificans 99 HBB-272 Geobacillus pallidus 98 HBB-283 Geobacillus caldoxylosilyticus 97 HBB-301 Geobacillus pallidus 95 Bacillus licheniformis ten izole edilen basillosin 490 ın Listeria innocua, Staphylococcus epidermidis, Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus ve Bacillus smithii gibi patojen veya gıdalarda bozulmaya neden olan bakterilere karşı etkin bir aktivite spektrumu olduğu belirlenmiştir (Martirani ve ark. 2002). Yine termofilik bir tür olan Bacillus thermoleovorans a ait iki suşun termoleovorin adı verilen bir bakteriyosin ürettikleri ve bu bakteriyosinin Salmonella thyphimurium, Branhamella catarrhalis ve Streptococcus faecalis gibi bakterilerin gelişimini engellediği bildirilmiştir (Novotny ve Perry 2002). Günümüzde varolan antibiyotiklere dirençli bakterilerin hızla gelişmesi ve gıda endüstrisi için hala doğal koruyucu maddelerin aranması sebebiyle, yeni antibakteriyal bileşiklerin araştırılması oldukça önemlidir. Termofilik, halofilik ve alkalifilik özellikte ekstremofil mikroorganizmalar metabolitleri açısından ilgi çekicidir ve bu metabolitlerin kullanım alanlarının araştırılması gereklidir. İleride bu çalışmamızda izole edilen termofilik bakterilerin daha detaylı tanılanması ve ürettikleri inhibitör maddelerin karakterizasyonunun yapılması düşünülmektedir. Teşekkür Bu çalışma TÜBİTAK (106T581) ve ADÜ-BAP (6009) tarafından desteklenmiştir. Arazi çalışmalarında ve sekans analizlerindeki yardımlarından dolayı Dr. Bülent BOZDOĞAN ve Erman ORYAŞIN a teşekkür ederiz

7 Kaynaklar Becker, R.J., Becker, D.A., Starzyk, M.J Bacteriocin like activity within the Genus Thermus. Appl. Environ. Microbiol., 52 (5): Fikes, J.D., Crabtree, B.L., Barridge, B.D Studies on the mode of action of a bacteriocin produced by Bacillus stearothermophilus. Can J Biol., 29 (11): Galvez, A., Abriouel, H., Lopez, R.L., Omar, N.B Bacteriocin-based strategies for food biopreservation. Int J Food Microbiol, 120 (1-2): Hancock, R.E., Diamond, G The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences. Trends Microbiol., 8 (9): Horikoshi, K Discovering novel bacteria with an eye to biotechnological applications. Curr. Opin. Biotechnol. 6, Martirani, L., Varcamonti, M., Naclerio, G., Felice, M.D Purification and partial characterization of bacillocin 490, a novel bacteriocin produced by a thermophilic strain of Bacillus licheniformis. Microbial cell factories 1 (1): 1-5 Novotny, J.F., Perry, J.J Characterization of bacteriocins from two strains of Bacillus thermoleovorans, a thermophilic hydrocarbon-utilizing species. Appl. Environ Microbiol, 58 (8): Pokusaeva K, Kuisiene N, Jasinskyte D, et al. Novel bacteriocins produced by Geobacillus stearothermophilus. Cent Eur J Biol , Ronimus RS, Parker LE, Morgan HW. The utilization of RAPD-PCR for identifying thermophilic and mesophilic Bacillus species. FEMS Microbiol Lett 147: 75-79,