Viral Diyare Etkenleri ve Tanı. Doç. Dr. Sevin KIRDAR Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji AD.

Transkript

1 Viral Diyare Etkenleri ve Tanı Doç. Dr. Sevin KIRDAR Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji AD.

2 Diyare ile seyreden gastroenteritler, az gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde özellikle çocuklar için önemli sağlık sorunudur. Enfeksiyöz diyarelerde etkenler göz önüne alındığında viruslar %50-70 a varan oranlarda sorumludur.

3 Diyareye neden olan viruslar son derece bulaşıcıdırlar, başlıca fekal-oral yolla bulaşırlar. Akut viral diyareler özellikle yenidoğanlarda ve çocuklarda morbidite ve mortalitenin önemli nedenleri Mortalite 5 yaş altı çocuklarda her yıl 2 milyon olup %85 i gelişmekte olan ülkelerdedir.

4 İnfeksiyöz diareye neden olan virüsler -Rotavirüsler, -Kalisivirüsler -Norovirüslar, -Sapovirüsler -Enterik adenovirüsler Adenovirus 40, 41 -Astrovirüsler

5 Akut çocukluk çağı gastroenteritlerinde; Rotavirus %10-50 arasındaki sıklıkta Enterik adenovirus: %5-15 inden sorumlu Astrovirus %2-10 unda Norovirus: tüm yaş gruplarında %4-30 arasındaki sıklıkta

6 Diğer Gastroenterit etkenleri -Torovirüs - Koronavirüs -Torovirüs -Bocavirus -Aichi virüs -Pikobirnavirüs -Enterovirus -Parechovirus etyolojik açıdan rolleri tam olarak bilinmiyor

7 ROTAVİRUS Yeni doğan ve 2 yaş altı küçük çocuklarda en yaygın viral etiyolojik ajan olarak kabul edilmekte, 1973 de elektron mikroskobisi kullanılarak saptanmıştır. İnfantil diyare yada kış diyaresi olarak da bilinmekte

8 Rotavirus -Reoviridae ailesi, Rotavirus cinsinde, zarfsız, 70 nm, kapsidi ikosahedral simetrili, -Genomu; lineer 11 segmentli, çift sarmallı bir RNA virusudur. -Memeliler ve kuşlarda enfeksiyon yapar.

9 Genom segmentlerinin her biri, en az bir viral protein, sadece 11. segment 2 protein kodlar ; Altısı yapısal VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 ve VP7 Altısı yapısal olmayan protein NSP1-6

10 -İnfektif rotavirus partikülü 3 tabakalı (triple-layered particle; TLP) 1-dış kapsid (VP4 ve VP7, nötralizan antikorlar, hücreye bağlanma ve girişten ), 2-iç kapsid (VP6, antijenik determinat, nötralizan olmayan ab. yanıtı ) 3-kor (VP1,VP2,VP3)

11 Rotavirüs sınıflaması Kapsid proteinlerinin antijenik özelliğine göre Grup Subgrup Serotiplere ayrılır.

12 VP6 proteini: grup ve subgruplamada VP6daki farklılıklara göre A,B,C,D,E,F,G ye kadar 7 grup. A,B,C insanları ve hayvanları, D,E,F,G ise hayvanlarda bulunur. VP6 antijenine göre I, II, I+II ve non Inon II olmak üzere dört subgrub. Subgrup II diğerinden daha sıktır. VP4 ve VP7 proteinleri:serotiplendirmede VP4 ile tanınanlara P serotipleri VP7 ile tanınanlara G serotipleri

13 Rotavirus sınıflandırılmasında VP4 ve VP7 tipleri ikili sistem olarak kullanılır. Alternatif olarak G ve P genotiplendirmesi (VP4 ve VP7 genom segmentlerinin dizi analizi)

14 Grup A rotaviruslarında; -23 G genotipi (G1-G23), -31 P genotipi İnsanlarda dünya genelinde rotavirus gastroenteriti ile ilişkili en yaygın genotipler G1, G2, G3, G4 ve G9 dur. İnsanlarda en yaygın P genotipleri, P[8] ve P[4] dür..

15 Dünyada beş genotip kombinasyonu insanlarda rotavirus infeksiyonlarında en sık; P1A[8]G1, P1A[8]G3, P1A[8]G4, P1B[4]G2 ve P1A[8]G9 Ülkemizde yapılan rotavirus genotiplendirme çalışmalarında en yaygın genotip ve serotipler G9P[8]

16 Epidemiyoloji Genellikle endemiktir, fakat nadiren salgınlardan sorumlu olabilir. Rotaviruslar, her yıl 2 milyondan fazla hastaneye yatışa ve yaklaşık 450 bin ölüme sebep olmaktadır. Rotavirus, beş yaş altı özellikle 6-24 ay arası çocuklarda daha sık görülür, diyare daha ağır seyirlidir.

17 Epidemiyoloji Nozokomiyal infeksiyonların %20-60 ından sorumlu. Seyahat diaresinden sorumlu (%20) İnsanlarda etkin suşların çoğu A, B ve C grubundan. - A grubu: Çocuklarda fazla, - B grubu: su orijinli epidemilerde ve Çinde - C grubu: yiyecek orijinli. Avrupa, Asya, Amerika da

18 Bulaş Fekal oral yol en önemli yol (Kontamine su ve yiyecekler) Kişiden kişiye temas (Kontamine eşya ya da yüzeylerle) Sol yolu sekresyonlarında tanımlanmış ama henüz geçiş kanıtlanmamış. İnfektivite dozu:10 virus partikülü

19 Patogenez İnce barsak epitel fonksiyonunda değişiklik Su absorsiyonunda bozulma, Su ve iyon kaybı Laktoz, glikoz ve sodyum malabsorbsiyonu SULU DİYARE Kısalmış ve küntleşmiş villuslar

20 Rotavirus diyare mekanizması 1-Virusun çoğalması ile enterosit erin dökülmesi, absobsiyon yüzeyinde azalma sonucunda su ve elektrolit kaybı ile diyare oluşumu. Olgunlaşmamış enterositlerde disakkaridaz enzimlerinde azalması, şekerlerin lümende osmatik basınçı arttırması ile sıvı kaybında artış 2-Hiperplazik kriptlerinden klor salınımında artış lümene sekresyonu arttırır. 3-Enterik sinir sisteminin uyarılması ile su ve elektrolit sekresyonunda artış olması 4-NSP4, viral enterotoksin: ER. dan Ca iyon mobilizasyonu ile hücre içi Ca miktarında artış ve klor sekresyonu uyarılır.

21 Klinik Asemptomatik,dehidratas yonla birlikte ağır diyare ve ölüm İnkübasyon süresi: 1-4 gün Hafif ateş Kusma Sulu diyare Karın ağrısı Hastalık kendi kendini sınırlamaktadır.

22 Kalisiviruslar Calisiviridae ailesinde insanlarda gastroenterit yapan iki cins bulunmaktadır. 1-Norovirus (Norwalk-like virus (NLV) 2-Sapovirus (Sapporo-like virus (SLV).

23 Norovirüsler İlk defa 1969 yılında Ohio,Norwalk şehrinde gastroenterit olgularında saptanmış, Norwalk Ajanı adı verilmiştir. Tüm yaş gruplarında epidemik gastroenteritlerin başlıca nedenlerinden biridir. En çok kontamine yiyecek ve su kaynaklı gastroenterite neden olur.

24 Norovirus Zarfsız nm ikosahedral kapsidli RNA virusu Virusun yüzeyinde 32 adet kupa (calix) şeklinde çöküntüler bulunur.

25 Genomu pozitif polariteli tek iplikli lineer RNA üç adet Open reading frame (ORF) içerir. ORF1 yapısal olmayan proteinleri ORF2 major kapsid proteini VP1 ORF3 minor kapsid proteini VP2 kodlar.

26 Sınıflandırma Noroviruslar VP1 gen analizi ile GI-V 5 genogruba ayrılır. GI ve GII çoğunlukla, GIV nadiren insanlarda hastalık oluşturur. genogrup1 en az 15, genogrup 2 enaz 18 genotipten oluşur.

27 Patogenez Enfektif doz 10 virus partikülü İshal oluşturma mekanizması tam olarak bilinmemektedir. İnce barsak proksimal kısmı etkileniyor küntleşmiş villuslarda lamina propriada mononükleer hücre infiltratı D-ksiloz, laktoz ve yağın malabsorpsiyonu olur.

28 Epidemiyoloji Gelişmekte olan ülkelerde ve gelişmiş ülkelerde tüm yaş gruplarında Erişkinlerde sporadik akut gastroenteritden, küçük çocuklarda akut infantil gastroenteritlerin ikinci önemli nedenlerinden biridir. Tüm yiyecekle geçen gastroenterit salgınların %50 sinden sorumlu

29 Bulaş Fekal-oral: Kontamine yiyecek veya içecek yoluyla İnsandan insana direkt bulaş Çevre ve eşya kontaminasyonu ile Kusma sırasında oluşan aerosollerin oral mukozaya girmesi ve yutulması ile

30 Norovirus ile yiyecek kontaminasyonu Yiyeceklerin hazırlaması sırasında Kontamine sudan toplanan kabuklu deniz ürünleri Toprağı sulamada kontamine su kullanımı

31 En çok riskli olan yiyecekler Kabuklu deniz ürünleri (midye, istridye) Pişirilmeden yenen hazır soğuk yiyecekler Salata, salata sosları Sandviç Pasta kreması meyveler

32 Norovirus ile suyun kontaminasyonu Norwalk virusların su orjinli salgınları Su deposu Kuyu suyu Buz Gölet, göl, dere, nehir, Yüzme havuzu

33 Epidemiyoloji Bütün yıl boyunca görülmesine karşın kışın olgularda artış görülebilmektedir. Nozokomiyal ishaller en çok çocuklarda görülmektedir. Salgınlar Kreş, okul, restoran, otel, kamplar, yaşlı bakımevleri, hastane, yolcu gemileri, yurtlarda görülür. Norovirus GII.4: 2002 yılında ABD de yolcu gemileri ve yaşlıbakım evlerinde, Avrupa da hastanelerde salgınlara yol açmıştır.

34 Klinik Hızlı başlar, hızlı yayılır. Kusmayla başlar Kramplı sulu diyare, bulantı bazen ateş Bazen sadece kusma görülür. Diyare erişkinlerde, kusma ise çocuk hastalarda daha yaygındır.

35 İnkübasyon periyodu: saat Hastalığın süresi: saat İmmün sistemi baskılanmış hastalarda norovirus salınımı daha uzun sürebilir. Kendiliğinden iyileşir, hastaneye yatış nadiren gerektirir.

36 Sapovirus Çocuklar ve erişkinlerde enfeksiyona norovirus enfeksiyonlarına oranla daha az oranda neden olurlar. Tek sarmallı pozitif polariteli RNA virusu.

37 Sapoviruslarda, yapısal olmayan proteinler ve kapsid proteinleri tek bir büyük ORF tarafından kodlanır. Kapsid protein (VP1) inine göre 5 genogruba ayrılırlar. GI, GII, GIV, ve GV insanlarda enfeksiyona neden olur.

38 Epidemiyoloji Beş yaş altı çocuklarda ve daha az oranda erişkinlerde enfeksiyona neden olur. Erişkinlerde salgınlar çoğunlukla hastanelerde meydana gelir. Enfekte sağlık çalışanları sıklıkla virusun yaşlılara geçmesinde rol oynar. Fekal-oral yoldan kontamine su ya da yiyecekler ile.

39 Klinik İnkübasyon süresi:1-4 gün İshal (% 72-97) Kusma (%56-73)

40 Astrovirüsler RNA virüsü Zarfsız 28-30nm 3 adet ORF Dünyada endemik olup infantil diyarelerin %2-10 unda etkendir. İki yaş altı çocuklarda semptomatik, kreş, okul, huzurevi ve hastanelerde asemptomatik seyreder.

41 Klinik Rotavirüs gastroenteritinin hafif formudur. Hafif sulu diyare Kusma Abdominal distansiyon Serotip sayısı 8, serotip 1 (astv-1) en yaygın

42 Enterik Adenovirüsler İlk kez 1975 de tanımlanmış Yeni doğan ve küçük çocuklarda diğerleri gibi akut gastroenteritin etkenidir. Adenoviridae ailesinde yer almaktadır nm, zarfsız, lineer çift sarmallı DNA virüsü

43 Enterik Adenoviruslar En sık 0-2 yaş grubu çocuklarda Antijenler:hekzon (cinse özgül antijen) ve fiber antijenleri (hemaglutinin) Hemaglütinasyon özelliklerine göre adenoviruslar A'dan F'ye kadar 6 gruba ayrılır. Enterik adenoviruslar : Ad 40 ve Ad 41, F grubuna aittir. Daha az sıklıkta A grubundan serotip 31, 12, 18 B grubundan serotip 3 ve 7 C grubundan serotip 1,2,5 ve 6

44 Patogenez Enterositlerde oluşan lezyonlar villusların atrofisine ve kriptlerde kompanze hiperplaziye yol açar ve daha sonra malabsorbsiyon ve sıvı kaybı olur.

45 Klinik Rotavirüs benzeri tablo daha hafif ancak daha uzun sürelidir gün sürer, kendiliğinden geçer. İmmün sistemi baskılanmış kişilerde kronik seyredebilir.

46 Epidemiyoloji Bütün dünyada yaygındır, GIS enfeksiyonlari en sık Tip 40 ve 41 ile Enfeksiyonlar bütün yıl boyunca Bulaş fekal oral yol

47 VİRAL DİYARELERDE TANI

48 Gastroenteritli olguların çoğunda tanı klinik bulgular ile yapılmaya çalışılsa da tek başına yeterli değildir. Klinik tanının doğrulanması için laboratuar desteği gereklidir

49 Rotavirus Laboratuvar Tanısı Akut dönemde dışkıda viral yük en yüksektir ( viral partikül sayısı/ml). Hastalığın ilk 2-5 gününde dışkı örnekleri alınmalıdır. Semptomların başlangıcından 8 gün sonra toplanan örnekler nadiren virus içerir.

50 1-Dışkı örneklerinde virus partiküllerinin gösterilmesi: Elektronmikroskobisi İmmun elektronmikroskobi : rutin kullanılmaz. 2-Virus izolasyonu : Araştırma amacıyla yapılmaktadır. Tripsin ile muamele veya besiyerine düşük düzeyde tripsin ilavesi ile hücre kültüründe üretilebilir, Maymun böbrek hücre dizisi MA104 İnsan kolon karsinoma hücre dizisi CaCo-2. Sitopatik etki minimaldir. Grup B rotavirus hücrelerde sinsitya veya füzyon oluştur.

51 3-Antijen saptanması Monoklonal antikorların kullanıldığı duyarlı ve özgül ticari ELISA, immünokromatografik ve lateks aglütinasyon (LA) kitleri hızlı testlerdir. ELISA yöntemi (Grup A rotavirus) Duyarlılık :% 94-97, Özgüllük: % yüksektir. LA testi (GrupA rotavirus) Özgüllük: % yüksek Duyarlılık :% ELISA dan daha düşük.

52 Epidemiyolojik çalışmalarda Grup A rotavirusların G serotiplerinin belirlenmesi için G1-G4 tip spesifik monoklonal ab. dayanan ticari ELISA testleri, G5, G8, G9 ve G10 tiplerinin belirlenmesi için genotipleme testleri kullanılır. Grup A rotavirus subgrup I ve II için VP6 üzerindeki iki farklı epitopa spesifik monoklonal ab ELISA testi geliştirilmiştir.

53 Akut gastroenteritli hastalardan en çok izole edilen grup A rotavirus P1A ve P1B serotipleri için ELISA testleri vardır. Grup B ve C rotavirusların tanısı için VP6 antijenlerine karşı grup spesifik monoklonal ab. kullanıldığı ELISA testleri geliştirilmiştir. VP4 antijeninde çapraz reaktif epitoplar nedeniyle genotipleme metodları tercih edilir

54 Moleküler testler 1-Dot blot hibridizasyon: Özgüllüğü yüksek, EM, ELISA ve RNA analizi gibi diğer testler ile uyumludur. ELISA ve dot hibridizasyonun karşılaştırıldığı çalışmalarda dot hibridizasyon ELISA yöntemine göre kez daha duyarlı olduğu görülmüştür

55 2-RT-PCR: Rotavirus grup A nın saptanmasında RT- PCR en önemlisidir, antijen testlerinden daha duyarlıdır. Elektroferotip ve hibridizasyon yönteminden daha duyarlıdır. Diarenin başlangıcından 57 gün sonrasına kadar virusun atılımı belirlenebilir.

56 3-Elektroforetipleme: Rotavirus genomunun poliakrilamid jel elektroforezisi (polyacrylamide gel electrophoresis; PAGE) ile nongrup A rota virusları, grup A rotaviruslarından ayırt etmek amacı ile Duyarlılık: %90 dan fazla ve Özgüllük: %100 dür. Grup A rotavirusun kısa el ektroferotipleri genellikle subgrup I ve uzun elektroferotipleri ise subgrup II ile ilişkili bulunmuştur.

57 4-Grup A rotaviruslarının G ve P genotiplemesi Nükleik asit hibridizasyon testi, RFLP (restriction fragment length polymorphism), Tip spesifik primerler ile yapılan RT-PCR, Grup A rotavirus G genotipleri için en çok seçilen VP7 konsensus primerleri Gouvea ve Das primerleridir nested RT-PCR, multiplex RT-PCR mikroarray testleri

58 5-Serolojik testler Rotavirusa karşı oluşan spesifik antikorların; -Kompleman fiksasyon testi, immunflorasan test, -nötralizasyon testi, -hemaglütinasyon inhibisyon testi, -ELISA testi

59 Norovirus salgınlarında tanı Klinik tablosuna göre değerlendirilir. EM ve immun EM yöntemleri Antijen saptama yöntemleri: spesifik poliklonal ve monoklonal antikorları içeren, insan norovirus genogrup I ve II nin ikisini birden tespit edebilen ELISA testi Moleküler testlerden RT-PCR: RNA polimeraz ve kapsidi kodlayan gen bölgelerini hedef alan spesifik primerler

60 Astrovirus laboratuvar tanısı EM ve immun EM, hücre kültürü, tripsin varlığında insan kolon karsinoma hücrelerinde (CaCo-2), human embriyonik kidney hücrelerinde (HEK). Antijen testi, ELISA Grup spesifik monoklonal antikorlar kullanılarak geliştirilen, ELISAsensitivitesi % 91, spesifitesi % 98 dir RT-PCR, Dot blot hibridizasyon

61 Enterik adenovirusların tanısı EM, Hücre kültürü Antijen saptama, ELISA ve lateks aglutinasyon testleri (adenovirus 40 ve 41 tip spesifik antikorlar ya da adenovirus grupa özgül monoklonal antikorlar) PCR ve restriksiyon endonükleaz analizi

62 Kaynaklar 1-Fügen Yarkın. Viral gastroenteritler. Moleküler, Klinik ve Tanısal Viroloji. 2012; Denizli de 0-5 Yaş Arası Gastroenteritli Çocuklarda Rotavirüs ve Adenovirüs Tip 40/41 Sıklığı. Yasemin Işık Balcı, Yusuf Polat, İbrahim Ethem Çövüt, Ramazan Canural, İbrahim Görüşen, Fatma Sarı. Yeni Tıp Dergisi 2010;27: Hu L, Crawford SE, Hyser JM, Estes MK, Prasad BV. Rotavirus non-structural proteins: structure and function. Curr Opin Virol. 2012;2(4): Francesca Rovida, Giulia Campanini, Antonio Piralla, Kodjo Messan Guy Adzasehoun, Antonella Sarasini, Fausto Baldanti. Molecular detection of gastrointestinal viral infections in hospitalized patients. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 2013; Eckardt AJ, Baumgart DC. Viral gastroenteritis in adults. Recent Pat Antiinfect Drug Discov. 2011;6(1): Gülen A., HacıMustafaoğlu M. Çocuklarda akut infeksiyöz gastroenteritlere genel yaklaşım. Ankem Derg 2013;27(3):

63 Teşekkürler TEŞEKKÜRLER,