Mikolojik Tanı. Dr Dilek Yeşim Metin Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Bornova-İzmir

Transkript

1 Mikolojik Tanı Dr Dilek Yeşim Metin Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Bornova-İzmir

2 Candida infeksiyonları Yüzeyel (mukoza ve deri) infeksiyon Fırsatçı, sistemik infeksiyon

3 Candida infeksiyonları 200 fazla tür, İnfeksiyonların en sık etkenleri C albicans C parapsilosis C tropicalis C glabrata C krusei

4 Candida infeksiyonları mikrobiyolojik tanı Örnekte Candida varlığını göstermek Tür düzeyinde belirleyebilmek Olanak varsa duyarlılık testlerini yapmak En kısa sürede!

5 Yüzeyel Candida infeksiyonları Tanı kolay, yorum zor! İnfeksiyon bölgesi sıklıkla gözle görülebilir, örnek alınabilir Mukoza ve deri, flora yönünden zengin Normal flora Kolonizasyon İnfeksiyon

6 Sistemik Candida İnfeksiyonları Tanı zor! Mikrobiyolojik tanı tek başına yeterli değil! Klinik Radyolojik Histopatolojik

7 Mikoloji laboratuvarına gelen örnekler Yüzeyel örnekler Deri, kıl, tırnak kazıntı, deri ve mukoza sürüntüleri Sistemik infeksiyon örnekleri Kan Solunum yolu örnekleri İdrar BOS Steril boşluk sıvıları Doku biyopsileri Steril bölgelerden alınan örnekler tanıda ÖNEMLİDİR!

8 Mikoloji laboratuvarına gelen örnekler Antifungal tedavi öncesi alınmalıdır! Anaerobik transport besiyerleri kullanılmamalı!

9 Mikoloji laboratuvarına gelen örnekler Örnek miktarı; Mantar kültürü > bakteri kültürü Üreme şansını artırır!!!

10 Mikrobiyolojik tanı a. Direkt mikroskobik inceleme b. Kültür c. Tanımlama c. Kültür dışı yöntemler d. Duyarlılık testleri

11 Direkt Mikroskobik İnceleme Direkt örnek bakısı KOH preperatı ile örnek değerlendirme Kalkoflor beyazı ile floresan mikroskobik değerlendirme Gram boyası

12 Kültür Altın standart Cins ve tür düzeyinde tanımlama Türe özgü olası direnci belirleme Antifungal duyarlılık testi

13 İdentifikasyon Germ tüp: Candida albicans albicans dışı Candida lar

14 İdentifikasyon Dalmou yöntemi: Mısır unu tween 80 agar besiyerinde mikromorfolojik tanı

15 İdentifikasyon Kromojenik besiyerinde (CHROMagar Candida, France) farklı koloni renkleri

16 İdentifikasyon Ticari kitler ile: KH asimilasyonları RapID Yeast Plus System (Innovative Diagnostic Systems, Norcross, Ga) Fongiscreen test (Sanofi Diagnostics Pasteur, France) Automated Rapid Yeast Identification Panel (Dade Microscan, USA) API 20C AUX (biomerieux-vitek, Hazelwood, Mo.) API Candida (biomerieux, France) Auxacolor (Sanofi Diagnostics Pasteur, France) Uni-Yeast-Tek kit (Remel Laboratories, Lenexa, Kan.) Kitch et al.,1996; Heelan et al., 1998; Wadlin et al., 1999 Quindos et al., 1993; Hoppe and Frey, 1999 Land et al., 1991; St-Germain and Beauchesne, 1991

17 İdentifikasyon Ticari kitler ile: Otomatize biyokimyasal sistemler ID32C stripleri (biomerieux) Vitek Yeast Biochemical Card system (biomerieux Vitek, Inc., Hazelwood, Mo.), Vitek 2 ID-YST card system (biomerieux Vitek, Inc.) Quantum II (Abbott Laboratories, USA) Biolog YT MicroPlate system (Biolog, USA)

18 İdentifikasyon Moleküler tanımlama: Daha hızlı ve daha spesifik tanımlama Genellikle PCR temelli

19 İdentifikasyon Kültürde ya da histopatolojik kesitlerde hibridizasyon temelli testler Peptide Nucleic Acid Fluorescent in-situ hybridization (PNA FISH): Kan kültüründe üreme sinyali olan örneklerde, Candida albicans ı saptamaya yönelik Duyarlılık ve özgüllük %100 Rigby et al., 2002)

20 İdentifikasyon MALDI-TOF MS

21

22 Direkt Mikroskobik İnceleme ve Kültür Duyarlılık istenilen düzeyde değil Uygun örnek alınmasındaki zorluklar

23 Direkt Mikroskobik İnceleme ve Kültür Duyarlılık istenilen düzeyde değil Örnekteki mantar miktarı azlığı

24 Duyarlılık istenilen düzeyde değil Üreme olan örneklerde değerlendirme KARAR? Kontaminasyon Kolonizasyon İnfeksiyon

25 Direkt Mikroskobik İnceleme ve Kültür Etkenin üretilmesi ve tanımlanması zaman alıcı Deneyim gerektiriyor Kültürde üreme : 2-4 gün Kültürden tanımlama: 2-3 gün 4-7 gün

26 Kültür Enfeksiyon odağına ait belirtiler yoksa Enfeksiyon odaklarına kolay ulaşılamıyorsa Sistemik mikoz şüpheli hastada ilk incelenecek örnek KAN KÜLTÜRÜ

27 KAN KÜLTÜRÜ Lizis santrifügasyon yöntemi altın standart Otomatize kan kültür sistemleri Bactec (BD Diagnostic system, Sparks, Md.) BacT/Alert (biomérieux, Marcy l Etoile, France) Otomatize sistemlerin performansı, lizis santrifügasyon ile uyumlu Kandidemili olgularda duyarlılığı %50 Current Drug Targets, 2006; 7:

28 Solunum yolu örnekleri Kontaminasyon? / Kolonizasyon? > İnfeksiyon Orofaringeyal kolonizasyon nedeniyle balgam uygun örnek değil! Üst solunum yolu sürüntü örnekleri ile birlikte değerlendirilmeli Tür düzeyinde tanımlanmalı

29 Solunum yolu örnekleri

30 Kültür Kontaminasyon? Kolonizasyon? KANDİDÜRİ Üriner sistem infeksiyonu? Dissemine infeksiyon?

31 Kültür İdrar YB, organ nakilli, bağışık sistemi baskılı hastalarda tür düzeyinde tanımlanmalı Kandideminin belirtisi (!) Renal kandidoz: İdrar kültürü (-) Edwards JE. International conference for the development of a concensus on the management and prevention of severe candidal infections. Clin Infect Dis 1997;25:43-49

32 Kolonizasyon-İnfeksiyon Piyüri, koloni sayısı anlamlı değil! > cfu/ml ÜS infeksiyonunda anlamlı olduğu ileri sürülmüş kesinlik kazanmamış! Uzun süreli sondası olan hastalarda (=kolonizasyon) Risk faktörlerinin ortadan kaldırılması ile kandidüri düzelebilir Kozinn PJ et al. Advances in the Diagnosis of Renal Candidiasis J. Urol Kozinn PJ et al. Advances in the Diagnosis of Renal Candidiasis J. Urol Richardson MD, Warnock DW. Fungal infection-diagnosis and management. 2 nd ed. Oxford: Blackwell Science, 1997:78-93; Edwards JE. International conference for the devolepment of concensus on themanagement and prevention of severe candidal infections. ClinInfect Dis 1997; 25: 43-59

33 Kolonizasyon-İnfeksiyon Kantitatif sonuçlar; tür identifikasyonu ile anlamlı! C. albicans, gebeler İYE ile ilişkili bulunmamış! C. glabrata, idrarda saptanması İYE lehine C. tropicalis, cfu/ml İYE ile ilişkili olabilir Ahearn DG, Janach JR, Roth EJ. Speciation and densities of yeasts in human urine specimens. Sabouraudia 1966: 5; Hazen KC, Stei J, Darracott C, Breathnach A, May J, Howell SA. Isolation of cholesterol-dependent Candida glabrata from clinical specimens. Diagn Microbiol Infect. 2005: 52;

34 Kültür İdrar Üreme varsa, kültür tekrar alınır Katater yoksa Katater varsa Perianal-vaginal kültür Orta idrar Katater değiştirilir Kontaminasyon olasılığı

35 Kültür İdrar Kültürde sürekli üreme var İnvazif kandidoz? nötropeni? nedeni bilinmeyen ateş? geniş etki alanlı antibiyotik? santral venöz kateter? hiperalimentasyon? ameliyat (özel. karın)? Candida kolonizasyonu (yara, periton KAN KÜLTÜRÜ

36 Steril örnek alımındaki kısıtlamalar (özellikle pansitopenik hastalarda) Var olan kültür yöntemlerinin zaman alışı Etken mantar izolasyonundaki başarı oranının çok yüksek olmayışı Üreyen etkeni değerlendirmede sorunlar Kültür dışı yöntemler Moleküler Tanı

37 Moleküler yöntemler Çok sayıda çalışma var! Nükleik asid hibridizasyon DNA dizi analizi PNA FISH PCR..

38 Moleküler yöntemler Kullanılan örnek Doku, kan, serum, plazma, BAL Örnek miktarı (200 µl-10 ml) Farklı metodoloji Nükleik asid ekstraksiyonu Farklı primer ve probların kullanılması Onay almış standart test yöntemi yok! Arendrup MC, Fisher BT, Zaoutis TE. Invasive fungai infections in the paediatric and neonatal population: diagnostics and management issues. CMI. 2009: 15; Xavier MO, Oliveria FM, Severo LC. Laboratory diagnosis of pulmonary mycose. J Bras Pneumol. 2009: 35;

39 Test duyarlılığı: Kandidemi %100 İnvazif kandidoz şüphesi %95 İspatlanmış/yüksek olasılıklı invazif kandidozda PCR pozitifliği: %85 (78-91) Kan kültür pozitifliği %38 (29-46) 39/26

40 Moleküler yöntemler PCR temelli yöntemlerde Kan uygun örnek değil Etken kanda az miktarda -örnek miktarı artırılabilir inhibitör etki fazla -internal kontroller çalışmaya dahil edilebilir Farklı örnekler kullanılabilir (BAL, doku biyopsisi) -örnek alma sorunlu

41 Moleküler yöntemler PCR temelli yöntemlerde Tek örnek yerine, ardışık 2 veya daha fazla örnek Diğer tanı yöntemleri ile birlikte Cuenca-Estrella M, Bassetti M, Lass-Flörl C et al. Detection and investigation invasive mold disease J Antimicrob Chemother 2011; 66:

42 İn vitro Duyarlılık Testleri

43 İdeal bir duyarlılık testi İn vitro-in vivo uyum göstermeli Sağaltım sonuçlarını öngörebilmeli Yeni ilaçların terapötik potansiyellerini saptayabilmeli Laboratuvar içi ve laboratuvarlar arası tekrarlanabilirliği yüksek olmalı Hızlı sonuç verebilen, kolay uygulanabilir ve ucuz olmalı

44 CLSI (Clinical and Laboratory Standarts Institute) Kılavuzları M44A2, M44S3 M27A3, M27S3 M44A M44P M27A2 M27A M27T M27P 1982 CLSI-AFDT Alt komitesi

45 The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Antifungal Susceptibility Testing (EUCAST-AFST) The European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) Mayalar için sıvı mikrodilüsyon testi EUCAST definitive document EDef 7.1: method for the determination of broth dilution MICs of antifungal agents for fermentative yeasts.2008.

46 CLSI M27 A3 EUCAST-E-DEF 7.1 Uygulama alanı Candida ve Cryptococcus Candida İnokülum 0.5x x10 3 CFU/ml 0.5x x10 5 CFU/ml İnokülum standardizasyonu Spektrofotometrik Hemositometrik Besiyeri RPMI 1640 RPMI % 2 glukoz Buffer MOPS, ph 7.0±0.1 MOPS, ph 7.0±0.1 Mikrodilüsyon plağı U tabanlı Düz tabanlı Değerlendirme Görsel Spektrofotometrik Isı 35 0 C 35 0 C İnkübasyon süresi Sınır değer saat (C. neoformans72 saat) AmB için üreme olmayan kuyucuk, azoller, ekinokandinler için ~% 50 inhibisyon 24 saat AmB için ~% 90 inhibisyon, azoller, ekinokandinler için ~% 50

47 Etest (biomérieux) ATB Fungus 3 (biomérieux) Vitek 2 yeast susceptibility test (biomérieux) Sensititre YeastOne colorimetric plate (Trek Diagnostic Systems)

48 Candida direnç sınır değerleri (CLSI) Antifungal ilaç S S-DD I R M27A2 Flukonazol İtrakonazol 0,125 0,25-0,5-1 M27A3-M27S3 Vorikonazol Kaspofungin > 2 Anidulafungin > 2 Mikafungin > 2 M44A Flukonazol Vorikonazol

49

50 Türe özgü direnç profilleri Flukonazol (24 h) İtrakonazol (48 h) Vorikonazol (48 h) Posakonazol (48 h) C. albicans >4 >0.5 >2 >2 C. tropicalis >4 >0.5 >2 >2 C. krusei R >0.5 >2 >2 C. glabrata >32 >0.5 >2 >2 C. parapsilosis >4 >0.5 >2 >2 Kaspofungin (24 h) Anidulafungin (24 h) Mikafungin (24 h) C. albicans >0.5 >0.5 >0.5 C. tropicalis >0.5 >0.5 >0.5 C. krusei >0.5 >0.5 >0.5 C. glabrata >0.5 >0.5 >0.12 C. parapsilosis >4 >4 >4

51 Hangi durumlarda yapılmalı? İdentifikasyon çok daha önemli! Steril bölgelerden soyutlanan Candida spp. ( özellikle non-albicans türler) için Direnç görülebilme olasılığı olan türler nedeniyle (örn; C. glabrata - flukonazol) Standart sağaltıma yanıt vermeyen tablolarda (örn. Mukozal kandidoz) Klinik yanıtsızlık durumlarında Epidemiyolojik amaçlarla

52

53

54 Türkiye - Çalışmalar Yöntem Köken sayısı AMB FLU İTRA VORİ EKİNO Kuzucu Ç, 2007 (İnönü Ü) M27A Sancak B, 2007 (HÜ) M27A2 134 (CG) (SDD) (SDD) - - Efe-İris N, 2008 (Ok Meydanı) ATB Fungus Saraçlı MA, 2009 (GATA) M27A (SDD) 0 15 (KF) Aydın F, 2010 (KTÜ ) M44A Etest Kiraz N, 2011 (OGÜ) Etest Metin DY, 2011 (EÜ) M27A (SDD) 0 / 0.5

55 Doğanay-Oflazoğlu B, Metin DY EÜTF, Kan kültürü kökenleri C. albicans (96), C. parapsilosis (88), C. tropicalis (18), C.glabrata (18),C. krusei (4), C. guilliermondii (3), C. keyfr(2), C. lusitaniae (2), C. sake (2), C. famata (1), C. globosa (1), C. dubliniensis (1) Candida türleri (236) 24 saat 48 saat S SDD R S SDD R AMB 236(100) (99.6) - 1 (0.4) FLU 233(98.7) 3 (1.3) (97.9) 5 (2.1) - İTRA 197(83.5) 37 (15.7) 2 (0.8) 169 (71.6) 58 (24.6) 9 (3.8) VORİ 236(100) (100) - - CF 236(100) (100) - - AF 236(100) (100) - -

56 Antifungal Duyarlılık Profilleri C. albicans C. tropicalis C. glabrata C. parapsilosis C. krusei Amfoterisin B Flukonazol İtrakonazol Vorikonazol Ekinokandinler

57 Sonuç olarak; Gelecekte yeni in vitro tanı yöntemleri umut verici değil Uygun örnek? Yeni tanı yöntemleri in vivo planlanabilir Spesifik mantar belirleyicileri ile etiketlenmiş ürünler (etiketli antifungal molekül, hücre duvarına karşı antikor veya yalnızca mantara bağlanan etiketli şeker molekülü) infüzyon yolu ile verildikten sonra görüntüleme yöntemleri ile infeksiyon bölgesinin saptanması Klutts JS, Robinson-Dunn B. A Critical Appraisal of the Role of the Clinical Microbiology Laboratory in Diagnosis of Invasive Fungal Infections J Clin Microbiol 2011; 49 (Suppl):

58 Moleküler Tanı DM Kültür Kültür dışı yöntemler

59 Laboratuvar-klinik işbirliği Çok önemli!!!