U Amplified DNA Assay. B ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) /01 Türkçe

Transkript

1 B ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay U 44 ABD Patent No ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; /1 Türkçe KULLANIM AMACI BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay (BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Familyası [CF] Amplifiye edilmiş DNA Testi), Chlamydiaceae familyasına ait organizmaların (Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci yi de kapsayan fakat bunlarla sınırlı değil) DNA sının doğrudan ve kalitatif olarak tespit edilmesi için Dizi Yerdeğiştirme Amplifikasyonu (SDA) teknolojisini kullanır. Test, klinik belirtiler ve semptomlar gösteren ve diğer pnömoni tanı kanıtları bulunan hastalardan alınan boğaz swablarını (aktarım besiyeri ile veya olmaksızın) test etmede kullanım amaçlıdır. Test, Chlamydiaceae Familyası kaynaklı pnömoninin olası tanısına yardımcı olarak kullanılabilir. ÖZET VE AÇIKLAMA Chlamydophila pneumoniae salgın pnömoni (CAP) vakalarının yaklaşık olarak %5 15 ine neden olur. 1 Bilinen tek kaynak insandır. Bulaşma insandan insana solunum salgıları yoluyla gerçekleşir ve genellikle birkaç haftalık bir inkübasyon süresi ile yakın temas gereklidir. 2 C. pneumoniae kaynaklı pnömoni vakalarının çoğunluğu görece hafiftir ve mortalite düşüktür. Bununla birlikte, tekrar enfeksiyon sıktır ve hastaneye yatması gereken yaşlı hastalarda sıklıkla görülür. C. pneumoniae için kültür yöntemleri yavaştır ve gerçekleştirilmesi oldukça zordur, bu sebeple tanı için rutin olarak kullanılmazlar. Bununla birlikte, yöntemler organizmanın yaşayabilirliğinin belgelenmesi ve duyarlılık testi için örnek sağlanabilmesi açısından önemlidir. IgM ve IgG antikorları için mikroimmünofloresan (MIF) testi tanı için kullanılan en yaygın serolojik testtir ve birincil enfeksiyon ve tekrar enfeksiyon ayrımını sağlar. Akut enfeksiyon, akut ve konvalesan dönem serumları arasında IgG titresinde dört kat artış veya 16 IgM titresi³ ile tanımlanır. Geçmiş maruziyet IgG titresi 16 ile gösterilir. Tanı için tek bir yüksek IgG titresi kullanılması uygun bulunmamaktadır. Bu sebeple serolojik tanı, hasta yönetimi açısından, sadece retrospektif epidemiyolojik araç olarak son derece faydalıdır. Pnömoni tanısı koyulması ve etiyolojisi, aşırı antibiyotik kullanımı hakkında artan endişe nedeniyle daha fazla önem kazanmıştır. Nükleik asit amplifikasyonunu kullanan hızlı tanılayıcı teknikler tanı koymada yardımcı olabilir, böylece doğru yönlendirilen tedavinin zamanında uygulanması sağlanır. PROSEDÜR İLKELERİ BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay (BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Familyası [CF] Amplifiye edilmiş DNA Testi), amplifikasyon primerleri ve floresan etiketli detektör probunu kullanarak hedef DNA nın eşzamanlı amplifikasyonu ile tespitini temel almaktadır. SDA reaktifleri tek kullanımlık iki ayrı microwellde kurutulmuştur. İşlenen örnek, amplifikasyon primerlerini, floresan etiketli detektör probunu ve amplifikasyon için gerekli diğer reaktifleri içeren Priming İşlemi Microwelline eklenir. Primerler Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis ve Chlamydophila psittaci yi de kapsayan Chlamydiaceae Familyasının üyelerine ait RNAse P geninin 6 baz çiftinden oluşan korunmuş bölgesini amplifiye etmek için tasarlanmıştır. İnkübasyondan sonra, reaksiyon karışımı SDA için gerekli iki enzimi (DNA polimeraz ve restriksiyon endonükleaz) içeren Amplifikasyon İşlemi Microwelline aktarılır. Amplifikasyon Microwelleri kontaminasyonu önlemek için kapatılır ve daha sonra her reaksiyonun amplifiye ürünlerin oluşumu açısından izlendiği, ısıl olarak kontrol edilen floresan okuyucularda inkübe edilir. Her reaksiyon, amacı amplifikasyon için uygun koşulların mevcut olduğunu doğrulamak ve test inhibitörlerinin varlığına bağlı olarak hatalı-negatif sonuçlar bildirme olasılığını azaltmak olan bir Dahili Amplifikasyon Kontrolünü (IAC) koamplifiye eder ve tespit eder. Chlamydiaceae Familyası DNA sı varlığı veya yokluğu, örneğe ait PAT (Eşikten Sonra Geçişler) sonuçlarının önceden belirlenen eşik değeri ile ilişkilendirilmesiyle belirlenir. Cihaz sonuçları pozitif, negatif veya belirsiz olarak otomatik olarak bildirir. REAKTİFLER VE MATERYALLER BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay (BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Familyası [CF] Amplifiye edilmiş DNA Testi) şunları içerir: Chlamydiaceae Familyası (CF) Priming İşlemi Microwelleri, (1x24) 6 Oligonükleotid 7,5 pmol, dntp ler 15,2 nmol, 2 Detektör Probu 22,5 pmol Sentetik Oligonükleotid 75 adet Chlamydiaceae Familyası (CF) Amplifikasyon Microwelleri, (1x24) Restriksiyon Enzimi: Birim, DNA Polimeraz 14 Birim 1 Priming Kapağı, 16 Yapışkanlı kapak (1/2), 8 Atık Çantası BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit (CF/LP*/MP**) (BD ProbeTec ET Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı ve Kontrol Kiti [CF/LP*/MP**]): İçindekiler: Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı: Bisin, Potasyum Fosfat, Potasyum Hidroksit, DMSO ve Proclin; 1 (CF/LP/MP) Pozitif Kontrol: 1.5 ng Salmon Sperm DNA, 47, µg Tris, 9, µg EDTA,.6 Kopya CF Plasmid, 4.8 Kopya LP Plasmid, 5.4 Kopya MP Plasmid; 1 (CF/LP/MP) Negatif Kontrol: 1.5 ng Salmon Sperm DNA, 47, µg Tris, 9, µg EDTA; 1 adet 2 ml Geçme Kapaklı Tüp * BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay e (BD ProbeTec ET Legionella pneumophila [LP] Amplifiye edilmiş DNA Testi) karşılık gelir ** BD ProbeTec ET Mycoplasma pneumoniae (MP) Amplified DNA Assay e (BD ProbeTec ET Mycoplasma pneumoniae [MP] Amplifiye edilmiş DNA Testi) karşılık gelir

2 BD ProbeTec ET Swab Diluent and Control Kit (tcf/tmp)*(bd ProbeTec ET Swab Seyreltim Sıvısı ve Kontrol Kiti [tcf/tmp]): İçindekiler: Swab Seyreltim Sıvısı: Bisin, Potasyum Fosfat, Potasyum Hidroksit, DMSO ve Proclin; 1 (tcf/tmp) Pozitif Kontrol: 1.75 ng Salmon Sperm DNA, 78,8 µg Tris, 15, µg EDTA, 6. Kopya CF Plasmid, 8. Kopya LP Plasmid, 9. Kopya MP Plasmid; 1 (tcf/tmp) Negatif Kontrol: 1.75 ng Salmon Sperm DNA, 78,8 µg Tris, 15, µg EDTA * t ismi yalnızca Boğaz Swabı ile (aktarım besiyeri olmaksızın) kullanıma yönelik reaktiflere tekabül eder. Cihaz, ekipman ve sarf malzemeleri: BD ProbeTec ET Instrument and Instrument Plate (BD ProbeTec ET Cihazı ve Cihaz Plağı), BD ProbeTec ET Lysing Heater (BD ProbeTec ET Lize İşlemi Isıtıcısı), BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater (BD ProbeTec ET Priming Isıtıcısı), BD ProbeTec ET Lysing Rack (BD ProbeTec ET Lise İşlemi Yuvası), BD ProbeTec ET Pipettor, stand, and Power Supply (BD ProbeTec ET Pipetör, Stand ve Güç Kaynağı), BD ProbeTec ET Accessories Kit (BD ProbeTec ET Aksesuar Kiti), BD ProbeTec ET 2 ml and 4 ml Sample Tubes and Caps (BD ProbeTec ET 2 ml ve 4 ml Örnek Tüpleri ve Kapaklar), BD ProbeTec ET Pipette Tips (BD ProbeTec ET Pipet Uçları) Gerekli fakat sağlanmamış malzemeler: Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabini (BSC), vorteks karıştırıcı, -2 C ve/ veya -7 C (veya daha soğuk) sıcaklık döngüsüz dondurucu, 16. x g kapasiteli mikrosantrifüj, su banyoları, dijital termometre, vida kapaklı su banyosu yuvası, 2 ml örnek tüpü yuvası ve diğer uygun örnek tüp yuvaları, BBL CultureSwab EZ swablar, tek kullanımlık eldivenler, 2 1. µl lik mikropipetler, aerosole dayanıklı pipet uçları, distile su, moleküler biyolojik kullanım için uygun su, Alconox lu* %1 (h/h) sodyum hipoklorit * 7,5 g Alconox u 1 L %1 (h/h) sodyum hipoklorit çözeltisi ile çözün ve karıştırın. Her gün yenisini hazırlayın. Saklama ve İşleme Gereklilikleri: BD ProbeTec ET CF reagent pack (BD ProbeTec ET CF reaktif paketi) 2 C de saklanabilir. Son kullanım tarihi geçen açılmamış reaktif paketlerini kullanmayın. Açılan bir torba, microweller uygun şekilde tekrar kapatıldıkları sürece 12 hafta boyunca veya daha önce geliyorsa son kullanma tarihine kadar stabildir. Dondurmayın. BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit (CF/LP/MP) (BD ProbeTec ET Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı ve Kontrol Kiti [CF/LP/MP]) 2 C de saklanabilir. Son kullanma tarihi geçen reaktifleri kullanmayın. Dondurmayın. BD ProbeTec ET Swab Diluent and Control Kit (tcf/tmp) (BD ProbeTec ET Swab Seyreltim Sıvısı ve Kontrol Kiti [tcf/tmp]) 2 C de saklanabilir. Son kullanma tarihi geçen reaktifleri kullanmayın. Dondurmayın. Uyarılar ve Önlemler In vitro Diyagnostik Kullanım içindir. 1. Klinik örneklerde hepatit virüsü ve İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü de dahil olmak üzere patojenik mikroorganizmalar bulunabilir. Kan veya diğer vücut sıvılarıyla kontamine olan tüm öğelerle çalışılırken, Standard Precautions (Standart Önlemler) 4-7 ve kurumsal düzenlemeler takip edilmelidir. 2. BD ProbeTec ET Swab Diluent and Respiratory and Media Diluent (BD ProbeTec ET Swab Seyreltim Sıvısı ve Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı) dimetil sülfoksit (DMSO) içerir. DMSO solunduğunda, ciltle teması ettiğinde veya yutulduğunda tehlikelidir. Göze temas ettirmekten kaçının ve çalışırken her zaman eldiven kullanın. Gözlerle temas etmesi halinde, derhal bol suyla yıkayın ve bir doktora danışın. Ciltle teması halinde, derhal bol suyla yıkayın.. BD ProbeTec ET tasarımı test ortamında amplikon kontaminasyonu olasılığını düşürdüğünden bu işlem için özel çalışma alanları gerekmese de, kontaminasyonun önlenmesi, özellikle de işlem sırasında örnek kontaminasyonunun önlenmesi için diğer önlemlerin alınması gerekmektedir. 4. Kullanılmamış Priming İşlemi Microwelleri ve Amplifikasyon İşlemi Microwellerini içeren reaktif torbaları açıldıktan sonra dikkatlice tekrar KAPATILMALIDIR. Reaktif torbalarını tekrar kapatmadan önce torbada desikant bulunduğundan emin olun. 5. Amplifikasyon İşlemi Microwellerini içeren plak, BD ProbeTec ET Priming Isıtıcısından BD ProbeTec ET Cihazına taşınmadan önce Yapışkanlı kapak kullanılarak uygun şekilde KAPATILMALIDIR. Plağın kapatılması amplifikasyon ve tespit için kapalı bir reaksiyon sağlar ve cihazın ve çalışılan alanın amplifikasyon ürünleri ile kontamine olmasını önlemek için gereklidir. Kapatma malzemesini microwellerden kesinlikle çıkarmayın. 6. Sıvı kalıntısı (sıvının Priming İşlemi Microwellinden Amplifikasyon İşlemi Microwelline aktarılmasından sonra) içeren Priming İşlemi Microwelleri, hedef kontaminasyon kaynağı oluştururlar. Priming İşlemi Microwellerini atmadan önce plak yapışkanlı kapağını dikkatle kapatın. 7. Çalışma alanının amplifikasyon ürünleri ile kontaminasyonunu önleyebilmek amacıyla, test edilen Amplifikasyon İşlemi Microwellerini atmak için reaktif paketleriyle sağlanan atık çantalarını kullanın. Atmadan önce çantaların düzgün şekilde kapatıldığından emin olun. 8. Örneklerin çapraz kontaminasyonunun önüne geçmek için, örnek işleme ve test prosedürleri sırasında belirtilen adımlarda ELDİVEN DEĞİŞTİRİN. Eldivenler örnekle temas ederse, diğer örneklerin kontamine olmasını önlemek için eldivenleri derhal değiştirin. 9. Çalışma alanının veya ekipmanın örneklerle kontamine olması halinde, kontamine olan alanı %1 (h/h) sodyum hipoklorit ve Alconox çözeltisiyle iyice temizleyin ve suyla iyice durulayın. Diğer testlere devam etmeden önce yüzeyin tamamen kurumasını bekleyin. 1. İşlenmiş örnekleri Priming İşlemi Microwellerine aktarmak için ve örneklerin Priming İşlemi Microwellerinden Amplifikasyon İşlemi Microwellerine aktarılması için sadece BD ProbeTec ET Pipetörü ve BD ProbeTec ET Pipet uçlarını kullanın. 11. Kullanılmış pipet uçlarını, örnek tüplerini, Priming İşlemi Microwellerini ve diğer tek kullanımlık malzemeleri atarken belirlenen laboratuvar uygulamalarını kullanın. Tek kullanımlık malzemeleri dikkatle atın. Atık kaplarını ¾ oranında dolduklarında veya günlük olarak (hangisi daha önce gerçekleştirilirse) kapatın ve atın. 12. Farklı lot numaralarına sahip kitlerdeki Microwelleri, Kontrolleri veya işlem reaktiflerini değiştirmeyin veya birbirleriyle karıştırmayın. 2

3 1. BD ProbeTec ET cihazına temizlemeyle giderilemeyen şekilde sıvı dökülmesi veya DNA ile kontamine olması gibi beklenmedik durumlar oluştuğunda Teknik Servis i arayın. ÖRNEK TOPLAMA VE NAKİL 1. Örnek Toplama Örnekler Clinical Microbiology Procedures Handbook 8 veya kendi laboratuvarınızın prosedür kılavuzu tarafından önerilen şekilde toplanmalıdır. BBL CultureSwab EZ (BD kat. no ) aktarım besiyeri olmaksızın saklanan boğaz swablarının alınması için kullanılmalıdır. 2. Örneklerin saklanması ve nakledilmesi Boğaz Swabları (aktarım besiyeri olmaksızın): Örnekler en fazla 2 gün 18 C de saklanabilir/taşınabilir. Örnekler en fazla gün 2 8 C de soğuk koşullarda saklanabilir. Örnekler en fazla 14 hafta -2 C veya altında saklanabilir. 2SP Besiyerinde Boğaz Swabları: 8 Örnekler hemen 2 8 C de buzdolabında saklanmalıdır. Taşıma süresi birkaç dakikadan fazla ise kuru buz veya soğuk paketler üzerinde taşıyın. Örnekler en fazla 2 gün 2 8 C de saklanmalıdır. Daha uzun süre saklama gerektiren örnekler -7 C de saklanmalıdır. TEST PROSEDÜRÜ Sistem bileşenlerinin çalıştırılması ve bakımına ilişkin özel talimatlar için BD ProbeTec ET Sistemi Kullanıcı Kılavuzu na başvurun. A. Cihazın Hazırlanması: 1. Cihaz açılmalı ve test gerçekleştirilmeden önce cihazın ısınması beklenmelidir. a. Lize İşlemi Isıtıcısı ve Priming Isıtıcısının ısınması ve stabilizasyonu yaklaşık olarak 9 dakika sürer. Lize İşlemi Isıtıcısı için ayarlanan sıcaklık değeri 114 C dir. Priming Isıtıcısının Priming bileşeni için ayarlanan sıcaklık değeri 72,5 C dir. Priming Isıtıcısının Isıtma bileşeni için ayarlanan sıcaklık değeri 54 C dir. b. BD ProbeTec ET cihazı yazılım kontrolü altındadır ve ısınması yaklaşık olarak dakika sürer. 2. Isıtıcı sıcaklıkları teste başlamadan önce kontrol edilmelidir. Sıcaklıkları BD ProbeTec ET System Maintenance Log a kaydedin. a. Lize İşlemi Isıtıcısı Plastik kapağı çıkarın ve sıcaklığın dengeye gelmesi için 15 dakika bekleyin. Termometre C yi göstermelidir. b. Priming Isıtıcısı Priming Isıtıcısının termometresi 72 7 C yi göstermelidir. Isıtma İşlemi Isıtıcısının termometresi 5,5 54,5 C yi göstermelidir.. BD ProbeTec ET ekranında görüntülenen sıcaklığı kontrol edin. Sıcaklık değeri 47,5 55, C aralığında olmalıdır. Sıcaklıkları BD ProbeTec ET System Maintenance Log a kaydedin. B. Pipetör: BD ProbeTec ET Pipetör tuş takımı fonksiyonlarına ilişkin detaylı açıklamalar için BD ProbeTec ET Sistemi Kullanıcı Kılavuzu na başvurun. Ayrıca, BD ProbeTec ET Pipetör her kullanımdan sonra temizlenmelidir. BD ProbeTec ET Pipetörün doğru temizlenmesi ve bakımı hakkında yol göstermesi için Teknik Servis temsilcinize başvurun. BD ProbeTec ET CF Testinin gerçekleştirilmesi için aşağıdaki programlar gereklidir. Program 1, işlenen örneklerdeki sıvıyı, CF Priming İşlemi Microwellerine aktarır. Program 5, CF Priming İşlemi Microwellerindeki sıvıyı, CF Amplifikasyon İşlemi Microwellerine aktarır. Pipetörü şu şekilde programlayın: Program 1: 1. Pipetörü AÇIN. Pipetör bir kez bip sesi verir, ZERO (Sıfır) yanıp söner, Software Version # (Yazılım Sürüm No.) yanıp söner ve bir kez daha bip sesi verir. 2. Mavi Prog (Program) tuşuna basın. Program 1 i seçmek için 1 görüntülenene kadar Vol (Ses) tuşuna basın. Enter a (Giriş) basın.. Programlama moduna girmek için Prog (Program) tuşuna basın ve tuşu basılı tutun. Prog (Program) tuşundan parmağınızı çekerken aynı zamanda pipetin ucuyla veya bir atacın ucuyla Special Function Key e (Özel Fonksiyon Tuşu) basın. 4. Fill e (Doldur) basın. 2 görüntülenene kadar yukarı okuna basın. Enter a (Giriş) basın. 5. Disp e (Dağıt) basın. 15 görüntülenene kadar yukarı ok tuşuna basın. Enter a (Giriş) basın. 6. Programı kaydetmek ve çıkmak için Enter a (Giriş) bir kez daha basın. Programlamanın tamamlandığını belirten bir bip sesi duymanız gerekir. 7. Adımlar arasında ilerlemek için tetikleyiciye basarak programınızı doğrulayın. Her adımda, aspirasyon/ dağıtım hızını Vol (Hacim) tuşunu kullanarak ayarlayın. Her adımda Hız göstergesi görüntülenir. Hız göstergesini Fill (Doldur) ve Disp (Dağıt) adımları için 2 kare gösterecek şekilde ayarlamak üzere Vol (Ses) tuşunu kullanın.

4 Program 5 1. Prog (Program) tuşuna basın. Program 5 i seçmek için 5 görüntülenene kadar Vol (Ses) tuşuna basın. Enter a (Giriş) basın. 2. Programlama moduna girmek için Prog (Program) tuşuna basın ve tuşu basılı tutun. Prog (Program) tuşundan parmağınızı çekerken aynı zamanda pipetin ucuyla veya bir atacın ucuyla Special Function Key e (Özel Fonksiyon Tuşu) basın.. Fill e (Doldur) basın. 1 görüntülenene kadar yukarı okuna basın. Enter a (Giriş) basın. 4. Disp e (Dağıt) basın. 1 görüntülenene kadar yukarı ok tuşuna basın. Enter a (Giriş) basın. 5. Mix e (Karıştır) basın. 5 görüntülenene kadar yukarı ok tuşuna basın. Enter a (Giriş) basın. 6. Programı kaydetmek ve çıkmak için Enter a (Giriş) bir kez daha basın. Programlamanın tamamlandığını belirten bir bip sesi duymanız gerekir. 7. Adımlar arasında ilerlemek için tetikleyiciye basarak programınızı doğrulayın. Her adımda, aspirasyon/ dağıtım/karıştırma hızını Vol (Ses) tuşunu kullanarak ayarlayın. Her adımda Hız göstergesi görüntülenir. Hız göstergesini aspirasyon ve dağıtım fonksiyonları için 2 kare gösterecek şekilde ayarlamak üzere Vol (Ses) tuşunu kullanın. Karışım hızını kare gösterecek şekilde ayarlamak için Vol (Ses) tuşuna basın. Programın Gözden Geçirilmesi Programlar prosedüre başlanmadan önce gözden geçirilmelidir. Programı gözden geçirmek için, pipetörü AÇIN. Mavi Prog (Program) tuşuna basın. Uygun program numarası (1 veya 5) görüntülenene kadar Vol (Ses) tuşuna basın. Enter (Giriş) tuşuna basın. Programda adım adım ilerlemek için pipetleme tetikleyicisini kullanın. Program 1: Bu program 2 µl çeker; CF microwelline 15 µl dağıtır. Pipetör ekranında aşağıdaki ifade görüntülenmelidir: Fill 2 µl SII (2 µl SII doldur) Dispense 15 µl SII (15 µl SII dağıt) Program 5: Bu program 1 µl çeker; 1 µl dağıtır ve 5 µl yi üç kez karıştırır. Pipetör ekranında aşağıdaki ifade görüntülenmelidir: Fill 1 µl SII (1 µl SII doldur) Dispense 1 µl SII (1 µl SII dağıt) Mix 5 µl SIII (5 µl SIII karıştır) Zero (Sıfır yanıp söner) C. Plak Yerleşimi: Test türü, örnek tanıtıcısı, kontrol lotu numarası ve kit lotu numarası sisteme girildikten sonra BD ProbeTec ET cihazı, Plak Yerleşim Raporu oluşturur. Plak Yerleşim Raporu test edilecek her plak için örneklerin ve kontrollerin fiziki yerleşimini gösterir. Bu konumlandırma Priming İşlemi Microwelli ve Amplifikasyon İşlemi Microwelli plaklarının her ikisi tarafından da kullanılır. CF testi için, Priming İşlemi Microwelleri katı, açık mavi renkteki microwell stripleridir. Amplifikasyon İşlemi Microwelleri açık mavi çizgili microwell stripleridir. D. Boğaz Swabı (aktarım besiyeri olmaksızın) Örnek İşleme: NOTLAR: BD ProbeTec ET Swab Diluent in (tcf/tmp) (BD ProbeTec ET Swab Seyreltim Sıvısı [tcf/tmp]) oda sıcaklığına gelmesini bekleyin ve kullanmadan önce yavaşça ters çevirerek karıştırın. İstenen BD ProbeTec ET Swab Diluent (tcf/tmp) miktarını temiz bir kaba aktarın. İhtiyaç duyulan miktarı hesaplamak için her örnek için 1 ml kullanın ve pipetleme işlemini kolaylaştırmak için fazladan 1 2 ml ekleyin. Seyreltim Sıvısının kontaminasyonunu önlemek için: Kalan Seyreltim Sıvısını Şişeye Geri Koymayın. 1. İşlem görecek her boğaz swabı için bir 4 ml Örnek Tüpü etiketleyin. 2. Örneklerin oda sıcaklığına gelmelerini bekleyin.. Her Örnek Tüpüne 1 ml Swab Seyreltim Sıvısı (tcf/tmp) pipetleyin. 4. Swabı yerleştirin. Swabı seyreltim sıvısının içinde 5 1 sn çevirerek karıştırın. 5. Swabı tüpün iç kısmına sürüp sıvının tüpün tabanına akmasını sağlayın. 6. Swabı sıçramamasına dikkat ederek çıkarın. NOT: Sıvı damlaması çalışma alanının kontaminasyonuna neden olabilir. 7. Swabı aktarım tüpüne yerleştirin ve atın. 8. Tüpün kapağını sıkıca kapatın. 9. Tüpü 5 sn boyunca vorteksleyerek karıştırın. 1. Diğer boğaz swabları için 9 adımlarını tekrarlayın. 11. Kontrolleri hazırlayın. Boğaz Swabı Kontrolü Hazırlığına Bakın (Bölüm F). 12. Plak Yerleşim Raporunu kullanarak örneği ve kontrolleri, Lize İşlem Yuvasına sırayla yerleştirin. 1. Örnekleri BD ProbeTec ET Lize İşlemi Yuvasındaki konumlarına kilitleyin. 14. Lize İşlemi Yuvasını, BD ProbeTec ET Lize İşlemi Isıtıcısına yerleştirin. 15. Örnekleri 1 dakika boyunca ısıtın dakika sonra BD ProbeTec ET Lize İşlemi Yuvasını BD ProbeTec ET Lize İşlemi Isıtıcısından çıkarın ve en az 15 dakika soğumaya bırakın. Tüpün tabanında olabildiğince çok kondensat toplamak için yuvayı tezgahın üzerine hafifçe vurun. NOT: Örnekleri lize ettikten sonra: a. 18 C de 6 saate kadar saklanabilir ve tekrar lize edilmeden test edilebilirler. b. 2 8 C de güne kadar saklanabilirler. Örnekler testten önce vortekslenmeli ve tekrar lize edilmelidir. c. -2 C de 14 güne kadar saklanabilirler. Örnekler testten önce oda sıcaklığında çözülmeli, vortekslenmeli ve tekrar lize edilmelidir. 4

5 17. Örnekler BD ProbeTec ET CF Test Çalıştırması Prosedürü için hazırdır (Bölüm G). E. Boğaz Swabı (2SP Besiyeri) Örnek İşleme Prosedür Notları: Bütün sıvı aktarımları arasında pipet uçlarını değiştirin. Aerosol bariyer uçların kullanılması tavsiye edilir. BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent in (CF/LP/MP) (BD ProbeTec ET Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı [CF/LP/MP]) oda sıcaklığına gelmesini bekleyin ve kullanmadan önce yavaşça ters çevirerek karıştırın. İstenen BD ProbeTec ET Respiratory and Media Sample Diluent (CF/LP/MP) miktarını temiz bir kaba aktarın. İhtiyaç duyulan miktarı hesaplamak için her örnek için,4 ml kullanın ve pipetleme işlemini kolaylaştırmak için fazladan 1 2 ml ekleyin. Seyreltim Sıvısının kontaminasyonunu önlemek için: Kalan Seyreltim Sıvısını Şişeye Geri Koymayın. 1. Örneklerin oda sıcaklığına gelmelerini bekleyin. 2. Test edilecek her örnek için bir 2 ml vida kapaklı tüp etiketleyin.. Her vida kapaklı tüpe 4 µl Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı (CF/LP/MP) aktarın. Aşağıdaki 4 6 adımları bir Biyolojik Güvenlik Kabininde (BSC) gerçekleştirilmelidir: 4. İyice karıştırmak için örneklere 5 15 sn puls vorteks uygulayın. 5. Örneğin 2 µl sini etiketli tüpe pipetleyin. NOT: Eğer örnek hacmi 2 µl den az ise (örnek en az 1 µl olmalıdır), moleküler biyoloji ölçekli su kullanarak hacmi 2 µl ye tamamlayın. 6. Örneklerin eklenmesinden sonra eldivenleri değiştirin. NOT: Adım 7 ye geçmeden önce bir su banyosunu distile su ile doldurun ve kaynatın sn puls vorteksleyin. 8. Kontrolleri hazırlayın. 2SP Ortam Kontrolü Hazırlığına Bakın (Bölüm F). 9. Örnekleri ve kontrolleri su banyosu yuvasına aktarın. 1. Banyo yuvasını kaynar su banyosunda 1 dakika bekletin dakika sonra su banyosu yuvasını çıkarın ve tüpleri oda sıcaklığında 15 dakika soğumaya bırakın. UYARI: Kaynar sudan yanmayı engellemek için dikkat edin, su banyosu yuvası veya su banyosu yüzeyleri sıcak olabilir. 12. Soğuttuktan sonra, yaklaşık 5 sn santrifüjleyin (16. x g). NOT: Örnekleri kaynattıktan sonra: 18 C de 6 saate kadar saklanabilir ve tekrar kaynatmadan test edilebilirler. 2 8 C de güne kadar saklanabilirler. Örnekler testten önce vortekslenmeli ve tekrar lize edilmelidir. -2 C de 14 güne kadar saklanabilirler. Örnekler testten önce oda sıcaklığında çözülmeli, vortekslenerek karıştırılmalı ve tekrar kaynatılmalıdır. 1. Örnekler BD ProbeTec ET CF Test Çalıştırması Prosedürü için hazırdır (Bölüm G). F. Kontrolü Hazırlığı: Boğaz Swabı Kontrol Hazırlığı 1. Her test çalışması (test edilecek plak) için, bir Negatif Kontrol (tcf/tmp) Tüpü ve bir Pozitif Kontrol (tcf/tmp) Tüpü hazırlayın. Bir plak birden fazla reaktif paketi lot numarası içeriyorsa, kontroller her lot için test edilmelidir. 2. Negatif Kontrol (tcf/tmp) tüpünün kapağını çıkarın.. Yeni bir pipet ucu kullanarak, 1 ml Swab Seyreltim Sıvısı ekleyin. 4. Tüpün kapağını sıkıca kapatın. 5. Pozitif Kontrol (tcf/tmp) tüpünün kapağını çıkarın. 6. Yeni bir pipet ucu kullanarak, 1 ml Swab Seyreltim Sıvısı ekleyin. 7. Tüpün kapağını sıkıca kapatın. 8. Kontrol tüplerini 5 sn boyunca vorteksleyerek karıştırın. 9. Kontrol tüpleri lize edilmeye hazırdır. Boğaz Swab Örnek İşlemine Bakın (Bölüm D). 2SP Ortam Kontrol Hazırlığı: 1. Her test çalışması (test edilecek plak) için, bir Negatif Kontrol (CF/LP/MP) Tüpü ve bir Pozitif Kontrol (CF/LP/MP) Tüpü hazırlayın. Bir plak birden fazla reaktif paketi lot numarası içeriyorsa, kontroller her lot için test edilmelidir. 2. Kullanımdan önce Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısını hafifçe tersine çevirerek karıştırın.. Negatif Kontrol (CF/LP/MP) tüpünün kapağını çıkarın. 4. Her kontrol tüpü için yeni bir pipet ucu kullanarak 2 µl moleküler biyolojik kullanım için uygun su ekleyin. 5. Her kontrol tüpü için yeni bir pipet ucu kullanarak 4 µl Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı ekleyin. 6. Tüpün kapağını sıkıca kapatın. 7. Pozitif Kontrol (CF/LP/MP) tüpünün kapağını çıkarın. 8. Her kontrol tüpü için yeni bir pipet ucu kullanarak 2 µl moleküler biyolojik kullanım için uygun su ekleyin. 9. Her kontrol tüpü için yeni bir pipet ucu kullanarak 4 µl Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı ekleyin. 1. Tüpün kapağını sıkıca kapatın. 11. Kontrol tüplerini 5 sn boyunca vorteksleyerek karıştırın. 5

6 12. Kontroller kaynatılmaya hazırdır. 2SP Ortam Örnek İşlemine Bakın (Bölüm E). G. BD ProbeTec ET CF Test Çalıştırması Prosedürü: NOT: Test prosedürünü gerçekleştirmeden önce, işlenmiş örnekleri ve işlenmiş kontrolleri, her ikisi de BD ProbeTec ET Pipetör ile uyumlu olan BD ProbeTec ET 2 ml lik Örnek Tüp Sporu veya BD ProbeTec ET Lize İşlemi Yuvası gibi 2 ml veya 4 ml örnek tüpü kapasiteli bir yuvaya yerleştirin. 1. Soğutulmuş örnekler ve kontrollerden kapakları çıkarın ve atın. 2. Kontaminasyonu önlemek için devam etmeden önce ELDİVENLERİ DEĞİŞTİRİN.. Plak Yerleşim Raporunu kullanarak, Priming İşlemi Microwell plağını hazırlayın bkz Plak Yerleşimi (Bölüm C). 4. Microwell torbalarını aşağıdaki şekilde tekrar kapatın: a. Torbayı düz bir yüzeye koyun. Açık ucu bir elinizle düz şekilde tutun. b. Basınç uygulayarak parmağınızı kilidin dışından torbanın bir ucundan diğer ucuna doğru kaydırın. c. Torbayı kapalı olduğundan emin olmak için kontrol edin. 5. BD ProbeTec ET Pipetörde Program 1 i seçin. 6. Pipet uçlarını takın. Boşluk topuzunu tamamen dışarı çekerek BD ProbeTec ET Pipetörünü genişletin. NOT: Sızıntıyı önlemek için pipetör uçlarının tamamen yerleştiğinden emin olun örnek sütunundan 2 µl çekin. 8. Pipetörü yavaşça çekin, pipet uçlarıyla kuyucukların kenarlarına dokunun ve Priming İşlemi Microwellerindeki ilgili sütuna (1 A H) 15 µl dağıtın. NOT: Kontaminasyona neden olacağından pipetörü örneklerin veya microwellerin üzerinde çekmeyin. Ani hareketler damlama ve aerosollere neden olabilir. 9. Uçları atın. Pipetleme tetiğini bırakarak pipetörü sıfırlayın. NOT: Çalışma alanını kontamine edebileceğinden uçları atarken damlama ve aerosol olmamasına özen gösterin. 1. Yeni uç takın, pipetörü genişletin ve 2. örnek sütunundan 2 µl çekin. 11. Pipetörü yavaşça çekin, pipet uçlarıyla kuyucukların kenarlarına dokunun ve Priming İşlemi Microwellerindeki ilgili sütuna (2 A H) 15 µl dağıtın. 12. Uçları atın. 1. Çalışma için kalan örnekleri aktararak devam edin. 14. Priming İşlemi Microwell plağını, Priming İşlemi Kapağıyla kapatın ve plağı oda sıcaklığında en az 2 dakika inkübasyona bırakın. (6 saat sürebilir.) NOT: İşlenilen örnekleri yeni kapaklar kullanarak kapatın. ELDİVENLERİ DEĞİŞTİRİN. 15. Priming işlemi inkübasyonu sonrasında Amplifikasyon İşlemi Microwell plağını hazırlayın. Amplifikasyon İşlemi Microwellerini bir plakta Plak Yerleşim Raporuna uygun şekilde konfigüre edin (priming işlemi plağıyla aynı şekilde). Microwell torbalarını adım 4 te açıklanan şekilde tekrar kapatın. 16. Priming İşlemi Microwell plağının kapağını çıkarın ve plağı Priming İşlemi Isıtıcısına aktarın. Amplifikasyon İşlemi Microwell plağını ön ısıtma işlemi için DERHAL Isıtma İşlemi Isıtıcısına yerleştirin. 17. Zamanlayıcıyı 1 dakikaya ayarlayın. (NOT: Bu adım zaman açısından kritiktir.) dakikalık (± 1 dakika) inkübasyon sonrasında pipetörde Program 5 i seçin. 19. Pipet uçlarını takın ve Priming İşlemi Microwelli plağının 1. sütunundan 1 µl çekerek Amplifikasyon İşlemi Microwelli plağının 1. sütununa aktarın. Pipet uçlarının kuyucukların kenarlarına dokunmasını sağlayın ve sıvıyı dağıtın. Dağıtma işleminden sonra pipetörün kuyucuklardaki sıvıyı otomatik olarak karıştırmasını sağlayın. Pipetörü plaktan dikkatle uzaklaştırın. Diğer kuyucuklara dokunmaktan kaçının. 2. Uçları atın. Yeni uç takın ve Priming İşlemi Microwellerindeki reaksiyon karışımını Amplifikasyon İşlemi Microwellerine sütun sütun aktarmaya, her sütun için yeni uçlar kullanarak devam edin. 21. Son sütun da aktarıldığında, bir Yapışkanlı kapağın desteğini çıkarın (Bir Yapışkanlı kapak (1/2) 6 kolona kadar kapsayacaktır. Plak 6 sütunu aşarsa bir TAM yapışkanlı kapak kullanılmalıdır.) Yapışkanlı kapağı kenarlarından tutun ve microwellerin üzerine uygulayın. Yapışkanlı kapağın uygulanmasıyla ilgili olarak Isıtma İşlemi Isıtıcısı yönergelerine bakın. Tüm microwellerin tamamen kapatılmasını sağlamak için yapışkanlı kapağı aşağı doğru bastırın. 22. BD ProbeTec ET kullanıcı arayüzünde taşıyıcıyı dışarı çıkarın ve kapıları açın ve plak kapağını kaldırın. Kapatılan Amplifikasyon İşlemi Microwelli plağını DERHAL ( sn içinde) BD ProbeTec ET Cihazına aktarın ve çalışmayı başlatın. (Detaylı bilgi için BD ProbeTec ET Sistemi Kullanıcı Kılavuzuna başvurun.) 2. Çalışmayı başlattıktan sonra, aşağıdaki temizlik prosedürüyle devam edin: a. Priming İşlemi Microwellerini Amplifikasyon yapışkanlı kapağıyla kapatın ve plağı Priming Isıtıcısından çıkarın. UYARI: Sıcaklık 7 C nin üzerindedir Plağı çıkarmak için ısıya dayanıklı eldiven kullanın. b. Plağı tezgah üzerinde 5 dakika soğumaya bırakın. c. Yapışkanlı kapakla kapatılmış Priming Microwellerini yapışkanlı kapağın iki yanından tutarak ve kuyucukları bir birim olarak yukarı doğru kaldırarak plaktan çıkarın. Kapatılmış microwelleri bir Atık çantasına koyun ve kapatın. d. Metal plağı temizleyin: Plağı %1 (h/h) sodyum hipoklorit Alconox çözeltisiyle temizleyin. Plağı suyla durulayın. Plağı temiz bir kağıt havluya sarın ve tekrar kullanmadan önce tamamen kurumasını bekleyin. 24. Çalışma tamamlandığında, sonuçların bir çıktısı alınır. 6

7 25. Plak taşıyıcısını yuvadan çıkarın, kapıyı açın ve plağı çıkarın. Kapağı kapatın ve plak yuvasını tekrar cihazın içine yerleştirin. 26. Yapışkanlı kapakla kapatılmış Amplifikasyon Microwellerini plaktan çıkarın. DİKKAT: Yapışkanlı kapakları microwellerden çıkarmayın. Kapatılmış microweller, yapışkanlı kapağın üst ve altından tutularak ve plağın dışına, yukarı doğru kaldırılarak bir birim olarak kolayca çıkarılabilir. Kapatılmış microwelleri Atık Çantasına yerleştirin. Çantayı kapatın. 27. Metal plağı temizleyin: Plağı %1 (h/h) sodyum hipoklorit Alconox çözeltisiyle temizleyin. Plağı suyla durulayın. Plağı temiz bir kağıt havluya sarın ve tekrar kullanmadan önce tamamen kurumasını bekleyin. 28. Günün son çalıştırma işleminden sonra, aşağıdaki temizleme prosedürlerini uygulayın: a. Kağıt havlu veya gazlı bezleri %1 (h/h) sodyum hipoklorit ve Alconox çözeltisiyle ıslatın ve tezgahlara ve Lize İşlemi Isıtıcısı, Priming Isıtıcısı, örnek tüp sporu, su banyosu, santrifüj ve BD ProbeTec ET Cihazının dış yüzeylerine uygulayın. Çözeltinin 2 dakika boyunca bu yüzeylerde kalmasını sağlayın. Kağıt havlu ve gazlı bezleri suyla ıslatın ve temizleme çözeltilerini temizleyin. Temizleme çözeltilerini uygularken ve suyla durularken havlu ve gazlı bezleri sık sık değiştirin. Kağıt havlu veya gazlı bezleri %1 (h/h) sodyum hipoklorit ve Alconox ile ıslatın ve Pipetör tutacağını silin (SADECE TUTACAĞI SİLİN). 2 dakika sonra tutacağı suyla ıslatılmış kağıt havlu veya gazlı bez kullanarak silin. b. Lize İşlemi Yuvasını, Lize İşlemi Yuvası tabanını, Lize İşlemi Yuvası kapağını ve plakları veya su banyosu yuvasını 1 2 dakika boyunca %1 (h/h) sodyum hipoklorit ve Alconox a batırın. Suyla tamamen durulayın ve havayla kurumaya bırakın. c. Pipetörü tekrar şarj edin. d. Kapalı Atık Çantasını ve biyolojik tehlike atığını kontamine atık malzemelere ilişkin prosedürlere uygun şekilde atın. 29. Aşağıdaki prosedürleri en azından haftalık olarak gerçekleştirin. a. Su banyolarındaki suyu atın. b. Su banyolarını %1 (h/h) sodyum hipoklorit ve Alconox çözeltisiyle temizleyin. Su ile çalkalayın ve kurumaya bırakın. c. Distile su ile tekrar doldurun. Kalite Kontrolü Kalite kontrolleri ilgili yerel, devlet ve/veya federal gereklilikler veya akreditasyon gerekliliklerine veya laboratuvarınızın standart Kalite Kontrol prosedürlerine uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Kullanıcının, uygun Kalite Kontrol uygulamaları için ilgili CLSI (daha önceden NCCLS olan) yönergelerine ve CLIA düzenlemelerine uyması önerilir. Swab Seyreltim Sıvısı ve Kontroller, Swab Seyreltim Sıvısı ve Kontrol Kitinde (tcf/tmp) birlikte sağlanmaktadır. Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı ve Kontroller Solunum ve Ortam Seyreltim Sıvısı ve Kontrol Kitinde (CF/LP/MP) birlikte sağlanmaktadır. Her örnek tipinde ve plaka üzerinde test çalışmasında ve her yeni reaktif lotu numarası için bir pozitif ve bir negatif kontrol bulunmalıdır. Kontroller tesadüfi olarak konumlandırılabilir. Pozitif kontrol önemli reaktif hatalarını izlemek içindir. Negatif kontrol reaktif ve/veya ortam kontaminasyonunu izlemek içindir. Pozitif ve negatif kontrol örnek sonuçlarının raporlanması için sırasıyla pozitif ve negatif olarak test edilmelidir. Kontroller beklenen performansı göstermezse, test çalıştırması geçersiz sayılır ve cihaz hasta sonuçlarını raporlamaz. Çalışma Kontrolleri beklenen sonuçları vermezse, yeni bir kontrol seti, yeni microweller ve işlenen örnekleri kullanarak tüm çalışmayı tekrarlayın. Yeniden test etme için yeterli olmayan miktarda işlenmiş örnek kalırsa, birincil örneğin başka bir kısmını yeniden işleyin. Tekrarlanan kontroller beklenen sonuçları vermezse Teknik Servis le temas kurun (bkz. Sonuçların Yorumlanması ). Priming İşlemi Microwellerinin içine bir Dahili Amplifikasyon Kontrolü (IAC) yerleştirilmiştir. IAC, örnek matriksinin varlığında amplifiye olan nükleik asit hedefi içerir. IAC nin tasarlanma amacı, amplifikasyon reaksiyonun doğruluğunu onaylamak ve işlenen örnekteki potansiyel inhibisyonun tespit edilmesini sağlamaktır. Örnek İşlem Kontrolleri Örnek işlem kontrolleri ilgili akreditasyon kurumlarının gerekliliklerine uygun şekilde test edilebilir. Pozitif ve negatif kontrollerle tüm test sistemi test edilmelidir. Bu amaçla, bilinen pozitif örnekler, bilinmeyen örneklerle birlikte işlenip test edilerek kontrol olarak kullanılabilir. İşlem kontrolleri olarak kullanılan örnekler prospektüse göre saklanmalı, işlenmeli ve test edilmelidir. Pozitif ve negatif kontroller boğaz swablarını (aktarım besiyeri ile veya olmaksızın, sırasıyla Swab Kontrol ve Solunum ve Ortam Kontrolleri) test ederken örnek işleme prosedürlerinin etkililiğini kontrol etmek için tasarlanmıştır çünkü kontroller örneklere benzer şekilde işlem görür. DNA Kontaminasyonu Varlığının İzlenmesi Çalışma alanının ve ekipman yüzeylerinin DNA kontaminasyonu varlığı açısından izlenmesi için aşağıdaki test prosedürleri en az ayda bir kez gerçekleştirilmelidir. Kontaminasyonun bir sorun oluşmadan önce tespit edilebilmesi için ortamın izlenmesi önemlidir. 1. Test edilecek her alan* için bir BBL CultureSwab EZ swabı kullanın. 2. Swab uygulanacak her alan için bir Örnek Tüpü etiketleyin ve her tüpe 1 ml Swab Seyreltim Sıvısı (tcf/tmp) pipetleyin.. İlk swabı Seyreltim Sıvısına batırın ve ilk alanı geniş bir süpürme hareketiyle silin. 4. Swabı Seyreltim Sıvısı içinde karıştırın, swabı akıtın, tüpün kapağını kapatın ve 5 saniye süreyle vorteksleyin. Swabları atın. 5. Swab uygulanan her alan için bu işlemi tekrarlayın. 7

8 6. Tüpleri Lize İşlemi Yuvasına yerleştirin Lize İşlemi Isıtıcısında 1 dakika ısıtın. Yuvayı ısıtıcıdan çıkarın ve devam etmeden önce örnekleri 15 dakika soğumaya bırakın. 7. Tüpler ısıtılırken, swab uygulanan yüzeylerdeki tampon karışımı kalıntısını ortadan kaldırmak için suyla ıslatılmış temiz havlular kullanın. 8. Örnekler soğuduktan sonra, BD ProbeTec ET CF Test Çalıştırması Prosedürü ile devam edin (Bölüm G). * Test edilmesi önerilen alanlar şunlardır: Lize İşlemi Yuvası, Lize İşlemi Isıtıcısı, su banyosu yuvası, mikrosantrifüj, Priming Isıtıcısı, siyah microwell plakları, pipetör tutacağı, cihaz dokunmaya duyarlı tuşları, cihazın klavyesi, su banyolarının kuru yüzeyleri, örnek sporlarının yüzeyleri ve çalışılan tezgahların yüzeyleri ile örnek işlem alanlarıdır. Bir alan pozitif sonuç verirse, bu alanı %1 (h/h) sodyum hipoklorit ve Alconox çözeltisi ile temizleyin. Tüm alanın temizlik çözeltisiyle ıslatıldığından emin olun ve temizlik çözeltisinin yüzey üzerinde en az 2 dakika boyunca veya kuruyana kadar kalmasına izin verin. Gerektiğinde temizleme çözeltisinin fazlasını temiz bir havluyla alın. Alanı suyla ıslatılmış temiz bir havluyla silin ve yüzeyi kurumaya bırakın. Alanı tekrar test edin. Negatif sonuç alana kadar bu işlemi tekrarlayın. Kontaminasyon sorunu çözülemezse, daha fazla bilgi için Teknik Servis i arayın. TEST SONUÇLARININ YORUMLANMASI Chlamydiaceae Familyası DNA sı varlığı veya yokluğu, örneğe ait PAT (Eşikten Sonra Geçişler) sonuçlarının önceden belirlenen eşik değeri ile ilişkilendirilmesiyle belirlenir. PAT sonucu reaksiyonun sonucu olarak üretilen sinyalin büyüklüğünün belirlenmesi için kullanılan bir ölçüttür. Bu ölçüm için, daha büyük sayılar elde edilmesi eşiğe amplifikasyonun erken fazında ulaşıldığı gösterirken, daha küçük sayılar eşiğe daha sonra, reaksiyon sırasında ulaşıldığı anlamına gelir. PAT sonucunun büyüklüğü örnekte bulunan Chlamydiaceae Familyası DNA miktarını göstermez. Test kontrollerinin sonuçları beklenenden farklıysa, hasta sonuçları raporlanmamalıdır. Beklenen kontrol değerleri için Kalite Kontrol bölümüne bakın. Raporlanan sonuçlar aşağıdaki şekilde belirlenir: PAT Sonucu CF Hedefi IAC Hedefi Sonuç Yorum Rapor > > veya = Pozitif SDA ile saptanan Chlamydiaceae Familyası DNA sı. Chlamydiaceae Familyasına ait organizmalar için mevcut enfeksiyonu gösterecek şekilde pozitif. Saptanan türü teşhis etmek için gerekli ilave test. = > Negatif SDA ile saptanmayan Chlamydiaceae Familyası DNA sı. Chlamydiaceae Familyasına ait organizmalar için tahmini negatif. Mevcut DNA seviyesi testin saptama sınırının altında olabileceğinden Chlamydiaceae enfeksiyonu yok sayılamaz. = = Belirlenemeyen Amplifikasyon kontrolü inhibe edilmiştir. Sonucun yorumlanması için ilave test gereklidir. a a İşlenmiş örnek tüpünden tekrar BD ProbeTec ET CF Testi. İşlenmiş örnekten yeterli hacim kalmazsa, orijinal örnekten tekrarlayın veya eğer gerekliyse yeni bir örnek alın. Tekrar sonucu pozitif veya negatifse, yukarıda açıklanan şekilde yorumlayın. Sonuç belirlenemiyorsa yeni bir örnek alınmalıdır. CF ve IAC Eşiğinin Belirlenmesi: Chlamydiaceae Familyası hedef DNA sı için eşik değerleri ve IAC başlangıçta pozitif ve negatif kontrollerden elde edilen verilerin Algılayıcı İşletim Özelliği eğri analiziyle belirlenmiştir. Bu eşik değerleri klinik çalışmalarda kontrol edilmiş ve doğrulanmıştır. PROSEDÜRÜN KISITLI OLDUĞU ALANLAR 1. BD ProbeTec ET CF Testi spesifiktir fakat Chlamydiaceae Familyası üyelerini ayırt edemez (yani C. trachomatis, C. muridarum, C. suis, C. abortus, C. percorum, C. caviae, C. pneumoniae, C. felis ve C. psittaci). 2. BD ProbeTec ET CF Testi yalnızca boğaz swabları ile değerlendirilmiştir (2SP aktarım besiyeri ile veya olmaksızın). Diğer örnek türleriyle performansı belirlenmemiştir.. BD ProbeTec ET CF Testi yalnızca bir yaş ve üzeri hastalarda değerlendirilmiştir. 4. Birçok tanı amaçlı testte olduğu gibi, BD ProbeTec ET CF Testinden gelen sonuçlar da doktorun kullanabileceği diğer laboratuvar verileri ve klinik verilerle ilişkili olarak yorumlanmalıdır. Diğer klinik belirtiler ve semptomlar ve pnömoninin tanı kanıtları ile birlikte bu test için pozitif bir sonuç alınması Chlamydiaceae Familyası kaynaklı pnömoninin göstergesidir. 5. Negatif bir sonuç Chlamydiaceae Familyası kaynaklı pnömoni tanısını yok saymak için kullanılmamalıdır çünkü test sonuçları hatalı örnek toplanması, teknik hata, örnek karışması, eşzamanlı antibiyotik tedavisi veya örnekteki Chlamydiaceae Familyası DNA sı miktarının testin analitik duyarlılığının altında olmasından etkilenebilir. Bu sebeple, yayınlanmış rehberlerde 9 tavsiye edildiği gibi kültür, seroloji ve/veya doğrulanmış nükleik asit amplifikasyon testi gibi ilave tanı test prosedürleri gerekebilir. 6. Chlamydiaceae Familyasından gelen nükleik asitler başarılı antimikrobiyal tedavi sonrasında da ortamda kalabileceğinden, tedavinin başarılı olup olmadığını değerlendirmek için BD ProbeTec ET CF Testi kullanılamaz. 7. Testin optimum performans göstermesi için örneğin doğru şekilde toplanması ve işlenmesi gerekir. 8. BD ProbeTec ET CF Testi, yalnızca test prosedürü ve BD ProbeTec ET Sistemi hakkında eğitim almış personel tarafından kullanılmalıdır. 9. BD ProbeTec ET CF Testi kalitatif sonuçlar sunar. PAT sonucunun büyüklüğüyle örnekte bulunan Chlamydiaceae Familyası DNA miktarı arasında herhangi bir ilişki kurulamaz. 8

9 BEKLENEN SONUÇLAR A: Görülme Sıklığı Chlamydiaceae testinde gözlenen pozitiflik oranı, kullanılan test yöntemi, hastanın yaşı, altta yatan risk faktörlerinin varlığı, coğrafi bölge ve en önemlisi muhtemel mesleki maruziyetini de kapsayan yerel hastalık görülme sıklığına bağlı olarak değişkenlik gösterecektir. B: PAT Sonucu Frekans Dağılımı Prospektif Çalışma Not: Bütün BD ProbeTec ET CF Test sonuçları 2SP aktarım ortamına akıtılan boğaz swabı kültür sonuçları ile karşılaştırılmıştır. Klinik çalışma tasarımının detaylı tanımı için Performans Özellikleri bölümüne bakın. Amerika Birleşik Devletleri ve Kanada içerisinde yedi klinik tesisten 54 hastadan prospektif olarak toplanan toplam 54 boğaz swabı (aktarım besiyeri olmaksızın saklanan) BD ProbeTec ET CF Testi ile test edilmiştir. Kültür sonuçları ile karşılaştırılan başlangıç CF PAT Sonuçlarının frekans dağılımı Şekil 1 de gösterilmiştir. Prospektif olarak toplanan ve kültür testi için 2SP aktarım besiyerine akıtılan boğaz swablarının yetmiş beşi aynı zamanda BD ProbeTec ET CF Testi ile test edilmiştir. Kültür sonuçları ile karşılaştırılan başlangıç CF PAT Sonuçlarının frekans dağılımı Şekil 2 de gösterilmiştir. Retrospektif Çalışma 2SP aktarım besiyerine akıtılan ve dondurularak saklanan retrospektif boğaz swablarının yirmi beşi Avrupa da bir klinik tesiste BD ProbeTec ET CF Testi ile test edilmiştir. Orijinal kültür sonucu ile karşılaştırılan başlangıç CF PAT Sonuçlarının frekans dağılımı Şekil te gösterilmiştir. Aynı örneklerden orijinal PCR sonucu ile karşılaştırılan başlangıç CF PAT Sonuçlarının frekans dağılımı Şekil 4 te gösterilmiştir. Şekil 1: CF PAT Sonucu Frekans Dağılımı Kültür ile Karşılaştırılan Prospektif Boğaz Swabı (aktarım besiyeri olmaksızın) Sonuçları Frekans (-) (+) CF PAT Sonucu 1 Kültür - Kültür + Kültür Sonucu Toplam Negatif Pozitif 5 Toplam

10 Şekil 2: CF PAT Sonucu Frekans Dağılımı Kültür ile Karşılaştırılan Prospektif Boğaz Swabı (2SP Besiyeri) Sonuçları Frekans 5 4 (-) (+) Kültür - Kültür CF PAT Sonucu Kültür Sonucu Toplam Negatif Pozitif 71 Toplam Şekil : CF PAT Sonucu Frekans Dağılımı Kültür (2SP Besiyeri) ile Karşılaştırılan Retropektif Boğaz Swabı (2SP Besiyeri) Sonuçları Frekans (-) (+) 1 Kültür - Kültür CF PAT Sonucu Kültür Sonucu Toplam Negatif Pozitif Toplam

11 Şekil 4: CF PAT Sonucu Frekans Dağılımı PCR (2SP Besiyeri) ile Karşılaştırılan Retropektif Boğaz Swabı (2SP Besiyeri) Sonuçları Frekans (-) (+) CF PAT Sonucu Kültür - Kültür + PCR Sonucu Toplam Negatif Pozitif 4 Toplam C. Kontroller Klinik değerlendirme sırasında, solunum ve ortam kontrolleri (CF/LP/MP) kullanılarak toplam 45 çalışma yürütülmüştür. Bütün çalışmalar kabul edilebilir kontrol sonuçları vermiştir. Swab kontrolleri (tcf/tmp) kullanılarak toplam 78 çalışma yürütülmüştür. Çalışmaların ikisinde kontrol hatası görülmüştür. Hatalardan biri prosedüre bağlı bir hatadır; diğeri ise spesifik bir nedene bağlanamamıştır. CF/LP/MP kontrolleri ve tcf/tmp kontrollerinin PAT sonuçları sırasıyla Tablo 1 ve 2 de özetlenmiştir. Tablo 1: Solunum ve Ortam (CF/LP/MP) Kontrollerinin CF PAT Sonuç Özeti Kontrol N. Aralık 5. Persentil Ortalama Medyan 95. Persentil CF Negatif 45 CF Pozitif 45 9,5 52, 41,4 49, , Tablo 2: Swab (tcf/tmp) Kontrollerinin CF PAT Sonuç Özeti Kontrol N. Aralık 5. Persentil Ortalama Medyan 95. Persentil CF Negatif 77 CF Pozitif 76 28, 52,7 48,5 51,1 51,8 52,5 Performans Özellikleri Prospektif Çalışma BD ProbeTec ET CF Testi, 22 2 solunum dönemi sırasında Amerika Birleşik Devletleri ve Kanada da yedi klinik merkezde prospektif olarak değerlendirilmiştir. BD ProbeTec ET CF Testini çalıştırmak için bir boğaz swabı (CultureSwab EZ aktarım besiyeri olmadan saklanan) alınmıştır. Bir polyester swab alınmış ve kültür testi için 2SP (sükroz fosfat) aktarım besiyerinde süspanse edilmiş ve ikinci bir polyester swab alınarak Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) testi için Tris-EDTA (TE) tamponunda süspanse edilmiştir. Bu sebeple, prospektif olarak toplanan örneklerden BD ProbeTec ET CF Test sonuçları, 2SP ortamından alınan boğaz swab kültürü sonuçları ile karşılaştırılmıştır. Yedi klinik merkezden biri tüm referans Chlamydiaceae kültür testlerini gerçekleştirmiştir. Cinse özgü monoklonal antikor ile boyamadan sonra en az bir inklüsyonun varlığı, örneğin bir Chlamydiaceae türü için pozitif olduğunun göstergesi olarak kabul edilmiştir. FITC-konjuge C. pneumoniae ye özgü monoklonal antikor ile boyamadan sonra en az bir inklüsyonun varlığı, örneğin bir C. pneumoniae için pozitif olduğunun göstergesi olarak kabul edilmiştir. Yedi klinik merkezden biri, prospektif örnekler için PCR testlerinin tamamını gerçekleştirmiştir. BD ProbeTec ET CF Testi için, pozitif hastaların hepsinden, tutarlı negatif örneklerin bir kısmından ve tutarsız sonuçlara sahip bütün örneklerden (yani, BD ProbeTec ET CF Testi ve referans yöntem arasında tutarsızlık olan örnekler) alınıp TE tamponuna akıtılan boğaz swabları üzerinde PCR gerçekleştirilmiştir. PCR testi, C. pneumoniae için spesifiktir ve valide edilmiş bir PCR testi için optimum kriterleri karşılayan yayınlanmış dört protokolden biridir.,9 54 hastadan alınan toplam 54 boğaz swabı (aktarım besiyeri olmadan saklanan) çalışma için dahil olmak için gerekli kriterlere uygundur (yani, radyografik pnömoni kanıtı, hasta yaşı 1, antibiyotik kullanımı 14 gün, geçerli örnek tipinin toplanması, uygun referans yöntemlerinin yürütülmesi, vb.). BD ProbeTec ET CF Testinin performans özelliklerini hesaplamak için boğaz swablarından sonuçlar (aktarım besiyeri olmaksızın) 2SP besiyerine akıtılan paralel boğaz swabından elde edilen kültür sonucu ile karşılaştırılmıştır. Kültür test sonucu pozitif ise bir örnek pozitif olarak kabul edilmiştir. Kültür test sonucu negatif

12 ise bir örnek negatif olarak kabul edilmiştir. Boğaz swablarının sonuçları (aktarım besiyeri olmaksızın) Tablo te özetlenmiştir. Belirlenemeyen hiçbir sonuç yoktur. Tablo : Kültür ile Karşılaştırılan BD ProbeTec ET CF Testi Prospektif Boğaz Swabı Sonuçları (aktarım besiyeri olmaksızın) Kültür Bolge CF Sonucu Pozitif Negatif Toplam 1 Pozitif Negatif 2 a Toplam Pozitif Negatif Duyarlılık (%95 CI) % (/2) (% %84,2) Toplam NA Pozitif 1 b 1 Negatif Toplam NA 4 Pozitif Negatif Toplam NA 6 Pozitif Negatif 4 4 Toplam 4 4 NA 7 Pozitif Negatif 1 c 8 81 Toplam Genel Pozitif 1 1 Negatif 5 5 Toplam % (/1) (% %97,5) % (/) (% %7,8) Özgüllük (%95 CI) %1 (89/89) (%95,9 %1) %1 (26/26) (%86,8 %1) %99 (97/98) (%94,4 %1) %1 (24/24) (%85,8 %1) %1 (4/4) (%89,7 %1) %1 (8/8) (%95,5 %1) %99,7 (5/51) (%98,4 %1) a Her iki örnek için kültür sonuçları 1+ derece gelişme göstermiştir (kuyucuk başına 1 inklüsyon veya 1 ml 2SP besiyeri başına 5 inklüsyon). Her iki örnek için PCR sonuçları negatiftir. b PCR sonucu pozitiftir. c Kültür 2+ derece gelişme göstermiştir (kuyucuk başına 72 inklüsyon veya 1 ml 2SP besiyeri başına 6 inklüsyon). PCR sonucu negatiftir. NA = Geçerli Değildir NOT: PCR testi, C. pneumoniae için spesifiktir ve valide edilmiş bir PCR testi için optimum kriterleri karşılayan yayınlanmış dört protokolden biridir.,9 Prospektif olarak alınan ve kültür testi için 2SP aktarım besiyerine akıtılan boğaz swablarının yetmiş beşi, aynı zamanda BD ProbeTec ET CF Testi ile test edilmiştir. 2SP besiyerine akıtılan boğaz swablarının sonuçları aynı örnekten elde edilen kültür sonuçları ile kıyaslanmıştır. Kültür test sonucu pozitif ise bir örnek pozitif olarak kabul edilmiştir. Kültür test sonucu negatif ise örnek negatif olarak kabul edilmiştir. 2SP aktarım besiyerinde saklanan boğaz swablarının sonuçları Tablo 4 de özetlenmiştir. Belirlenemeyen hiçbir sonuç yoktur. 12

13 Tablo 4: Kültür ile Karşılaştırılan BD ProbeTec ET CF Testi Prospektif Boğaz Swabı Sonuçları (2SP Besiyeri) Kültür Bölge CF Sonucu Pozitif Negatif Toplam 2 Pozitif Negatif 1 a 6 7 Toplam Pozitif 1 c 1 Negatif 2 b 5 7 Toplam Genel Pozitif 1 1 Negatif Toplam Duyarlılık (%95 CI) % (/1) (% %97,5) % (/2) (% %84,2) % (/) (% %7,8) Özgüllük (%95 CI) %1 (6/6) (%9, %1) %97,2 (5/6) (%85,5 %99,9) %98,6 (71/72) (%92,5 %1) a Kültür 2+ derece gelişme göstermiştir (kuyucuk başına 72 inklüsyon veya 1 ml 2SP besiyeri başına 6 inklüsyon). PCR sonucu negatiftir. b Her iki örnek için kültür sonuçları 1+ derece gelişme göstermiştir (kuyucuk başına 1 inklüsyon veya 1 ml 2SP besiyeri başına 5 inklüsyon). Her iki örnek için PCR sonucu negatiftir. c PCR sonucu pozitiftir. NOT: PCR yöntemi testi, C. pneumoniae için spesifiktir ve valide edilmiş bir PCR testi için optimum kriterleri karşılayan yayınlanmış dört protokolden biridir.,9 BD ProbeTec ET CF Testi için prospektif çalışmaya kaydolan her hastadan toplanan boğaz swablarından biri PCR testi için Tris-EDTA tamponunda süspanse edilmiştir. Tüm pozitif, tutarsız (BD ProbeTec ET CF Testipozitif, kültür negatif veya tersi) ve tutarlı negatif örneklerin yaklaşık %1 u, doğrulanmış bir C. Pneumoniae ye özgü PCR yöntemi ile test edilmiştir. Bütün PCR testleri bir klinik tesiste gerçekleştirilmiştir. Toplam 27 hasta C. pneumoniae PCR testi ile test edilen örneklere sahiptir (yani, tutarlı negatif sonuçları olan 21 hasta ve tutarsız sonuçları olan altı hasta). Tablo 5, kültür, BD ProbeTec ET CF Testi ve PCR testinden genel sonuç kombinasyonlarını özetler. Tablo 5: Prospektif Hasta Test Yöntemleri ve BD ProbeTec ET CF Test Sonuçlarının Özeti Kültür Sonucu BD ProbeTec ET CF Test Sonuçları Boğaz Swabı 2SP Besiyeri PCR Sonucu c Hasta Sayımı + a Tutarsız b + M/D M/D 65 M/D 17 M/D M/D 26 M/D M/D 1 Açıklama: M/D = Mevcut değildir + Pozitif Sonucu gösterir - Negatif Sonucu gösterir a İki kültür 1+ derece gelişme göstermiştir (kuyucuk başına 1 inklüsyon veya 1 ml 2SP besiyeri başına 5 inklüsyon). c Bir kültür 2+ derece gelişme göstermiştir (kuyucuk başına 72 inklüsyon veya 1 ml 2SP besiyeri başına 6 inklüsyon). b Örnek test tesisine erimiş halde ulaşmıştır. Yine de kültür yapılmıştır ve sonuç negatiftir. Örnek yetersiz olduğundan kültür sonucu BD ProbeTec ET CF Testi için performans özelliklerini hesaplamada kullanılmamıştır. c PCR yöntemi testi C. pneumoniae için spesifiktir ve valide edilmiş bir PCR testi için optimum kriterleri karşılayan yayınlanmış dört PCR protokolünden biridir.,9 Retrospektif Çalışma Prospektif çalışmada az sayıda pozitif örneğe rastlanması sebebiyle, BD, Avrupa da 25 boğaz swab örneğini akıtan ve 2SP aktarım besiyerinde donduran bir tesis belirlemiştir. Bu retrospektif örnekler sekiz yıla kadar dondurularak saklanmış, örneklerin çoğunluğu (%84, 21/25) altı yıldan kısa süre saklanmıştır. 25 retrospektif örnek, kültür ve PCR kombinasyonu veya yalnızca PCR ile karakterize edilmiştir. 25 örneğin hepsi PCR sonuçlarına sahiptir (22 pozitif, üç negatif). 22 PCR pozitif örneğin, yalnızca dördü pozitif C. pneumoniae kültür sonuçlarına sahiptir. Geri kalan 18 PCR pozitif örnekte ve üç PCR negatif örnekte kültür testi gerçekleştirilmemiştir. 1

14 Kültür test sonucu veya PCR sonucu pozitif ise bir örnek pozitif olarak kabul edilmiştir. Mevcut PCR sonucu negatif ise bir örnek negatif olarak kabul edilmiştir. Mevcut kültür ve/veya PCR sonuçlarına kıyasla 2SP aktarım besiyerinde saklanan boğaz swablarının BD ProbeTec ET CF Testinin yüzde uyum hesapları Tablo 6 da özetlenmiştir. Kültüre kıyasla pozitif benzerlik yüzdesi %1 dür (4/4). PCR ile kıyaslandığında pozitif, negatif ve toplam benzerlik yüzdeleri sırasıyla %81,8 (18/22), %1 (/) ve %84 tür (21/25). Tablo 6: Kültür (2SP Besiyeri) ve/veya PCR (2SP Besiyeri) ile BD ProbeTec ET CF Testi Retrospektif Boğaz Swabı (2SP Besiyeri) Sonuçlarının Karşılaştırılması Kültür ve/veya PCR Yüzde Benzerlik Hesapları (%95 CI) Bölge CF Sonucu Pozitif Negatif Toplam Pozitif Negatif Genel DAN 8 Pozitif 18 a,b 18 Negatif 4 c d 7 Toplam a Kültür ile 18 örneğin dördü C. pneumoniae-pozitif olarak belirlenmiştir. %81,8 (18/22) %1 (/) %84 (21/25) (%59,7 %94,8) (%29,2 %1) (%6,9 %95,5) b PCR ile pozitif olan 18 örnekten ikisi C. psittaci için; 16 örnek C. pneumoniae için pozitif olarak belirlenmiştir. c Dört örnek C. pneumoniae için PCR pozitif olarak belirlenmiştir. d Üç örnek hem Chlamydiaceae türü, hem de türe özgü C. pneumoniae PCR testi ile PCR negatiftir. Kültür testi gerçekleştirilmemiştir. Analitik Çalışmalar BD ProbeTec ET CF Testi amplifikasyon reaksiyonu hacmi, 1 µl işlenmiş örnektir. Analitik Duyarlılık BD ProbeTec ET CF Testinin analitik duyarlılığı Chlamydophila pneumoniae (16 suş), Chlamydia trachomatis (15 serotip), Chlamydophila psittaci (6 suş) ve C. muridarum u (1 suş) kapsayan Chlamydiaceae Familyasına ait temsili bir organizma panelini test ederek belirlenmiştir. Her organizma için C. trachomatis Serotipleri E ve F haricinde, bakteriyel süspansiyonlar reaksiyon başına, 6, 9 ve 12 Temel Yapı (EB) seviyesine seyreltilmiştir. C. trachomatis serotipleri E ve F,, 6, 1.2 ve 1.8 EB/reaksiyon seviyesinde test edilmiştir. Klinik örnekler veya aktarım besiyeri ile gerçekleştirilen çalışmalar için C. pneumoniae ATCC suşu AR9 Chlamydiaceae Familyası için temsil edici organizma olarak seçilmiştir. Boğaz swab örneği matriksi mevcut olması durumunda, BD ProbeTec ET CF Testinin analitik duyarlılığı, swab örneklerinin reaksiyon başına,, 6 ve 9 hücre seviyesini sağlayacak şekilde 2 µl seyreltilmiş C. pneumoniae AR9 stoku ile inoküle edilmesiyle belirlenmiştir. 2SP aktarım besiyeri mevcut olması durumunda, BD ProbeTec ET CF Testinin analitik duyarlılığı, 2SP besiyerinin reaksiyon başına, 9, 12, 2, 4 ve 6 hücre seviyesini sağlayacak şekilde seyreltilmiş C. pneumoniae AR9 stoku ile inoküle edilmesiyle belirlenmiştir. Bütün örnekler üçlü tekrarlar halinde işlenmiş ve test edilmiştir. %1 pozitifliğe dayalı olarak, farklı organizmalar ve örnek matrisleri için analitik duyarlılık Tablo 7 de özetlenmiştir. Bununla birlikte, gerçek Tespit Sınırı (LOD) test edilen en düşük seviyenin altında olabilir. Tablo 7: BD ProbeTec ET CF Testi Farklı İzolatlar için Analitik Duyarlılık* Organizma Analitik Duyarlılık (EB/reaksiyon) C. pneumoniae (16 suş) 6 C. trachomatis serotipleri B, Ba, C, D, I, LGV-1, LGV-2, LGV- 6 C. trachomatis serotip A 9 C. trachomatis serotip G 12 C. trachomatis serotip H, J, K 15 C. trachomatis serotip E ve F sırasıyla, 1.2 ve 2.5 C. psittaci (6 suş) 6 (5 suş) ve 12 (1 suş) C. muridarum (1 suş) 6 İşlenmiş Boğaz Swabları 2SP Aktarım Besiyeri 9 * Aksi belirtilmediği takdirde, LOD test edilen bütün suşlar veya serotipler için medyanı temsil eder. 14

15 Analitik Özgüllük BD ProbeTec ET CF Testi kullanılarak toplam 18 mikroorganizma (86 bakteri, yedi mantar ve 14 virüs, bir parazit) değerlendirilmiştir. Sırasıyla McFarland 5 ve 2 standartlarına eşdeğer bakteriyel süspansiyon kullanarak test edilen Coccidioides immitis ve Haemophilus ducrei hariç olmak üzere tüm bakteriyel izolatlar 1,17 x 1 7 ila,7 x 1 9 CFU/mL veya hücre/ml aralığında konsantrasyonlarda test edilmiştir. Virüsler 1 x 1 6 viral partikül/ml konsantrasyonda test edilirken, Trichomonas vaginalis 4,6 x 1 6 hücre/ml de test edilmiştir. Dört virüs için genomik DNA veya RNA 1 x 1 6 genom/ml konsantrasyonda test edilmiştir. Test edilen mikroorganizmaların hiçbiri pozitif bir sonuç vermemiş veya IAC ı inhibe etmemiştir (Tablo 8). Tablo 8: BD ProbeTec ET CF Testi Analitik Özgüllük Acinetobacter calcoaceticus Haemophilus parainfluenzae Peptostreptococcus Acinetobacter lwoffii Herpes simplex virus-1 asaccharolyticus Actinomyces israelii Herpes simplex virus-2 Peptostreptococcus productus Adenovirus-5 Histoplasma capsulatum Plesiomonas shigelloides Aeromonas hydrophila HIV-I, Klad B Porphyromonas asaccharolytica Alcaligenes faecalis HPV, tip 16 Prevotella melaninogenicus Bacillus subtilis HPV, tip 18 Prevotella oralis Bacteroides fragilis Influenza virus A Propionibacterium acnes Blastomyces dermatitidis Influenza virus B Proteus mirabilis Bordetella bronchiseptica Kingella kingae Providencia stuartii Bordetella parapertussis Bordetella pertussis Branhamella catarrhalis Candida albicans Klebsiella pneumoniae ssp. ozaenae tip 4 Klebsiella pneumoniae ssp. pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Respiratory Syncytial virus, Uzun suş Rhinovirus Candida glabrata Lactobacillus acidophilus Salmonella choleraesuis serotype Candida tropicalis Lactobacillus brevis Enteritidis Citrobacter freundii Legionella pneumophila Salmonella choleraesuis serotype Clostridium perfringens Listeria monocytogenes Typhi Coccidioides immitis Mobiluncus mulierieris Salmonella Minnesota Corynebacterium diphtheriae Moraxella lacunata Salmonella typhimurium Corynebacterium jeikeium Moraxella osloensis Serratia marcescens Corynebacterium renale Morganella morganii Staphylococcus aureus, protein A Cryptococcus neoformans Mycobacterium avium üreten Cytomegalovirus Mycobacterium gordonae Staphylococcus aureus, protein A Edwardsiella tarda Mycobacterium kansasii üretmeyen Eikenella corrodens Mycobacterium intracellulare Staphylococcus epidermidis Enterobacter aerogenes Mycobacterium smegmatis Stenotrophomonas maltophilia Enterobacter cloacae Mycobacterium tuberculosis Streptococcus Grup B Enterococcus faecalis Mycoplasma genitalium Streptococcus mitis Enterococcus faecium Mycoplasma hominis, tip 1 Streptococcus mutans Enterovirus (Echovirus) Mycoplasma pneumoniae Streptococcus pneumoniae Epstein-Barr virus Neisseria cinerea Streptococcus pyogenes Escherichia coli Neisseria gonorrhoeae Streptomyces griseus Flavobacterium meningosepticum Neisseria meningitidis Tatlockia (Legionella) micdadei Fusobacterium nucleatum Neisseria mucosa Trichomonas vaginalis Gardnerella vaginalis Neisseria polysaccharea Ureaplasma urealyticum Gemella haemolysans Parainfluenza I virus Veillonella parvula Haemophilus ducreyi Peptostreptococcus anaerobius Vibrio parahaemolyticus Haemophilus influenzae Yersinia enterocolitica İnterferant Maddeler Boğaz swab örneklerinde rastlanabilen potansiyel interferant maddeler C. pneumoniae ATCC suşu AR9 nin CF DNA sı yokluğunda veya 15 EB/reaksiyon varlığında BD ProbeTec ET CF Testi ile test edilmiştir. Hedef yokluğunda test edilen maddelerin hiçbiri Tablo 9 da listelenen konsantrasyonlarda pozitif sonuç vermemiştir veya IAC yi inhibe etmemiştir. Tablo 9 da listelenen konsantrasyonlarda maddelerin hedef varlığında test edilen bütün örnekler pozitif sonuç vermiştir. 15

16 Öksürük Şurubu Tablo 9: BD ProbeTec ET CF Testi İnterferans için taranan maddeler Test Edilen Maddeler Boğaz Swab Örnekleri Örnekteki Konsantrasyon Robitussin DM %25 Triaminic (üzüm) %25 Nazal Spreyler (havuzlanmış) Vicks Sinex %1 Neo-Synephrine (normal kuvvette) %1 Boğaz Spreyleri Cepacol (soğuk mentol) %25 Vicks Chloraseptic (kiraz) %25 Gargara Scope (orijinal nane) %25 Listerine (orijinal) %25 Pastiller Halls Şekersiz Turunçgil Karışımı %25 Cold-Eeze Çinko %25 Organizmalar Mycoplasma pneumoniae Legionella pneumophila Mycoplasma pneumoniae ve Legionella pneumophila 1 7 hücre/ml 1 7 CFU/mL sırasıyla, 1 7 hücre/ml ve 1 7 CFU/mL Güçlendirilmiş Örnek Çalışması Klinik çalışmada rastlanan pozitif örneklerin sayısını desteklemek için 25 boğaz swabı 5 x 1 4 EB/mL C. pneumoniae ile güçlendirilmiştir (pozitif örnekler). Benzer şekilde, Chlamydiaceae-negatif boğaz swablarını taklit etmek için, 5 swab yalnızca L. pneumophila ve M. pneumoniae içeren bakteriyel süspansiyon ile güçlendirilmiştir. Bütün örnekler BD ProbeTec ET CF Testinde test edilmiştir. Sonuçlar Tablo 1 da özetlenmiştir. Toplam doğruluk %98,7 dir (74/75). Tablo 1: BD ProbeTec ET CF Testi Güçlendirilmiş Boğaz Swab Örneği Sonuçları Güçlendirme Düzeyi Pozitif Negatif Toplam Pozitif 25 1* 26 BD ProbeTec ET CF Test Sonuçları Negatif Toplam *BD ProbeTec ET CF Testi ile başlangıçta hatalı pozitif tekrarlandığında negatif. Tekrarlanabilirlik Boğaz swabları için BD ProbeTec ET CF Testinin tekrarlanabilirliği PBS/BSA da hazırlanan 24 örneği kapsayan test panelleri ile üç laboratuvarda değerlendirilmiştir. Panel C. pneumoniae için negatif olan 12 örneği ve üç düşük ve üç yüksek C. pneumoniae-pozitif örneği içermiştir (sırasıyla 45 ve 75 EB/reaksiyon). Ayrıca, sırasıyla 45 EB, 4 CFU ve 6 hücre/reaksiyon C. pneumoniae (CP), L. pneumophila (LP) ve M. pneumoniae (MP) içeren üç düşük pozitif örnek ve her biri sırasıyla 75 EB, 65 CFU ve 1. bu organizmaları içeren üç yüksek pozitif örnek mevcuttur. Üç tesisin her birinde bir kullanıcı, panelleri üç gün boyunca günde bir defa test etmiştir. Sonuçlar Tablo 11 de özetlenmiştir. Tablo 11: BD ProbeTec ET CF Testi: Boğaz Swabı Tekrarlanabilirliği Örnek Seviyesinde Hesaplamalar Günler arasında Tesis içinde Tesisler Arasında Panel Üyesi N. % Doğru Ortalama PAT SS %VK SS %VK CP-YÜKSEK 27 %1 51,2,1,61,11,21 CP-DÜŞÜK 27 %1 5,7,,,29,58 CP/LP/MP-YÜKSEK 27 %1 51,8,26,51,, CP/LP/MP-DÜŞÜK 27 %1 5,6,,,, Negatif 18 %1, CP-negatif örnekler ile IAC 18 %1 52,,17,2,6,12 16

17 TİCARİ TAKDİM ŞEKLİ Aşağıdaki BD ProbeTec ET ürünleri mevcuttur: Kat. No. Açıklama BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay 447 BD ProbeTec ET Swab Diluent and Control Kit 4471 BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit BD ProbeTec ET Accessories Kit 4471 BD ProbeTec ET Accessories II Kit BD ProbeTec ET Pipette Tips 6 x BD ProbeTec ET Sample Tubes (4, ml) and Caps, 4 ea BD ProbeTec ET 2 ml Sample Tubes, Caps and Labels, BD ProbeTec ET 2 ml Caps, BD ProbeTec ET Instrument, Ex ABD BD ProbeTec ET Instrument, ABD ve Kanada BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater, 22V 4448 BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater, 12V BD ProbeTec ET Lysing Heater, 22V 4448 BD ProbeTec ET Lysing Heater, 12V BD ProbeTec ET Pipettor 4452 BD ProbeTec ET Lysing Rack REFERANSLAR 1. Bartlett, J.G., Dowell, S. F., Mandell, L.A., File, T.M., Musher, D.M., Fine, M.J. 2. Guidelines from the Infectious Diseases Society of America - Practice guidelines for the management of community-acquired pneumonia in adults. Clin Infect Dis 1: Murray et al Manual of clinical microbiology, 7th edition, ASM Press.. Dowell, S.F., Peeling, R.W., et.al. 21. Standardizing Chlamydia pneumoniae Assays: Recommendations from the Centers for Disease Control and Prevention (USA) and the Laboratory Centre for Disease Control (Canada). Clin Infect Dis : National Committee for Clinical Laboratory Standards. 21. Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd. ed. NCCLS, Wayne, Pa. 5. Garner. J.S Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17: U.S. Department of Health and Human Services Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 7. Directive 2/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/91/EEC). Official Journal L262, 17/1/2, p Isolation of Chlamydia ssp. in cell culture. In: Clinical microbiology procedures handbook, Isenberg HD (Ed.), 1992, American Society for Microbiology, Washington DC, pp Mandell, L.A., Bartlett, J.G., et. al. 2. Update of practice guidelines for the management of communityacquired pneumonia in immunocompetent adults. Clin Infect Dis 7:

18 18

19 m Becton, Dickinson and Company A BENEX Limited 7 Loveton Circle Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Sparks, Maryland USA Shannon, County Clare, Ireland Tel: Fax: ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. Alconox is a trademark of Alconox, Inc. BD, BD Logo, BBL, BD ProbeTec and CultureSwab are trademarks of Becton, Dickinson and Company. 28 BD