PLATELIA ASPERGILLUS EIA TEST

Transkript

1 PLATELIA ASPERGILLUS EIA TEST PLATELIA ASPERGILLUS EIA, SERUM İÇİNDE ASPERGILLUS GALACTOMANNAN ANTİJEN BULUNMASI İÇİN İMMUNOENZİMATİK SANDVİÇ MİKRO PLAKA TESTTİR 1- KULLANIM AMACI Platelia Aspergillus EIA, serum örnekleri içinde aspergillus galaktomannan antijen bulunması için immunoenzimatik sandviç mikro plaka testtir 2- KULLANIM İÇİN BELİRTİLER Platelia Aspergillus EIA, mikrobiyolojik kültür, biyopsi örneklerinin histolojik incelenmesi ve radyografik bulgu gibi diğer teşhis prosedürleri ile bir arada kullanıldığında, İnvazif Aspergillosis teşhisinde yardımcı olarak kullanılabilir. 3- ÖZET VE AÇIKLAMA Aspergillus enfeksiyonları genellikle ortamda bulunan Aspergillus sporlarının solunmasından sonra ortaya çıkar. Son 10 yılda artış gösteren invazif formları en ciddi enfeksiyonları oluşturur. Bunlar genellikle nötropenik hastalarda (anti kanser tedavisinin ardından) ve bağışıklık bastırıcı tedavi gören hastalarda (organ nakilleri özellikle kemik iliği nakli) ve kortikosteroid kullanan hastalarda görülür7. Aspergillus nadiren kan kültüründen izole olur. Teşhis sıklıkla spesifik olmayan tanı veya radyolojik bulgulara dayalıdır (klinik semptomlar, CT tarama, göğüs röntgeni vs.) Şu anda, serum içinde çözülebilir galaktomannan antijen için test İnvazif Aspergillosis teşhisinde yardımcı serolojik metot olarak kullanılmaktadır 6, 9,14, 34, PROSEDÜR PRENSİBİ 27 Platelia Aspergillus EIA, insana serumu içinde galaktomannan algılayan tek aşamalı immunoenzimatik sandviç mikro plaka testtir Test rat EBA-2 monokolonal antibadileri kullanır, bunlar Aspergillus galaktomannana yönlendirilir ve böylelikle karakterize edilmelerini sağlar Önceki çalışmalarda 16, 28. Monoklonal antibadileri, (1) mikroplaka çukurcuklarını kaplamak ve antijeni bağlamak ve (2) hassaslaşan mikro plakaya yapışan antijeni algılamak için kullanılırdı (konjuge reaktif: peroksidaz bağlı monoklonal antibadileri) Serum örnekleri EDTA mevcudiyetinde ısıl işleme tabi tutularak immun komplekslerin bağları çözülür ve test ile interferans yaratması olası serum proteinleri çöktürülür 15. İşleme tabi tutulmuş serum örnekleri ve konjuge monoklonal antibadiler ile kaplanmış çukurcuklara eklenir ve inkübe edilir. Galaktomannan antijen varlığında, monoklonal antibadi - galaktomannan monoklonal antibadi / peroksidaz kompleksi oluşur. Bağlanmamış materyallerin çıkartılması için şeritler yıkanır. Sonra, subsrat çözeltisi eklenir, bu çukurcuklara bağlanan kompleksler ile reaksiyona girerek mavi renk reaksiyonu oluşturur. Enzim reaksiyonu asit eklenerek durdurulur, bu işlem mavi rengi sarıya dönüştürür. Örneklerin absorbansı (optik yoğunluk) ve kontrol 450 ve 620 nm dalga uzunluğuna ayarlı spektrometre ile belirlenir. 5- REAKTİFLER Platelia Aspergillus EIA: ürün No (96 Test) Kiti 2-8 C de saklayın. Kullanımdan önce tüm reaktifler oda sıcaklığına (18-25 C) getirilmelidir. Kontroller dışındaki tüm reaktifleri kullanımdan sonra hemen 2-8 C ye geri alın. Sulandırmadan sonra, kullanılmamış Negatif Kontrol, Kesim Kontrolü ve Pozitif Kontrol -20 C de dondurulmalıdır. Kullanılmamış şeritleri/plakaları poşete geri koyun ve ağzını kapatın. Kurutucuyu çıkartmayın. Şeritler açıldıktan ve poşetin ağzı tekrar kapatıldıktan sonra 5 hafta içinde kullanılmalıdır. Seyreltmenin ardından, Çalışma Yıkama Çözeltisi 2-8 C de 14 gün saklanabilir. Diğer tüm reaktifler açılıştan sonraki son kullanma zamanına kadar stabildir. Reaktifler maksimum 9 partide toplam 96 test yapmak için yeterlidir. 1

2 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 Bileşen İçindekiler Miktar Mikro plaka: Mikro Çukurcuk - 96 çukurcuk (12 şerit her birinde 8 çukurcuk) antigalaktomannan Şerit Plaka monoklonal antibadi kaplı Konsantre Yıkama Solüsyonu Negatif Kontrol Serumu Kesme Kontrol Serumu Pozitif Kontrol Serumu Konjuge Serum İşlem Çözeltisi TMB Subsrat Tamponu Kromojen: TMB Çözeltisi Konsantre Yıkama Solüsyonu (10X): - Tris NaCl tampon - %1 Tween 20 - %0.01 thimerosal Negatif Kontrol Serumu: - Galaktomannan için dondurularak kurutulmuş insan serumu - Anti-HIV-1, anti-hiv-2, anti-hcv antibadiler ve HBs antijen için negatif Kesme Kontrol Serumu: - Galaktomannan içeren dondurularak kurutulmuş insan serumu - Anti-HIV-1, anti-hiv-2, anti-hcv antibadiler ve HBs antijen için negatif Pozitif Kontrol Serumu: - Galaktomannan içeren dondurularak kurutulmuş insan serumu - Anti-HIV-1, anti-hiv-2, anti-hcv antibadiler ve HBs antijen için negatif Konjuge (kullanıma hazır): - Anti-galaktomannan monoklonal antibadi / peroksidaz etiketli - Koruyucu: %0.01 thimerosal Serum İşlem Çözeltisi (kullanıma hazır): - EDTA asit çözeltisi TMB Subsrat Tamponu (Kullanıma Hazır): - Sitrik asit ve sodyum asetat - %0.009 hidrojen peroksit - %4 dimetilsülfoksit (DMSO) Kromojen TMB Çözeltisi (konsantre): - %0.6 tetrametilbenzidin içeren (TMB) %90 dimetilsülfoksit (DMSO) çözeltisi 1 Plaka / 12 x 8 Çukurcuk 1 x 100 ml 3 x qs* 1 ml 3 x qs* 1mL 3 x qs* 1 ml 1 x 8 ml 1 x 10.5 ml 1 x 60 ml 1 x 1 ml R10 Durdurma Çözeltisi Durdurma Çözeltisi (kullanıma hazır): N sülfirik asit (H2SO4) 1 x 12 ml Plaka izolasyonu - Mikro plakalar için yapışkan bantlar 1 x 8 yaprak Not: TMB (tetrametilbezidin) peroksit için kanserojen ve mutajenik olmayan kromojendir. *Not: qs: yeterli miktar. 6- KULLANICILAR İÇİN UYARILAR 1. ın vitro teşhis içindir. 2. sadece profesyonel kullanım içindir. 3. Bu test kitinin insan serumu dışındaki örneklerle kullanımı tavsiye edilmez. 4. Pozitif Kontrol, Kesme Kontrollü ve Negatif Kontrol CE işaretli testler ile test edilerek HBsAg ve HIV-1, HIV-2 ve HCV antibadileri ile reaktif olmadığı belirlenmiş insan serumundan üretilmiştir. Bununla birlikte, tüm reaktifler enfeksiyon geçirme riskine sahip şekilde kullanılmalıdır. Tüm testler Kandaki Patojenler için OSHA Standardı, Bio güvenlik Seviye 2 veya diğer uygun bio güvenlik uygulamalarına uygun şekilde yapılmalıdır. 5. Laboratuar önlüğü, göz/yüz koruyucu ve tek kullanımlık eldivenler (sentetik, latex olmayan eldivenler tavsiye edilir) kullanın ve kit reaktifleri ve hasta örnekleriyle İyi Laboratuar Uygulamalarına uygun şekilde ilgilenin. Testi yaptıktan sonra ellerinizi güzelce yıkayın. 6. Ağzınızla pipete çekmeyin. 7. Örnek veya test reaktifi bulunan alanlarda sigara ve içecek içemeyin ya da yemek yemeyin. 8. Örnek veya çözeltileri dökmekten kaçının. 9. Asit içermeyen biyolojik serpintiler efektif dezenfektan ile güzelce temizlenmelidir. Kullanabileceğiniz dezenfektanlar (bunlarla sınırlı değildir) %10 çamaşır suyu (%0.5 sodyum hipoklorit), %70 etanol veya %0.5 Wescodyne Plus. Döküntülerin temizlenmesinde kullanılan malzemelerin biyolojik tehlikeli atık işlemine tabi tutulması gerekebilir. DİKKAT: Çamaşır suyu içeren çözeltileri otoklava koymayın. 2

3 10. Asit içeren döküntüler uygun şekilde emdirilerek (silinerek) veya sodyum bikarbonat ile nötralize edilerek silinmeli ve bölge yıkanıp kurulanmalıdır; eğer biyolojik olarak tehlikeli malzeme varsa, alanı kimyasal dezenfektanlardan biri ile silin. 11. Tüm örnekleri ve test için kullanılan malzemeleri enfeksiyon unsuru içeriyormuşçasına bertaraf edin. Laboratuar kimyasalları ve biyolojik olarak tehlikeli atıklar yerel, bölgesel ve ulusal yönetmeliklere uygun şekilde atılmalıdır. 12. DİKKAT: Aşağıdakiler bazı kit bileşenlerinde bulunan potansiyel kimyasal tehlikelerin listesidir (bkz bölüm 5 - REAKTFİLER): C-Maró 1.5 N Sülfürik Asit (7.2% H2SO4) Durdurma Çözeltisi Aşındırıcıdır, göz ve ciltte yanmaya sebep olabilir; yutulması veya cilt ile teması tehlikeli olabilir; gözde ciddi hasara sebep olabilir, kalıcı görme bozukluğu ya da körlüğe sebep olabilir. Güçlü bazlardan ve azaltıcı etkin maddelerden uzak tutun. R34-41 Yanıklara yol açar. Gözler için ciddi zarar riski. S24/ /37/ Cilt ve gözler ile temasından kaçının. Gözlerlere temas etmesi durumunda bol su ile yıkayın ve doktora gidin. Bu ürüne asla su eklemeyin. Uygun koruyucu kıyafetleri giyin, eldiven ve göz/yüz koruyucu kullanın. Bu malzeme ve şişesi tehlikeli atık olarak atılmalıdır. Bu malzemenin atıkları tehlikeli asidik atık olarak kabul edilir, bununla birlikte eğer yerel, bölgesel veya ulusal yönetmelikler izin veriyorsa, tehlikeli olmayan atık olması için ph 6-9 arasında nötrleştirilebilir, ancak bunun eğitimli olmak ve gereken donanıma sahip olmak gereklidir. %0.01 Thimerosal (Merthiolate Sodyum), merkezi sinir sistemini (CNS) hedefleyen an organa-cıva biyosidal koruyucudur, reprodüktür zehirli madde ve önemli duyarlayıcıdır; uzun süre veya sürekli maruz kalmak bazı hassas bireylerde alerjik reaksiyonlara sebep olabilir; Seyreltilmiş Thimerosal çözeltilerinden kaynaklanmış duyarlılık vakaları mevcuttur. Ortama yayılmasından kaçının, kümülatif etki tehlikesi. Konsantrasyonu 0.2 ppm den yüksek olan cıva içeren çözeltiler ABD Federal RCRA tehlikeli atık (D009) yönetmeliğine göre bertaraf edilmelidir, ancak tüm atıklar yerel, bölgesel ve ulusal yönetmeliklere göre bertaraf edilmelidir. (Not: cıva (Hg) Thimerosal molekülünün %49.55 ni oluşturur, bu yüzden %0.01 Thimerosal yaklaşık olarak %0.005 (~50 ppm) cıva içerir). Cilt ile temas etmesi durumunda, bol su ile yıkayın. Uyarı: Thimerosal Kaliforniya Eyaletinde reprodüktör toksisiteye sebep olur şeklinde bilinmektedir. 13. Malzeme Güvenlik Veri Sayfası (MSDS) istek üzerine sağlanabilir. 7- KULLANICILAR İÇİN ÖNLEMLER 1. BİLİNMEYEN ŞARTLARDA SAKLANAN DONDURULMUŞ SERUM ÖRNEKLERİ MANTAR VE/VEYA BAKTERİ KONTAMİNASYONU SEBEİYLE YANLIŞ POZİTİF SONUÇ VEREBİLİR. 2. Belirtilmiş son kullanma tarihinden sonra kit veya kit reaktiflerini kullanmayın. 3. Konsantre Yıkama Çözeltisi (R2) ve Durdurma Çözeltisi (R10) istisnaları dışında reaktifleri farklı lot numarasına sahip başka kitlerdeki reaktifler ile karıştırmayın. 4. Tüm reaktifler kullanımdan en az 15 dakika önce oda sıcaklığına getirilmelidir. 5. Reaktifleri sulandırırken iyice karıştırın, mikro biyolojik kontaminasyona yol açmamaya dikkat edin. 6. Testleri Konjugenin enzimatik aktivitesini etkileyebilecek reaktif buhar (asit, alkali, aldehid) veya toz bulunan yerlerde yapmayın. 7. Subsrat Kromojen Reaksiyon Çözeltisini hazırlamak için temiz, tek kullanımlık polipropilen plastik kap kullanın. Eğer cam kullanılacaksa, önce 1N hidroklorik asit ile yıkanmalı ve saf su ile yıkanarak kurutulmalıdır. 8. Kontrol ve örneklerin manuel olarak pipetlenmesinde örnek bulaşmasını önlemek için her seferinde farklı pipet ucu kullanın. 9. Çukurcukların yeterli miktarda yıkandığından emin olmak için, tavsiye edilen yıkama döngü sayısına uyun ve çukurcukların tamamen dolduğundan ve tamamen boşaldığından emin olun. Yıkama sıkılabilir şişe ile manuel olarak yapılmalıdır. 10. Mikro plakanın yıkama döngüsü ile reaktif ekleme arasında kurumasına izin vermeyin. 11. Konjuge ve subsrat çözeltiler için aynı kabı kullanmayın. 12. Konjuge ve Subsrat Kromojen Reaksiyon Çözeltilerinin metal ya da metalik iyonlarla temas etmesine izin vermeyin. 13. Kromajeni şunlara maruz bırakmayın: TMB Çözeltisi veya SUbsrat Kromojen Çözeltisi saklama veya inkübasyon sırasında güçlü ışığa maruz kalmamalıdır. Kromojen çözeltilerine oksidasyona sebep olan etken maddelerle temas etmesine izin vermeyin. 14. Durdurma Çözeltisinin oksidasyona sebep olan etken maddelerle temas etmesine izin vermeyin. Durdurma Çözeltisinin metal veya metalik iyonlarla temas etmesine izin vermeyin. 15. Temiz, tozsuz malzemeler (tüpler, uçlar, kaplat vs) kullanın, bu ortamdaki Aspergillus sporlarından kaynaklanabilecek kontaminasyon olasılığını azaltır Galaktomannan ısı dengeli olduğundan, malzemenin sterilizasyonu kontaminasyona sebep olan antijen yokluğunu garanti etmez. Pirojen içermeyen malzemeler en uygundur, ancak yeterli dikkat ile standart malzemeler kullanılabilir. 3

4 16. Çözeltilerin (sera, Serum İşlem Çözeltisi, Konjuge) veya açık kapların (plakalar, tüpler, pipetler) hava ile temasını sınırlayın. 17. Kullanmadığınız kalan Konjugeyi orijinal kaba geri dökmeyin. 18. Subsrat Kromojen Reaksiyon çözeltisi renksiz olmalıdır. Seyreltme sonrasında mavi renk olması reaktifin kontamine olduğunu gösterir ve bu durumda kullanılmamalıdır. Atın ve yeni reaktif hazırlayın. 8- REAKTİF HAZIRLAMA VE SAKLAMA Mikro Çukurcuk Şerit Plaka (R1) Plaka poşetini açtıktan sonra, mikro çukurcuk şeritleri +2-8 C sıcaklıkta, birlikte verilen kurutucu ile birlikte ağzı dikkatle kapatılmış orijinal torbasında muhafaza edildiğinde 5 hafta boyunca stabil kalır. Çalışma Yıkama Solüsyonu (R2) Çalışma Yıkama Çözeltisini 1 ölçek Konsantre Yıkama Çözeltisini 9 ölçek steril deiyonize su veya saf su ile karıştırarak hazırlayın. Çalışma Yıkama Çözeltisi 2-8 C de 14 gün saklanabilir. Çalışmayı tamamlamak için yeterli miktarda Çalışma Yıkama Çözeltisi hazırlayın (bir şerit için 80 ml: 8 ml R ml saf su) Konsantre Yıkama Çözeltisi açıldıktan sonra C de saklanabilir, kontaminasyon olmadığı takdirde etiketteki son kullanma tarihine kadar stabildir. Negatif Kontrol Serumu (R3) Bir şişe kontrol içeriğini 1000 μl (1 ml) steril, saf su (tercihen pirojen içermeyen su) ile sulandırın. Testi yapmadan hemen önce serumun su kaybı giderilmelidir. Serum su kaybının giderilmesi için 2-3 dakika bekledikten sonra iyice karıştırın. Her 3 polipropilen santrifüj tüpüne 300 μl paylaştırın. Su kaybının giderilmesinden sonra kullanılmayacak geri kalan polipropilen santrifüj tüplerini hemen - 20 C de dondurun. Not: Daha önceden su kaybı giderilmiş ve -20 C de dondurulmuş kontrol serumu ısıtılarak başka su kaybı giderilmesine ihtiyaç olmadan kullanılabilir. Dondurulmuş su kaybı giderilmiş kontroller beş haftaya kadar -20 C de saklanabilir. Kontrol serumu hasta örnekleri ile aynı şekilde tutulmalıdır (300 μl serum μl Serum İşlem Çözeltisi, vs...). Kesme Kontrol Serumu (R4) ve Pozitif Kontrol Serumu (R5) Yukarıda Negatif Kontrol Serumunda anlatılan şekilde hazırlayın. Subsrat Kromojen Reaksiyon Çözeltisi (R8+R9) Subsrat Kromojen Reaksiyon Çözeltisini bir ölçek Kromojen: TMB Çözeltisi, R9, 50 ölçek TMB Subsrat Tampon, R8 ile karıştırarak hazırlayın. Her şerit için 2 ml Subsrat Kromojen Reaksiyon Çözeltisi hazırlayın: 40 μl R9 + 2 ml R8. Çözelti oda sıcaklığında ( C) karanlıkta saklandığında 6 saat boyunca stabildir. R8 ve R9 reaktifleri açıldıktan sonra +2-8 C de saklanabilir, kontaminasyon olmadığı takdirde etiketteki son kullanma tarihine kadar stabildir. Konjuge (R6), Serum İşlem Çözeltisi (R7) ve Durdurma Çözeltisi (R10) R6, R7 ve R10 reaktifleri açıldıktan sonra +2-8 C de saklanabilir, kontaminasyon olmadığı takdirde etiketteki son kullanma tarihine kadar stabildir. 9- ÖRNEK ALMA Kan örnekleri standart laboratuar prosedürlerine göre alınmalıdır. Test serum üzerinde yapılır. Serum örnekleri mantar sporları ve/veya bakteri ile kontamine olmamalıdır. Örnekler sızdırmaz tüplerde, hava ile temas etmeden taşınmalı ve saklanmalıdır. Açılmamış örnekler 2-8 C de testten önce 5 güne kadar saklanabilir. İlk açılıştan sonra örnekler 2-8 C de teste kadar 48 saat saklanabilir. Daha uzun saklamalar için serum 70 C de saklanmalıdır. Serum örnekleri maksimum 4 dondurma / çözme döngüsüne tabi olabilir. Önceden dondurulmuş örnekler test öncesinde çözüldükten sonra iyice karıştırılmalıdır. Sonuçlar 20 mg/l of bilirubin içeren örneklerden, 2 g/l triolein (trigliserid) içeren lipedemik örneklerden veya 165 mg/l hemoglobin içeren hemolizli örneklerden etkilenmez. Aşırı albümin ile ilişkili interferans test edilmemiştir. Serumu eksiltmeyin. 10-PROSEDÜR Sağlanan malzemeler Bkz REAKTİFLER bölümü. 4

5 Gerekli olan ama sağlanmamış malzemeler 1. Konsantre Yıkama Çözeltisinin seyreltilmesi için steril distile veya deiyonize su. 2. Kontrol serumunun sulandırılması için steril saf su. 3. Emici kağıt. 4. Tek kullanımlık eldivenler. 5. Koruyucu gözlükler. 6. Çamaşır suyu ve sodyum bikarbonat. 7. Pipet veya çoklu pipet, ayarlanabilir veya sabit, 50 μl, 100 μl, 300 μl, ve 1000 μl ölçmek ve vermek için ml polipropilen santrifüj tüpleri, hava geçirmez tıpalı, 120 C (ısı bloğu) veya 100 C (kaynar su banyosu) dayanıklı. a. Vidalı kapaklı tüpler: 1.5 ml Konik Tüpler, Bio-Rad Kat. # veya dengi. b. Geçme kapaklı tüpler: EZ Mikro Test Tüpler, 1.5 ml, Bio-Rad Kat. # veya dengi. 9. Mikro tüp kapak kilitleri (VWR Kat. # veya dengi). Bu kilitler geçmeli kapaklı tüplerin sızdırmazlığını sağlayarak tüplerin sıcaklık veya basınç değişikliklerinde açılmasını önler ve tüplerin ısı bloğundan ya da kaynar su banyosundan kolayca alınmasını sağlar. 10. Laboratuar tipi santrifüj, polipropilen 1.5 ml tüpler için uygun, 10,000g elde edebilir. 11. Yüzer mikro santrifüj rafı. 12. Vorteks karıştırıcı. 13. Isı bloğu. Aşağıdaki ısı blokları tavsiye edilir: a. 1 blok model: Grant Kat. # QBD1 (VWR Kat. # ) b. 2 blok model: Grant Kat. # QBD2 (VWR Kat. # ) 14. Isı bloğu için blok: her iki ısı bloğu da Grant blok Kat. # QB-E1 (VWR Kat. # ) ile kullanılmalıdır C kaynar su banyosu 16. Mikro plaka inkübatörü 37 ± 1 C. 17. Yarı otomatik veya otomatik mikro plaka yıkayıcı nm ve 620 nm filtrelere sahip mikro plaka okuyucu. Prosedüre İlişkin Yorumlar Negatif, Pozitif ve Kesme kontrolleri test sonuçlarının validasyonu için her seferinde test edilmelidir. Serum işlemi Tüm kontrol serumları: negatif (R3), kesme (R4) ve pozitif (R5) serum örnekleri ile aynı anda işlenmelidir: 1. Her test serumu ve kontrolden 300 μl pipet ile alınarak 1.5 ml polipropilen tüplere konur. 2. Her tüpe 100 μl Serum İşlem Çözeltisi (R7) ekleyin. 3. Tüpleri güçlü şekilde elde veya vorteks karıştırıcı ile karıştırın. Geçmeli kapaklı tüplerin ısıtma sırasında açılmaması için kapaklarını sıkıca kapatın: kapak kilidi kullanın. Tıpayı delmeyin. 4. Isı bloğu opsiyonu: Tüpleri ısı bloğunda 120 C de 6 dakika ısıtın. Tüpler sadece belirlenmiş ısıya ulaşıldıktan sonra bloğa yerleştirilmelidir.(*) VEYA Su banyosu opsiyonu: Eğer kaynayan su banyosu kullanılıyorsa: tüpleri 100 C de 3 dakika ısıtın. (*) 5. Tüpleri ısı bloğundan veya kaynar su banyosundan dikkatle alın ve santrifüje yerleştirin. 10,000 x g ile 10 dakika santrifüje tabi tutun. 6. Galaktomannan antijen belirlemesi için üstte yüzen faz kullanılır. 7. Aşağıdaki prosedürü kullanarak üstte yüzen kısmı test edin. Hazırlamanın ardından, üstte yüzen kısım alınarak 2-8 C de test edilene kadar 48 saat saklanabilir. Eğer analiz sonucu tekrar test etmenin gerekli olduğunu gösterirse, test için başka bir serum parçası işleme tabi tutulabilir. (*) Verilen sıcaklık ve dönüş sürelerine kesinlikle uyulması ve tavsiye edilen malzemelerin kullanılması testin başarısı için gereklidir. Cihaz üzerinde gösterilen sıcaklığı dikkate almayın, sıcaklığın spesifikasyonlara uygunluğunu kalibre edilmiş bir termometre ile kontrol edin: ısı bloğu içinde sıcaklık 120 C kaynar su banyosunda ise 100 C olmalıdır. EIA Prosedürü Önerilen protokole kesinlikle uyulmalıdır. İyi Laboratuar Uygulamalarına uyun. 1. Reaktifleri kullanımdan en az 15 dakika önce oda sıcaklığına (18-25 C) getirin. 2. Çalışma Yıkama Çözeltisini, Subsrat-Kromojen Reaksiyon Çözeltisini ve Negatif, Pozitif ve kesme Kontrollerini hazırlayın. 3. Test serumu ve kontrollerin mikro plakada tanımlanması için bir tablo hazırlayın. Negatif Kontrol Serumu (R3) için bir çukurcuk, Kesme Kontrol Serumu için (R4) iki çukurcuk ve Pozitif Kontrol Serumu için (R5) bir çukurcuk kullanın. 5

6 4. Plaka tutucuyu ve mikro çukurcuk şeritlerini (R1) plaka poşetinden çıkartın. Kullanılmayacak şeritleri kurutucu ile birlikte poşete koyun ağzını sıkıca kapatın. 5. Konjuge şişesinin (R6) içindekileri kullanmadan önce çalkalayarak karıştırın. Her çukurcuğa 50 μl Konjuge (R6) ekleyin. Sonra her çukurcuğa 50 μl işlem görmüş serum üst yüzeyi yukarıda belirtilen şekilde ekleyin. Serum örnekleri çukurcuklara konjugeden önce eklenmemelidir. 6. Plakayı plaka izolatörü veya buharlaşmayı önleyecek başka bir yol ile kapatın, tüm yüzey kapalı ve su geçirmez olmalıdır. 7. Mikro plakayı kuru inkübatör içinde 37 C de (± 1 C) 90 ± 5 dakika inkübe edin. 8. Plaka izolatörünü çıkartın. Çukurcukların içindekileri atık kabına aspire edin (içinde çamaşır suyu olmalıdır). Plakayı minimum 370 μl Çalışma Yıkama Çözeltisi kullanarak 5 kez yıkayın. Son yıkamanın ardından mikro plakayı ters çevirerek emici kağıda hafifçe vurarak kalan sıvıdan kurtulun. 9. Her çukurcuğa hızla 200 μl Subsrat Kromojen Reaksiyon Çözeltisi (R8 + R9) ekleyin ve parlak ışığa maruz kalmasından kaçının. 10. Mikroplakayı oda sıcaklığında (18 ila 25 C) karanlık ortamda 30 ± 5 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında yapışkan bant kullanmayın. 11. Her çukurcuğa 100 μl Durdurma Çözeltisi (R10) ekleyin, Subsrat-Kromojen Reaksiyon Çözeltisi ile aynı sırada koyun. İyice karıştırın. 12. Her plakanın altını iyice silin. 13. Her çukurcuğun optik yoğunluğunu 450 nm de okuyun (referans filtre 620 nm). Mikro plakalar Durdurma Çözeltisi eklendikten sonra 30 dakika içinde okunmalıdır. 11- KALİTE KONTROLÜ (GEÇERLİLİK KRİTERİ) Kesme Kontrolü: Her Kesme Kontrol Serumu için O.Y ve olmalıdır. Pozitif Kontrol: Pozitif Kontrol Serum indeksi 2.00 den büyük olmalıdır. OY Pozitif Kontrol (R5) I = Kesme Kontrol OY Ortalaması > 2,00 Negatív kontroll: A negatív kontrollszérum indexe kisebb kell legyen, mint 0,40. OY Negatif Kontrol (R3) I = < 0,40 Kesme Kontrol OY Ortalaması Herhangi bir kontrolün yukarıda açıklanan geçerlilik kriterine uymaması durumunda, test geçersizdir ve hasta örneği rapor edilmemelidir. Operatör prosedürü gözden geçirdikten sonra testi tekrarlamayı veya daha fazla yardım almak için üreticiyle temasa geçmeyi seçebilir. Eğer test tekrarlanırsa, aynı örnekten yeni bir parça tekrarlanan testte kullanılmalıdır. Örnek Hesaplama: Örnek Absorbans (OY) Negatif Kontrol (R3) OY Kesme Kontrol (R4) OY Pozitif Kontrol (R5) OY Hesaplamalar Kesme Kontrol Ortalaması Değeri Kesme Kontrol (R4) OY Otlamasını hesaplamak için, Kesme Kontrol replikaları için OY değerlerini toplayın ve sonucu 2 ye bölün: ( ) 2 = Negatif Kontrol İndeks Negatif Kontrol indeksini hesaplamak için, Negatif Kontrol OY, Kesme Kontrol OY Ortalamasına bölünmelidir: I = =

7 Pozitif Kontrol İndeksi Pozitif Kontrol indeksini hesaplamak için, Pozitif Kontrol OY, Kesme Kontrol OY Ortalamasına bölünmelidir: I = = 4.44 Geçerlilik Yukarıdaki örnekte: Her bir Kesme Kontrol OY ve şeklinde olduğundan Kesme Kontrol geçerlidir. Negatif Kontrol indeksi < 0.40 olduğundan, Negatif Kontrol geçerlidir. Pozitif Kontrol indeksi > 2.00 olduğundan, Pozitif Kontrol geçerlidir. Sonuçlar her bir kontrol içinde geçerlilik kriterlerine uyduğundan, örnekteki test çalışması geçerli olarak kabul edilir. 12-SONUÇLARIN YORUMLANMASI Test örneğinde galaktomannan varlığı veya yokluğu her hasta örneği için indeks hesaplamasıyla bulunur. İndeks (I), örneğin OY değerinin Kesme Kontrol Serumu içeren çukurcukların optik yoğunluklarının ortalamasına bölünmesi ile bulunur. Kesme Kontrol optik yoğunluk ortalamasının hesaplanması: Kesme Kontrol Serumu (R4) içeren iki çukurcuğun optik yoğunluklarını toplayın ve toplamı 2 ye bölün. Her test serumu için indeks (I) hesaplanması: Her test serumu için aşağıdaki oranı hesaplayın: I = örnek OY Kesme Kontrol OY Ortalaması İndeksi < 0.50 olan serumlar galaktomannan antijen için negatif olarak kabul edilir. Not: Negatif sonuç hastanın sonucunun test ile algılanabilir seviyenin altında olduğunu da gösterebilir. Negatif sonuçlar İnvazif Aspergillosis teşhisinde kesin sonuç değildir. Eğer hastalık şüphesi varsa ama sonuç negatifse testin tekrarlanması önerilir. İndeksi 0.50 olan serumlar galaktomannan antijen için pozitif olarak kabul edilir. Tüm pozitif hastalar için, aynı örnekten yeni bir parçanın tekrarlanmasının yanı sıra, takip testi için aynı hastadan yeni bir örnek alınması tavsiye edilir. Not: değerinden küçük absorbans değerlendirilmesi gereken prosedür veya cihaz hatası gösterebilir. Test sonucu geçersizdir ve örnek tekrar çalışılmalıdır. Hassasiyet ve erken pozitif testi artırmak için, yüksek riskli hastalarında düzenli olarak taranması (haftada iki kez) tavsiye edilir. Not: Lütfen unutmayın Platelia Aspergillus EIA invazif Aspergillosis teşhisinde yardımcı olarak kullanılmak içindir. Platelia Aspergillus EIA ile elde edilen pozitif sonuçlar mikrobiyolojik kültür, biyopsi örneklerinin histolojik incelemesi ve radyografik bulgular gibi diğer teşhis prosedürleriyle bir arada değerlendirilmelidir. Örnek Hesaplama: Örnek Absorbans (OY) Negatif Kontrol (R3) OY Kesme Kontrol (R4) OY Pozitif Kontrol (R5) OY Hasta Örneği # Hasta Örneği # Hasta Örneği # Hesaplamalar Test kontrollerinin geçerliliğinin belirlenmesi için örnek hesaplamayı görmek için Kalite Kontrol (Geçerlilik Kriteri) bölümüne bakın. Kesme Kontrol Ortalaması Değeri Kesme Kontrol (R4) OY Otlamasını hesaplamak için, Kesme Kontrol replikaları için OY değerlerini toplayın ve sonucu 2 ye bölün: ( ) 2 =

8 Hasta Örneği #1 Hasta Örneği #1 indeksini hesaplamak için, Hasta Örneği #1 OY, Kesme Kontrol OY Ortalamasına bölünmelidir: I = = 0.23 Bu örnekte indeks 0.23 < 0.50 olduğu için Hasta Örneği #1 negatiftir. Hasta Örneği #2 Hasta Örneği #2 indeksini hesaplamak için, Hasta Örneği #2 OY, Kesme Kontrol OY Ortalamasına bölünmelidir: I = = 0.74 Bu örnekte indeks olduğu için Hasta Örneği #2 pozitiftir. Hasta Örneği #3 Hasta Örneği #3 indeksini hesaplamak için, Hasta Örneği #3 OY, Kesme Kontrol OY Ortalamasına bölünmelidir: I = = 2.04 Bu örnekte indeks olduğu için Hasta Örneği #3 pozitiftir. 13- PROSEDÜRÜN KISITLAMALARI 1. Negatif test İnvazif Aspergillosis teşhisinde kesin sonuç değildir. Invazif Aspergillosis riski olan hastalar haftada iki kez test edilmelidir. 2. Platelia Aspergillus EIA Prosedürü ve Sonuçların yorumlanması galaktomannan antijen bulunan test örnekleri için takip edilmelidir. Kit kullanıcısının testi yapmadan önce paketin içindekileri dikkatle okuması gereklidir. Özellikle, örnek ve reaktif pipetleme, plaka yıkama ve inkübasyon adımlarının zamanlaması için test prosedürü dikkatle takip edilmelidir. 3. Örnek veya reaktifin prosedürde açıklanan şekilde eklenmemesi yanlış negatif teste yol açabilir. İnvasif Aspergillosis için klinik şüphe olduğunda veya prosedür hatalarında ilave örneklerin testleri tekrarlanmalıdır. 4. Mikro plaka ile ilgilenirken dikkatli olunmadığı takdirde veya reaktif eklerken pipetleme tekniği kötüyse, çukurcuklardan birinin içindekilerin diğer çukurcuğa dökülerek negatif hasta örnek çukurcuklarının pozitif kontrol/hasta çukurcuklarının içindekilerle kontaminasyonu mümkündür. 5. Platelia Aspergillus EIA performansı neonatal veya pediyatrik serum örnekleri ile değerlendirilmemiştir. 6. Platelia Aspergillus EIA kronik granülomatoz hastalığı veya Job s sendromu olan hastalarda galaktomannan algılama konusunda daha zayıf performans gösterebilir 36, İnvazif Aspergillosisli bazı hastalarda küf aktif anti mantar terapisinin konkominant kullanımı Platelia Aspergillus EIA hassasiyetini azaltabilir Platelia Aspergillus EIA plazma veya ürin, BAL ya da CSF gibi diğer örnek türleri için değerlendirilmemiştir. 9. Platelia Aspergillus EIA performansı manuel okuma ve/veya görsel tanımlama için oluşturulmamıştır. 10. Penicillium, Alternaria, Paecilomyces, Geotrichum ve Histoplazma gibi diğer mantar türleri Aspergillus galaktomannan teşhisi için testte kullanılan rat, EBA-2 monoklonal antibadiler ile reaktivite göstermiştir. Amerika Birleşik Devleri nin bölümleri dahil endemik alanlarda histoplazma dikkate alınmalıdır 23, 32, Klinik işaret olmadan pozitif reaksiyon: Klinik ve/veya radyolojik özelliklerin belirlenmesinden önce serumda galaktomannan antijen bulunması dikkate alındığında, genellikle klinik bulgularla pozitif reaksiyon gözlenir: Kanıtlanmış kişiler için "gerçek pozitif" testlere karşılık gelirler veya daha sonra olası İnvazif Aspergillosis teşhisi oluşur. Bununla birlikte, bazı durumlarda bazı faktörler test yorumlanırken dikkate alınmalıdır: a. Klinik bulgu olmadan pozitif reaksiyonlar özellikle küçük çocuklarda rapor edilmiştir 26. Her ne kadar bu vakaların bazıları gerçek Aspergillus antijenleri ile alakalıysa da5, çoğu vaka hatalı pozitif olarak değerlendirilmiştir. b. Galaktafuranoz çeşitli gıdalarda, özellikle tahıllarda, tahıl ürünlerinde ve kremalı tatlılarda bulunur 1, 17. İnsan sütünden farklı olarak insani özellikler verilmiş sütler sıklıkla yüksek konsantrasyonda galaktomannan içerir 10. Bu yüzden küçük çocuklarda ve daha genel olarak barsak bariyeri müdahalesi geçirmiş hastalarda antijen yorumlama sırasında beslenme özellikleri dikkate alınmalıdır 4, 10. Klinik bulguların eşlik etmediği pozitif antijen bu tür hasta popülasyonlarında daha dikkatli yorumlanmalıdır 17. c. Piperacillin / tazobactam tedavisi uygulanan hastalarda pozitif galaktomannan test sonuçları rapor edilmiştir. Ayrıca galaktomannan antijen için pozitif olduğu tespit edilmiş belirli piperacillin / tazobactam lotları veya partileri de rapor edilmiştir. Bu yüzden piperacillin / tazobactam kullanan hastaların pozitif test sonuçları dikkatle yorumlanmalı ve diğer teşhis metotları ile doğrulanmalıdır. Galaktomannan bulgusu bazı amoxicillin partilerinde klavulanik asit parenteral ürünlerle ilişkili olarak da tespit edilmiştir. Bu yüzden yarı sentetik ß- laktam tedavileri test yorumlanırken dikkate alınmalıdır 1, 21. 8

9 Platelia Aspergillus EIA galaktomannan antijenini klinik veya radyolojik belirtilerden çok önce tespit edebildiğinden, İnvazif Aspergillosis oluşumu göz ardı edilemez. Bu yüzden, piperacillin / tazobactam tedavisi gören test sonucu pozitif olan hastalar dikkatle takip edilmelidir. d. Klinik bulgular yokken parenteral veya oral yollarla (barsak bariyeri müdahalesi durumunda) galaktomannan ürünleri alan hastalarda pozitif reaksiyonlar gözlenebilir. Bu ürünlerdeki galaktomannan varlığı genellikle mantar mikroorganizmalara dayalı bir fermantasyon prosesi ile açıklanır. Bununla birlikte ekzojen galaktomannan konsantrasyonu testin eşik değerine ulaşıncaya veya geçinceye kadar pozitif sonuç gözlenmeyecektir. Bu yüzden, diğer klinik bulguların yokluğun da şüpheli pozitif sonuç varsa, hastanın almakta olduğu ürünlerin, özellikle üretim proseslerinin ve kullanılan ham maddelerin incelenmesini öneririz 11, 24, BEKLENEN DEĞERLER İnvazif Aspergillosis için beklenen değerler hasta popülasyonuna bağlı olarak değişir; %5-20% arası değerler rapor edilmiştir 7, 13. Platelia Aspergillus EIA performans karakteristiklerini tespit etmek amacıyla Avrupa daki iki test merkezinde İnvazif Aspergillosis olan ve olmayan hematolojik habis tümör ve hematopoetik kök hücre nakli yapılmış 239 safhaya (203 hasta) ait 4873 serum örneği üzerinde klinik çalışma yapılmıştır. Hasta çalışmaya birden çok kez katılmış olabileceği için analiz tedavi safhası başına gerçekleştirilmiştir. Safha bir klinik olay ile ilgili zaman süreci olarak kabul edilmiştir (örn. Nakil, GVHD vs.) Sonuç olarak tek hasta için birden çok safha gözlenmiştir. Bu çalışma için ortalama yaygınlık oranı %16 olmuştur (38/239). Bu popülasyonlar için indeks değerlerinin dağılımı aşağıdaki tablolarda gösterilmiştir. İnvazif Aspergillosis teşhisi konmamış hastalar (kontrol popülasyonu) Avrupa daki iki test merkezinde 201 safhadan (168 hasta) toplam 3691 serum örneği Platelia Aspergillus EIA ile test edilmiştir. İndeks değerlerinin dağılımı aşağıdaki tabloda gösterilmiştir Kontrol Hasta Popülasyonu Serum İndeks Değeri Dağılımı N= 3691 Serum sayısı İndeks 9

10 Buradaki işaretleme 201 safhanın 3691 serum örneği için galaktomannan test sonuçlarını göstermektedir (HSCT için bağışıklık bastırıcı tedavi gören hastalar veya hematolojik habis tümör tedavisi). KONTROL POPÜLASYONU: KONTROLLPOPULÁCIÓ: İNDEKS / SAFHA DAĞILIMI INDEXELOSZLÁS (N= 201 safha / ESEMÉNY 168 hasta) (N= 201 esemény, 168 beteg) 2 1,5 İndeks Index 1 0, Esemény száma Safha Numarası İnvazif Aspergillosis teşhisi konmuş hastalar Buradaki işaretleme 38 safhanın (35 hasta) 1182 serum örneği için EORTC/NIAID açıklamaları ile tanımlanan şekilde kanıtlanmış veya Olası İnvazif Aspergillosis galaktomannan test sonuçlarını göstermektedir. Her hastanın her serum örneğinin pozitif olması beklenmemektedir. BIZONYÍTOTT KANITLANMIŞ / VALÓSZÍNŰ / OLASI INVAZÍV İNVAZİF ASPERGILLOSIS: INDEX İNDEKS / ESEMÉNY / SAFHA ELOSZLÁSA DAĞILIMI (N=38 (N=38 esemény, safha beteg) hasta) Index 10,0 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0, Esemény száma safha Numarası Kesme 10

11 İnvazif Aspergillosis için beklenen değerler hasta popülasyonuna bağlı olarak değişir; %5-20% arası değerler rapor edilmiştir7, 13. Bu çalışma için yaygınlık oranı %16 olmuştur. Aşağıdaki grafik İnvazif Aspergillosis klinik bulguları veya semptomları göstermeyen (Aspergillus için negatif) hastaların örneklerini ve Kanıtlanmış İnvazif Aspergillosis (Aspergillus için pozitif) bir hastayı göstermektedir. Negatif hasta: index 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 KONTROLLBETEG HASTASI gün nap Pozitif hasta: BIZONYÍTOTT Kanıtlanmış INVAZÍV invazif ASPERGILLOSIS Aspergillosis hastası BETEG 1,6 1,4 1,2 index 1 0,8 0,6 0,4 0, nap gün 11

12 15. SPESİFİK PERFORMANS KARAKTERİSTİKLERİ A. Tekrarlanabilirlik Çalışmaları Platelia Aspergillus EIA için inter-test ve intra-test değişkenliği Kuzey Amerika daki üç klinik çalışma merkezinden elde edilen 6 hasta serum örneği havuzu (bir negatif, bir düşük pozitif, iki pozitif ve iki yüksek pozitif) ile belirlenmiştir. 6 panel üyesinin her biri, bir lot ile iki merkezde 3 farklı günde üçer kez (x3) test edilmiştir (her merkezdeki toplam tekrar sayısı = 9). 6 panel üyesinin her biri, bir lot ile üçüncü merkezde 3 farklı günde ikişer kez (x2) test edilmiştir (üçüncü merkezdeki toplam tekrar sayısı = 6). Her merkezde testler bir (1) operatör tarafından hassas şekilde yapılmıştır. Veriler Klinik Laboratuar Standartları için Ulusal Komite (NCCLS) Standartlarına göre analiz edilmiştir. Ortalama optik yoğunluk (OY) veya ortalama indeks değeri, standart sapma (SS), sapma katsayısı yüzdesi (%CV), çalışma hassasiyeti (intra test) ve merkez içinde (inter-test) her panel üyesi için her merkezde aşağıdaki tablolar ile gösterilmiştir. N/A = uygulanabilir değil 1 NCCLS EP5-A, Sayı 19, No. 2, Sayfa 24, Denklem (C2) 2 NCCLS EP5-A, Sayı 19, No. 2, Sayfa25, Denklem (C3) ve Denklem (C4) 12

13 B. Çapraz Reaktivite İnvazif Aspergillosis ile ilişkili olmayan tıbbi durumların potansiyel etkisini değerlendirmek için bir lot Platelia Aspergillus EIA kiti ile çalışma yapılmıştır. Aşağıdaki serum örnekleri Platelia Aspergillus EIA ile çapraz reaktivite için test edilmiştir. Toplam 151 serum test edilmiştir. Patoloji Test Edilen Örnek Sayısı Pozitif sayısı Romatoid Faktörü ANA Pozitif IgG Hipergamaglobulinemi IgM Hipergamaglobulinemi Kanser* Viral Olmayan Siroz (safra kesesi ile ilgili; alkol etkili ; uyuşturucu etkili) Çoklu Transfüzyon Çok Doğurgan Kadın HAV HCV Rubella CMV Sifiliz (RPR+) Toksoplazmoz Mikoplazma * Mesane, göğüs (2), kolon, endometriyal, akciğer, prostat,renal, ve skuamöz (3) her bir için bir tane. C. Klinik Testler Platelia Aspergillus EIA hassasiyeti, spesifikliği ve belirleyiciliği ile ilgili klinik testler Belçika ve Hollanda da bulunan iki merkezde yapılmıştır. Çalışma aşağıdaki popülasyonlara ait 203 hastadan 4873 serum örneği toplanarak geriye dönük şekilde yapılmıştır: İnvazif Aspergillosis bulgusu olmayan hastalar (kontrol hastaları) Olası İnvazif Aspergillosisli hastalar Kanıtlanmış İnvazif Aspergillosisli hastalar *Avrupa Kanser Araştırma ve Tedavi Organizasyonu (EORTC) İnvazif Fungal Enfeksiyon Grubu (IFICG) ve Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ulusal Enstitüsü (NIAID) Mikosis Çalışma Grubu (MSG) hematolojik habis tümör veya hematopoetik kök hücre nakli hastalarında İnvazif Aspergillosis (IA) teşhisi kriterini tanımlamıştır 2. Kanıtlanmış İnvazif Aspergillosis etkilenmiş bölgeden steril olarak elde edilen pozitif mikrobiyolojik kültür ve uygun morfolojik formların fungal enfeksiyon ile ilişkili semptomlarına bağlı olarak histopatolojik bulgularla tanımlanır. Olası İnvazif Aspergillosis fungal enfeksiyon ile ilişkili semptomlara bağlı olarak, en az bir mikrobiyolojik kriter ve enfeksiyona uğramış bölgeden bir majör ya da iki minör klinik kriter. Muhtemel İnvazif Aspergillosis fungal enfeksiyon ile ilişkili semptomlara bağlı olarak, en az bir mikrobiyolojik kriter veya enfeksiyona uğramış bölgeden bir majör ya da iki minör klinik kriter. Olası ve Kanıtlanmış İnvazif Aspergillosis nadirliği dikkate alındığında, bu çalışmanın klinik hassasiyeti ve spesifikliği açısından aşağıdaki tanımı sunuyoruz. HASSASİYET Bu çalışmanın sonuçları hasta hassasiyeti bazında analiz edilmiştir. Hassasiyet testi, Kanıtlanmış veya Muhtemel İnvazif Aspergillosis teşhisi konulmuş 35 Kemik İliği Nakli (BMT) ve Lösemi hastasında birleştirilmiş toplam 38 safhada Platelia Aspergillus EIA kullanılarak iki merkezde yapılmıştır. 1. Kanıtlanmış Aspergillosis (IFICG / EORTC tarafından tanımlanan şekilde; bkz yukarısı) Birleştirilmiş Merkezler N = 19 safha 16 hasta Hassasiyet: %100 (19/19). Not: Yetersiz örnek boyutu sebebiyle %95 güvenilirlik aralığı hesaplanamamıştır. 2. Muhtemel Aspergillosis (IFICG / EORTC tarafından tanımlanan şekilde; bkz yukarısı) Birleştirilmiş Merkezler N = 19 safha 19 hasta Hassasiyet: %94.7 (18/19). Not: Yetersiz örnek boyutu sebebiyle %95 güvenilirlik aralığı hesaplanamamıştır. 13

14 3. Birleştirilmiş Kanıtlanmış ve Muhtemel Aspergillosis (IFICG / EORTC tarafından tanımlanan şekilde; bkz yukarısı) Birleştirilmiş Merkezler N = 38 safha 35 hasta Hassasiyet: 97.4% (37/38). %95 güvenilirlik aralığı % SPESİFİKLİK Spesifiklik testi, İnvazif Aspergillosis belirtisi olmayan 201 safhadan (168 hasta) elde edilen birleştirilmiş toplam 3691 örnek üzerinde Platelia Aspergillus EIA kullanılarak iki merkezde yapılmıştır. Merkez 1: N = 3060 örnek 103 safhadan (70 hasta) Spesifiklik: %92.2 (95/103) %95 güvenilirlik aralığı % Merkez 2: N = 631 örnek 98 safhadan (98 hasta) Spesifiklik: %88.8 (87/98) %95 güvenilirlik aralığı % Birleştirilmiş Merkezler 201 safhadan 3691 örnek (168 hasta) Spesifiklik: %90.5 (182/201) 95% güvenilirlik aralığı % BELİRLEYİCİ DEĞER Pozitif ve Negatif Belirleyici Değerler (PPV, NPV) bu çalışmadaki hasta popülasyonu için analiz edilmiştir, analiz bu çalışmada gözlenmiş olan %16 gerçek yaygınlık ortalamasına dayanmaktadır. PPV: %66.1 (37/56) NPV: %99.4 (182/183) Analiz, birbiriniz izleyen 2 örnek 0.5 değerinden daha büyük veya eşit indeks değeri durumunda pozitif sonuç kabul edilerek de yapılmıştır. Performans aşağıdaki tabloda özetlenmiştir: 1 örnek 0.5 olarak birleştirilmiş merkezler Birbirini izleyen 2 örnek 0.5 olarak birleştirilmiş merkezler Hassasiyet* Spesifiklik PPV NPV *: Hassasiyet Kanıtlanmış ve Muhtemel İnvazif Aspergillosis üzerinden hesaplanmıştır 16-ÜRETİCİNİN KALİTE KONTROLÜ Üretilmiş olan tüm reaktifler, ham maddenin gelişinden nihai ürünün piyasaya sunuluşuna kadar Kalite Sistemimize uygun şekilde hazırlanmıştır. Her lot kalite kontrol değerlendirmelerine sokulmuş ve sadece önceden belirlenmiş kabul kriterlerine uygunluğu tespit edildikten sonra piyasaya verilmiştir. Her lotun üretim ve kontrolüne ilişkin kayıtlar Bio-Rad tarafından tutulmaktadır. 17-BİBLİOGRAFYA 1. Ansorg, R., R. Van Den Boom, and P.M. Rath Detection of Aspergillus galactomannan antigen in foods and antibiotics. Mycoses 40: p Ascioglu, S., J. H. Rex, B. De Pauw, J. E. Bennett, J. Bille, F. Crokaert, D. W. Denning, J. P. Donnelly, J. E. Edwards, Z. Erjavec, D. Fiere, O. Lortholary, J. Maertens, J. F. Meis, T. F. Patterson, J. Ritter, D. Selleslag, P. M. Shah, D. A. Stevens and T. J. Walsh Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clin. Infect. Dis. 34: p Aubry, A., R. Porcher, J. Bottero, S. Touratier, T. Leblanc, B. Brethon, P. Rousselot, E. Raffoux, J. Menotti, F. Derouin, P. Ribaud and A. Sulahian Occurrence and kinetics of false-positive Aspergillus galactomannan test results following treatment with beta-lactam antibiotics in patients with hematological disorders. J. Clin. Microbiol. 44 (2): p Blijevens, N. M., J. P. Donnelly, J. F. Meis, P. E. Verweij, and B. E. De Pauw Aspergillus galactomannan antigen levels in allogeneic haematopoietic stem cell transplant recipients given total parenteral nutrition. Transpl. Infect. Dis. 4: p

15 5. Chambon-Pautas, C., J. M. Costa, M. T. Chaumette, C. Cordonnier, and S. Bretagne Galactomannan and polymerase chain reaction for the diagnosis of primary digestive aspergillosis in a patient with acute myeloid leukaemia. J. Infect. 43: p de Repentigny, L., L. Kaufman, G. T. Cole, D. Kruse, J. P. Latge, and R. C. Matthews Immunodiagnosis of Invasive Fungal Infections. J. Med. Vet. Mycol. 32: p Denning, D. W Invasive Aspergillosis. Clin Infect.Dis. 26: p Dupont, B., M. Richardson, P. E. Verweij, and J. F. G. M. Meis Invasive aspergillosis. Medical Mycology 38: p Erjavec, Z. and P. E. Verweij Recent progress in the diagnosis of fungal infections in the immunocompromised host. Drug Resist. Updat. 5: p Gangneux, J. P., D. Lavarde, S. Bretagne, C. Guiguen, and V. Andemer Transient Aspergillus antigenaemia: think of milk. Lancet 359: p Hage,C. A., J. M. Reynolds, M. Durkin, L. J. Wheat, K. S. Knox Plasmalyte as a Cause of falsepositive results for Aspergillus galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid. J. Clin. Microbiol. 45: p Herbrecht, R., V. Letscher-Bru, C. Oprea, B. Lioure, J. Waller, F. Campos, O. Villard, K. L. Liu, S. Natarajan-Ame, P. Lutz, P.Dufour, J. P. Bergerat, and E. Candolfi Aspergillus galactomannan detection in the diagnosis of Invasive Aspergillosis in cancer patients. J. Clin. Oncol. 20: p Herbrecht, R., D. Denning, T. Patterson, J. Bennett, R. Greene, J. Oestmann, W. Kern, K. Marr, P. Ribaud, O. Lortholary, R. Sylvester, R. Rubin, J. Wingard, P. Stark, C. Durand, D. Caillot, E. Thiel, P. Chandrasekar, M. Hodges, H. Schlamm, P. Troke, B. DePauw Voriconazole Versus Amphotericin B for Primary Therapy of Invasive Aspergillosis. N. Engl. J. Med. 347, 6: p Latge, J. P Tools and trends in the detection of Aspergillus fumigatus. Curr. Top. Med. Mycol. 6: p Latge, J. P Aspergillus fumigatus and Aspergillosis. Clin. Microbiol. Rev. 12[2], Latge, J. P., H. Kobayashi, J. P. Debeaupuis, M. Diaquin, J. Sarfati, J. M. Wieruszeski, E. Parra, J. P. Bouchara, and B. Fournet Chemical and immunological characterization of the extracellular galactomannan of Aspergillus fumigatus. Infect. Immun. 62: p Letscher-Bru, V., A. Cavalier, E. Pernot-Marino, H. Koenig, D. Eyer, J. Waller, and E. Candolfi Recherche d'antigène galactomannane aspergillaire circulant par Platelia Aspergillus : antigénémies positives persistantes en l'absence d'infection. J. Med. Mycol. 8: p Maertens, J., J. Verhaegen, H. Demuynck, P. Brock, G. Verhoef, P. Vandenberghe, J. Van Eldere, L. Verbist, and M. Boogaerts Autopsy-controlled prospective evaluation of serial screening for circulating galactomannan by a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for hematological patients at risk for invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 37: p Maertens, J., J. Verhaegen, K. Lagrou, J. Van Eldere, and M. Boogaerts Screening for circulating galactomannan as a noninvasive diagnostic tool for Invasive Aspergillosis in prolonged neutropenic patients and stem cell transplantation recipients: a prospective validation. Blood 97: p Marr K. A., M. Laverdiere, A. Gugel and W. Leisenring Antifungal therapy decreases sensitivity of the Aspergillus galactomannan enzyme immunoassay. Clin. Infect. Dis. 40: p Mattei, D., D. Rapezzi, N. Mordini, F. Cuda, C. Lo Nigro, M. Musso, A. Arnelli, S. Cagnassi, and A. Gallamini False-positive Aspergillus galactomannan enzyme-linked immunosorbent assay results in vivo during amoxicillin-clavulanic acid treatment. J. Clin. Microbiol. 42: p Mennink-Kersten M. A. S. H., D. Ruegebrink, R. Klont, A. Warris, H. J. M. Op den Camp and P. Verweij Bifidobacterial Lipoglycan as a New Cause for False-Positive Platelia Aspergillus Enzyme Immunoabsorbent Assay Reactivity. J. Clin. Microbiol. 43(8): p Nareddy, S., P. H. Chandrasekar False-positive Aspergillus galactomannan (GM) assay in histoplasmosis. J. Infection 56: p Racil, Z., I. Kocmanova, M. Lengerova, J. Winterova, J. Mayer Intravenous PLASMA-LYTE as a Major Cause of False-Positive Results of Platelia Aspergillus EIA Test for Galactomannan Detection in Serum. J. Clin. Microbiol. 45(2): p

16 25. Rimek, D., T. Zimmermann, M. Hartmann, C. Prariyachatigul, and R. Kappe Disseminated Penicillium marneffei infection in an HIV-positive female from Thailand in Germany. Mycoses 42: p Siemann, M., M. Koch-Dorfler, and M. Gaude False positive results in premature infants with the Platelia Aspergillus sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. Mycoses 41 : p Stynen, D., A. Goris, J. Sarfati, and J. P. Latge A new sensitive sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect galactofuran in patients with Invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 33: p Stynen, D., J. Sarfati, A. Goris, M. C. Prevost, M. Lesourd, H. Kamphuis, V. Darras, and J. P. Latge Rat monoclonal antibodies against Aspergillus galactomannan. Infect. Immun. 60: p Sulahian, A., F. Boutboul, P. Ribaud, T. Leblanc, C. Lacroix, and F. Derouin Value of antigen detection using an enzyme immunoassay in the diagnosis and prediction of Invasive Aspergillosis in two adult and pediatric hematology units during a 4-year prospective study. Cancer 91: p Sulahian, A., M. Tabouret, P. Ribaud, J. Sarfati, E. Gluckman, J. P. Latge, and F. Derouin Comparison of an enzyme immunoassay and latex agglutination test for detection of galactomannan in the diagnosis of Invasive Aspergillosis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 15: p Surmont,I., W. Stockman Gluconate-containing intravenous solutions: Another cause of false-positive galactomannan assay reactivity. J. Clin. Microbiol. 45: p Swanink, C. M., J. F. Meis, A. J. Rijs, J. P. Donnelly, and P. E. Verweij Specificity of a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for detecting Aspergillus galactomannan. J. Clin. Microbiol. 35: p Verweij, P. E., E. C. Dompeling, J. P. Donnelly, A. V. Schattenberg, and J. F. Meis Serial monitoring of Aspergillus antigen in the early diagnosis of Invasive Aspergillosis. Preliminary investigations with two examples. Infection 25: p Verweij, P. E. and J. F. Meis Microbiological diagnosis of Invasive Fungal Infections in transplant recipients. Transpl.Infect.Dis. 2: p Verweij, P. E., D. Stynen, A. J. Rijs, B. E. de Pauw, J. A. Hoogkamp -Korstanje, and J. F. Meis Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay compared with Pastorex latex agglutination test for diagnosing Invasive Aspergillosis in immunocompromised patients. J. Clin. Microbiol. 33: p Verweij, P. E., C. M. Weemaes, J. H. Curfs, S. Bretagne, J. F. Meis Failure to detect circulating Aspergillus markers in a patient with chronic granulomatous disease and Invasive Aspergillosis. J. Clin. Microbiol. 38: p Walsh T. J., R.L. Schaufele, T. Sein, J. Gea-Banacloche, M. Bishop, N. Young, R. Childs, J. Barrett, H. L. Malech, and S.M. Holland Reduced expression of galactomannan antigenemia in patients with Invasive Aspergillosis and chronic granulomatous disease or Job s syndrome. Abstracts of the 40th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America. Arlington, VA. P. 105 ; Abstr Wheat, L. J., E. Hackett, M. Durkin, P. Connolly, R. Petraitiene, T. J. Walsh, K. Knox, C. Hage Histoplasmosis-associated cross-reactivity in the Bio-Rad Platelia Aspergillus enzyme immunoassay. Clin. Vaccine Immunol. 14 (5): p Yeo, S. F. and B. Wong Current Status of Nonculture Methods for Diagnosis of Invasive Fungal Infections. Clin. Microbiol. Rev. 15: p Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) Fax : +33 (0) /