II.SINIF TIBBİ MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR FÖYLERİ

Transkript

1 II.SINIF TIBBİ MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR FÖYLERİ

2 Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-1 Mikrobiyoloji Laboratuvarında Kullanılan Araç ve Gereçler Dersin Amacı Dersin Hedefleri Bilgi Tutum Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılan araç ve gereçlerin tanıtılması ve kullanım amaçlarının öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılan araç ve gereçleri sıralar. Bu araç ve gereçlerin ne amaçla kullanıldığını açıklar. Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Gerekli Malzemeler Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılan araç ve gereçler Giriş Mikrobiyoloji Laboratuvarlarında en sık kullanılan araç ve gereçler aşağıda sıralanmıştır. 1. Deney tüpleri: Serolojik deneyler, besiyeri hazırlanması, santrifüj ve çeşitli amaçlar için kullanılan farklı boyut ve hacimlerde olan silindir şeklinde cam veya ısıya dayanıklı plastikten yapılmış malzemelerdir. Şekil 1-1. Tüpler 2. Plastik santrifüj tüpleri: 1.5, 2, 15, 50ml hacimlere sahip kapaklı tüplerdir. Şekil 1-2. Plastik santrifüj tüpleri 1

3 3. Pipet: Çeşitli boyutlarda ve kapasitede olan, istenilen miktarda sıvıyı alarak başka bir yere aktarmada kullanılan, ince, uzun, üzeri dereceli silindir şeklinde malzemelerdir. Şekil 1-3. Pipet 4. Otomatik pipetler: Özellikle mikro yöntemlerle çalışıldığında çok küçük hacimleri aktarmaya ve dağıtmaya yarayan pipetlerdir. Şekil 1-4. Otomatik pipetler 5. Otomatik pipet ucu: Az miktarda sıvı aktarımında kullanılan plastik uçlardır. Şekil 1-5. Otomatik pipet uçları 6. Mezür: Çeşitli boyut ve hacimlerde olan silindir şeklinde üzeri dereceli cam veya plastikten yapılmış kaplardır. Sıvı maddelerin ölçümünde kullanılır. Şekil 1-6. Mezürler 2

4 7. Pastör pipeti: Az miktarda sıvı aktarımında kullanılan, uç kısmı ince cam veya plastik pipetlerdir. Şekil 1-7. Pastör pipeti 8. Balon: Geniş küre şeklinde gövdesi ve dar silindir şeklinde boynu bulunan, tabanı düz cam malzemelerdir. Çeşitli hacimlerde olabilir. Besiyeri ve çözeltilerin hazırlanmasında kullanılır. Şekil 1-8. Çeşitli boyutlardaki balonlar 9. Beher: Silindir şeklinde, su bardağını andıran, çeşitli hacimlerde olabilen cam veya plastik kaplardır. Şekil 1-9. Çeşitli boyutlardaki beherler 10. Erlenmayer: Kısa silindir şeklinde boynu, koni şeklinde gövdesi olan geniş ve düz tabanlı cam malzemelerdir. Çeşitli hacimlerde olabilir. Şekil Çeşitli boyutlardaki erlenmayerler 3

5 11. Şişeler: Çeşitli boyut ve hacimlerde olabilen ve çeşitli amaçlarla kullanılabilen cam malzemelerdir (örneğin damlalıklı şişe, hemokültür şişeleri, koyu renkli şişeler,...) Şekil Çeşitli boyutlardaki şişeler 12. Tüp Taşıyıcıları (sporlar): Çeşitli büyüklükteki tüpleri taşımaya yarayan araçlardır. Şekil Tüp taşıyıcıları (sporlar) 13. Eküvyon çubuğu (Silgiç): Uçlarına su emici (hidrofil) pamuk sarılmış steril çubuklardır. Çeşitli vücut bölgelerinden inceleme örneklerinin alınması ve bazı ekimlerin yapılmasında kullanılır. 14. Eküvyonlu Tüp: Genellikle inceleme örneği alınmasında kullanılan, içerisinde tek bir eküvyon bulunan steril tüplerdir. Şekil Eküvyon çubuğu ve eküvyonlu tüp 15. Özeler: Daha çok sıvı ortamlardan örnek alıp ekim yapmaya yarayan aletlerdir. Uç kısmı platin veya tungsten gibi kolay ısınıp soğuyan ve oksitlenmeyen telden yapılmış ya da tek kullanımlık steril plastik malzemelerdir. Genellikle ucu halka şeklindedir. Standart bakteriyolojik öze 0,01ml sıvı alır. Ucunda halkalı tel yerine düz tel bulunan, batırma kültürü yapmaya, tek koloniden örnek almaya ve katı ortamlardan örnek alıp aktarmaya 4

6 yarayan iğne özeler, genellikle mantar ekimlerinde kullanılan ve ucu L şeklinde kıvrılmış olan çengel özeler de mikrobiyolojide sıkça kullanılan malzemelerdir. Şekil Plastik ve metal uçlu özeler 16. Petri kutuları: Katı besiyeri hazırlanmasında ve antibiyogram yapılmasında kullanılan geniş yuvarlak, yaklaşık 2cm derinlikte, birbirine geçen kapak ve alt kısımdan oluşan cam veya plastik malzemelerdir. Şekil Petri kutusu 17. Lam: Direkt inceleme ve boyama için preparat hazırlanmasında kullanılan dikdörtgen şeklinde ince camlardır. 18. Lamel: Genellikle 2x2 cm boyutlarında çok ince camdan yapılmış malzemelerdir. Çeşitli amaçla kullanılabilen farklı şekilleri de olabilir. Şekil Lam ve lameller 19. Şale: İçerisinde boyanacak preparatların (lamların) tek tek yerleştirilebildiği camdan yapılmış özel boya kaplarıdır. Şekil Şale 5

7 20. Gram Boyama Seti: Gram boyamada kullanılan boyaları içeren boya setidir. Şekil Gram boyama seti 21. Anaerobik Kavanoz: Anaerobik ve mikroaerofilik bakterilerin üretilmesinde kullanılır. Şekil Anaerobik kavanoz 22. Desikatör: Maddelerin nem almasını önleyen, katı maddelerin kurutulması ya da besiyerlerinin mikroaerofilik ya da anaerobik ortamda inkübe edilmesini sağlayan camdan yapılmış kapağı bulunan bir nevi kavanozdur. Şekil Desikatör 23. Manyetik karıştırıcı ve ısıtıcı: Çözeltileri homojen şekilde karıştırmaya yarayan alettir. Şekil Manyetik karıştırıcı ve ısıtıcı 6

8 24. Vorteks: Deney tüpü içerisindeki sıvıyı girdaplayarak homojen bir şekilde karıştırmaya yarayan alettir. Şekil Vorteks 25. Etüv: Mikroorganizmaların üretilmesi için kullanılan, istenilen ısıya ayarlanabilen, sıcak hava dolaplarıdır. Şekil Etüv 26. Santrifüjler: Tüp içerisinde bulunan yoğunlukları farklı maddeleri birbirinden ayırma amacı ile kullanılan cihazlardır. Şekil Santrifüj 27. ph metre: ph değerlerinin ölçülmesinde kullanılan aletlerdir. Şekil ph metre 7

9 28. Güvenlik kabineti: Çalışan kişiyi ve çalışılan örneği korumaya yarayan çalışma ortamlarıdır. Şekil Güvenlik kabineti 29. Distile Su Cihazı: Saf (distile) su elde edilmesinde kullanılır. Şekil Distile su cihazı 30. Hassas Terazi: Çok küçük miktarlardaki maddelerin ölçümlerini yapılabilen terazidir. Şekil Hassas terazi 31. Hücre kültür malzemeleri: Hücre kültürü yapılırken kullanılan pleytler, flasklar gibi malzemelerdir. Şekil Hücre kültür malzemeleri 8

10 32. Thermocycler: Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) işleminde denaturation, annealing (primerlerin bağlanması) ve extention (zincirin uzaması) aşamalarını otomatik olarak yürütebilen programlanabilir bir cihazdır. Şekil Thermocycler cihazları 33. UV illuminatör ve kamera: Floresan boyalı ürünlerin görüntülenmesini sağlar. Şekil UV illuminatör 34. Elektroforez tankı ve güç kaynağı: Agaroz veya poliakrilamit jellerine yüklenen ürünlerin elektroforetik yüklerine göre ayrıştırılmasına olanak sağlayan bir sistemdir. Şekil Elektroforez tankı 35. Buzdolabı ve Derin Dondurucular: Buzdolabı ısıya dayanıksız hasta örneklerinin, besiyerlerinin ve bazı kimyasal maddelerin muhafaza edildiği dolaplardır. Derin dondurucular ise dondurularak muhafaza edilmesi gereken malzemelerin ve mikroorganizmaların uzun süre saklanması için kullanılır. 9

11 36. Pastör Fırını: Yüksek sıcaklıklara dayanabilen malzeme ve gereçlerin kuru sıcak hava ile sterilizasyonlarında kullanılır. Şekil Pastör fırını 37. Bek: LPG ile çalışan, küçük ocaklar olup, yakma, alevden geçirme ve steril alan sağlamada kullanılır. Şekil Bek 38. Filtreler: Çeşitli sıvı maddelerin süzülerek steril edilmesinde kullanılan aletlerdir. Şekil Filtre 39. Otoklav: Basınçlı buharla sterilizasyon yapmaya yarayan bir cihazdır. Şekil Otoklav 10

12 40. Benmari: İstenilen ayardaki ısı derecelerinde sıcak su elde etmeğe ve suyu bu derecelerde sabit tutmaya yarayan aletlerdir. Şekil Benmari 41. Ultraviyole Lambası: Oda havasının ve yüzeylerin sterilizasyonunda kullanılan ultraviyole ışını salan lamba sistemidir. Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. Laboratuvarda gösterilen alet ve malzemeleri inceleyiniz. Kaynaklar 1. Bilgehan H (2009) Klinik Mikrobiyoloji Tanı. Beşinci Baskı. Barış yayınları, İzmir. 11

13 Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-2 Besiyerleri ve Boyalar A-Mikrobiyolojide Kullanılan Besiyerleri ve Ekim Yöntemleri Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Mikrobiyolojide kullanılan besiyerlerinin öğrenilmesi Besiyerlerine ekim yöntemlerinin öğrenilmesi Bakterilerin besiyerlerinde oluşturdukları koloni tiplerinin öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Besiyerlerinin adlarını sayar. Besiyerlerinin hazırlanmasında kullanılan temel maddeleri sayar. Besiyerlerinin özelliklerini açıklar. Besiyerlerini kullanım amaçlarına göre gruplandırır. Besiyerlerini fiziksel özelliklerine göre sınıflandırır. Ekim yöntemlerini sıralar. Koloni tiplerini özellikleri ile birlikte sıralar. Besiyerlerini tanıyıp ayırır. Ekim yöntemlerini uygular. Koloni tiplerini değerlendirir. Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Gerekli Malzemeler Temel ya da basit besiyeri Zenginleştirilmiş besiyeri (Kanlı agar, Çikolatamsı agar) Özgül besiyeri (Lowenstein-Jensen besiyeri) Seçici besiyeri (Selenit F besiyeri) Ayırıcı besiyeri (EMB agar, Kanlı agar) Ayıraçlı besiyeri (Şekerli besiyerleri, Fenol kırmızılı besiyerleri) Öze Eküvyonlu çubuk Pipet Tüpte sıvı besiyeri Tüpte yatık katı besiyeri Tüpte dik hazırlanmış katı besiyeri Anaerobik kavanoz S tipi koloni yapmış mikroorganizma kültürü R tipi koloni yapmış mikroorganizma kültürü M tipi koloni yapmış mikroorganizma kültürü 12

14 Giriş Mikroorganizmaların laboratuvar şartlarında üretilmeleri, saf olarak elde edilmeleri, çeşitli özelliklerinin incelenmesi, biyolojik ve metabolik ürünlerinin elde edilmesi için besiyeri adı verilen çeşitli besleyici ortamlar kullanılır. Besiyerlerinde hidrojen alıcı ve verici maddeler, karbon kaynağı, azot kaynağı ve mineraller üretilecek mikroorganizmanın ihtiyacı olduğu kadar mevcut olmalıdır. Besiyerlerinin Hazırlanmasında Kullanılan Temel Maddeler Su: Besiyeri hazırlanırken distile (saf) su ya da deiyonize su kullanılmalıdır. Peptonlar: Çeşitli proteinlerin pepsin, tripsin, papain gibi enzimlerle hidrolize edilmeleri sonucunda suda kolayca eriyebilen ve ısıtıldığında yeniden koagüle olmayan polipeptid, dipeptid ve aminoasit gibi maddelerden oluşur. Besiyerine eklenen bu maddelerin karışımı bakteriler tarafından azot kaynağı olarak kullanılır. Kimyasal maddeler ve tuzlar: Besiyerine eklenecek olan maddeler kimyasal olarak saf olmalıdır. Bu maddeler uygun çözücülerde çözülerek besiyerine eklenir. Kan: Besiyerlerinin zenginleştirilmesi amacıyla tavşan, koyun veya at kanı kullanılabilir. Besiyerine eklenecek olan kanlar steril ve pıhtılaşmamış olmalıdır. Serum: Koyun, tavşan, at gibi hayvanlardan steril olarak alınan kan 750 xg de 5 dakika santrifüj edilerek serum kısmı ayrılır ve buzdolabında saklanarak kullanılır. Haben sıvısı: Sirozlu hastaların periton boşluğunda toplanan sıvıdır. Steril şartlarda toplanır ve buzdolabında saklanır. Maya özütü: Çeşitli vitaminler ve aminoasitler içerdiğinden zenginleştirici olarak kullanılır. Mikroorganizmaların Laboratuvarda üretilebilecekleri besleyici ortamlar iki çeşittir. A-Canlı ortamlar 1. Embriyonlu yumurta 2. Hücre kültürleri 3. Deney hayvanları B-Cansız ortamlar Besiyerlerinin Sınıflandırılması Besiyerleri biçimlerine göre katı, sıvı, yarı katı ve yarı sıvı besiyerleri olarak ayrılırlar. Besiyerlerinin katılaştırılmasında en çok kullanılan madde agar-agar'dır. Bir çeşit deniz yosunundan elde edilen bu maddeyi mikroorganizmaların çoğu parçalayamaz. Bu madde yaklaşık 42 C'de donar ve mikroorganizmaların üretilme derecelerinde erimez. Agarın %1.5-3 oranlarında sıvı ortamlara katılması ile katı besiyerleri, % oranlarında kullanılması ile yarı katı besiyerleri elde edilebilir. Kullanılış amaçlarına ve kimyasal yapılarına göre başlıca besiyeri grupları şunlardır: 13

15 1-Kimyasal Yapıları Bilinen Sentetik Besiyerleri Saf kimyasal maddelerden hazırlanırlar. Eritici olarak saf su ya da iyonsuzlaştırılmış su kullanılır. Özellikle mikroorganizmaların metabolizmalarını incelemek ve biyolojik ürünlerini saf olarak elde etmek amacıyla kullanılırlar. Sadece inorganik maddeler içerenlere basit sentetik besiyeri, buna ek olarak aminoasitler gibi organik maddeler içerenlere de kompleks sentetik besiyerleri adı verilir. 2-Genel üretim besiyerleri Güncel Laboratuvar çalışmalarında kullanılan, normal vücut florasında bulunan veya patojen özellikler gösteren mikroorganizmaların çoğunun üretilebildiği besiyerleridir. Sıvı yada katı biçimde hazırlanan bu besiyerleri üreticilik özelliklerine göre ikiye ayrılırlar. a-temel yada basit besiyerleri Bunlarda başlıca pepton+tuz (peptonlu su) ya da et suyu+pepton+tuz (buyyon) gibi maddeler ve su bulunur. Buyyona agar eklemek suretiyle elde edilen katı besiyerine jeloz adı verilir. Bu ortamlar birçok mikroorganizmanın üremesi için elverişlidir. b-zenginleştirilmiş besiyerleri Temel besiyerine kan, serum, haben sıvısı, glukoz, yumurta gibi daha besleyici maddelerin eklenmesi ile elde edilen besiyerleridir (kanlı agar, çikolatamsı agar gibi). Basit besiyerlerinde üremeyen bazı mikroorganizmalar bu besiyerlerinde üretilebilirler. Şekil 2-1. Kanlı agar Şekil 2-2. Çikolatamsı agar 3-Özel besiyerleri Üremede güçlük gösteren bazı mikroorganizmaların üretilmesi için özel olarak hazırlanan besiyerleridir. Bu besiyerlerine belirli maddeler ve ayıraçlar konularak bazı mikroorganizmaların üremeleri sağlanırken diğerlerinin üremeleri engellenmiştir. a-özgül besiyerleri Yalnız bir çeşit ya da sınırlı sayıda mikroorganizmanın üretilmesi için hazırlanan besiyerleridir. (Mycobacterium tuberculosis`in üretilmesinde kullanılan Löwenstein-Jensen besiyeri gibi). Şekil 2-3. Lowenstein Jensen besiyeri 14

16 b-seçici besiyerleri Bazı mikroorganizmaların üremelerini önleyici maddeler içeren, bu suretle karışık bulundukları ortamlardan belirli mikroorganizmaların seçilerek üretilmelerini sağlayan besiyerleridir (dışkıdaki Salmonella`ların çoğaltılmasını sağlayan Selenit F besiyeri gibi). Bu besiyerleri temel ya da zenginleştirilmiş katı ya da sıvı besiyerlerine bir kısım bakterilerin üremesini önleyen antibiyotikler, kimyasal maddeler, boyalar konularak hazırlanırlar. c-ayırıcı besiyerleri İçerdikleri ayıraçlar aracılığı ile benzer bakterilerin ayrı görünümde koloniler oluşturmalarını sağlayarak karışık bakterileri birbirinden ayırmaya yarayan besiyerleridir (Laktoza etkili bakterileri etkisizlerden ayırmaya yarayan Eozin Methylene Blue (EMB) agar, hemoliz yapan ve yapmayanları ayırmada kullanılan kanlı agar gibi). Şekil 2-4. EMB besiyeri d-ayıraçlı besiyerleri Mikroorganizmaların metabolizmalarına bağlı biyokimyasal özelliklerini incelemek amacıyla besiyerlerine çesitli maddeler ve mikroorganizmaların bu maddeleri değişikliğe uğrattıklarını gösteren ayıraçlar eklenerek hazırlanan besiyerleridir (şekerli besiyerleri, fenol kırmızılı besiyerleri gibi). Ekim Yöntemleri İçerisinde mikroorganizma bulunduğu bilinen ya da mikroorganizma bulunup bulunmadığı araştırılacak olan ortamlardan ekim aletleri ile alınan örneklerin belirli kurallar çerçevesinde besiyerlerine aktarılması işlemine ekim denir. Ekimleri yapılacak örnekler ya doğrudan doğruya hastalardan alınan hastalık örnekleridir ya da daha önce üretilmiş olan bakteri kültürleridir. Ekim yapılacak materyal sıvı ise öze, pipet, eküvyonlu çubuk; katı ise öze kullanılarak ekim yapılır. Ekim yapılmadan önce ve sonra çalışılacak bankonun üzeri antiseptik eriyiklerle silinmeli ve daima güvenlik kabinetinde çalışılmalıdır. 1-Tüpte sıvı besiyerine ekim: Tüp içerisindeki besiyerine ekim yapılırken tüp eğik olarak tutulur. Ekim materyali öze ile alınmış ise öze tüpe yavaşça sokulur ve özedeki materyal bırakılır. Materyal katı ise önce öze tüp duvarına dairesel hareketlerle sürülerek daha sonra yavaşça sıvı besiyeri ile karıştırılarak ezilir. Pipetle alınan sıvı materyal besiyerine damlatılarak ekim yapılır. Eküvyonlu çubuklar besiyerine daldırılır ve tüp kenarına bastırılarak içeriğinin tüpteki besiyerine geçmesi sağlanır. 15

17 Şekil 2-5. Tüpteki sıvı besiyerineekim 2-Tüpte yatık katı besiyerine ekim: İğne öze ile alınan materyal hiç bir yere değdirilmeksizin tüpteki besiyerinin alt noktasına şişenin dibine 2-3 mm. mesafe kalacak kadar batırılır ve aynı doğrultuda geri çekildikten sonra besiyerinin yüzeyinde zikzaklar çizilerek yayılır. Şekil 2-6. Tüpte yatık besiyerine ekim 3-Tüpte dik hazırlanmış katı besiyerine ekim: İğne öze ile alınan materyal tüpteki besiyerinin dip kısmına şişenin dibine 2-3 mm. mesafe kalacak kadar batırılıp aynı doğrultuda çıkarılarak ekim yapılır. 4-Plak besiyerine ekim: a-tek koloni düşürmek amacıyla yapılan ekim: Bu ekim yönteminde amaç bakterilerin katı besiyerine seyreltilerek ekilmeleri, bu şekilde besiyerine tek tek düşmelerinin sağlanması ve böylece birbirinden ayrı koloniler elde edilmesidir. Bu amaçla petri kutusundaki katı besiyeri dört bölge olarak düşünülür. Öze ile alınan materyal ilk bölgede bir noktadan başlayıp sık zikzaklar çizilerek ekilir ve ikinci ekim sahasına geçilir. Birinci bölgeden ikinciye doğru daha az sıklıkta zikzaklar çizilir. Üçüncü bölgede zikzaklar daha da seyrek olmalıdır. En son dördüncü bölgede bir-iki zikzak yapılarak ekim tamamlanır. Bu ekim yönteminde, her ekim sahasına geçmeden önce besiyeri 90 derece açıyla döndürülerek yeni ekim sahasına geçilir. Her ekim sahasına geçildiğinde öze sterilize edildikten sonra veya farklı öze kullanılarak ekim yapılır. 16

18 Eküvyonlu çubuk ile materyal alınmış ise önce bu pamuklu çubuk ilk ekim sahasına sürülür. Daha sonra öze ile yukarıdaki işlemlere devam edilir. Şekil 2-7. Tek koloni düşürmek amacıyla yapılan ekim b-plak besiyerine yaygın ekim: Antibiyotik duyarlılık testleri, faj tiplendirme deneyleri gibi amaçlar için bakterilerin plak besiyerinin yüzeyine homojen olarak dağıtılması suretiyle yaygın ekim yapmak gerekir. Ekim yapılacak plak yüzeyine örnekten pastör pipeti ya da otomatik pipet ile birkaç damla damlatılır. Örnek eküvyonlu çubuk ya da öze yardımı ile besiyerinin ortasında bir çizgi şeklinde yayılır. Steril bir cam çubuk ya da eküvyonlu çubuk ile besiyerinin ortasına kadar sık zikzaklar çizilir. Daha sonra aynı işlem besiyerinin diğer yarısında da uygulanır. Besiyeri 90 derece çevrilerek yapılan işlemler tekrarlanır. Böylece besiyerinin her tarafına homojen olarak ekim yapılmış olur. Şekil 2-8. Plak besiyerine yaygın ekim Ekim yapılan besiyerleri üretilecek mikroorganizma için gerekli optimum sıcaklık derecelerine ayarlanmış etüvlerde ve uygun atmosferik şartlarda inkübasyona bırakılır. Aerop ve fakültatif anaerop mikroorganizmaların üretilmesinde normal atmosferik koşullar yeterlidir. Anaeroplar ve mikroaerofilik mikroorganizmaların üretilmesi için kapakları sıkıca kapatılabilen cam ya da çelik silindir seklinde kaplar (anaerobik jar) kullanılır. Ekim yapılmış plaklar bu kaplara yerleştirilir ve yanlarına özel gaz karışımı sağlayan ticari kitler koynularak ağızları kapatılır ve uygun sıcaklıktaki etüvlere yerleştirilir. 17

19 Koloni Tipleri S (smooth=düz) tipi koloni: En sık görülen şekildir. Yuvarlak, düz kenarlı, kabarık, düz yüzeyli, nemli ve homojen kolonilerdir. R (rough=pürtüklü) tipi koloni: S tipi koloni yapan bakterilerin eski kültürlerinde ve uygunsuz koşullarda üretimi ile meydana gelen koloniler bu tipte olabildiği gibi bazı tür bakteriler doğal olarak R tipi koloni yaparlar. Yüzeyleri buruşuk veya tanecikli, kenarları girintili ve çıkıntılı, basık görünümdedirler. S tipi koloni, R tipi koloni şekline dönerse virülansı azalır. M (mucoid) tipi koloni: Bir kısım bakterilerde hücre çeperlerinin dış tabakasında polisakkarit ve bazen polipeptid yapısında, az veya çok miktarda kapsül maddesi bulunur. Bu kapsüllü bakterilerin uygun ortamlarda (serumlu, habenli, kanlı, vs) sümüksü görünüşlü, yapışkan ve akıcı koloniler oluşturdukları görülür. Uygunsuz koşullarda bu bakteriler S tipi koloni oluştururlar. L tipi koloni: Besiyerinin dip kısmına doğru uzanan kolonilerdir. Hücre duvarını kaybeden bakteriler (L formu) bu tip koloniler oluştururlar. Şekil 2-9. S tipi koloni Şekil R tipi koloni Şekil M tipi koloni Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1-Besiyeri gruplarına örnek olarak getirilen besiyerlerini incelenip adlarını, besiyeri grubunu ve ne amaçla kullanıldığını yazınız. 2- Katı ve sıvı besiyerlerine verilen numunelerden uygun bir şekilde ekim yaparak yaptığınız ekimi şematize ederek çiziniz. a) Tek koloni b) Homojen ekim 18

20 c) Sıvı besiyerine ekim d) Yatık besiyerine ekim 4- Laboratuvara hazır olarak getirilen kültürlerde koloni görünümlerini değerlendirerek, hangi tip koloni olduğunu çiziniz. a) b) c) Tarih Laboratuvar görevlisinin imzası Kaynaklar 1. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA: Klinik Mikrobiyoloji Manual of Clinical Mikrobiology (Çev Edit. AC Başustaoğlu). Dokuzuncu baskı. Atlas Kitapçılık, Ankara, 2009, cilt 1, s Bilgehan H: Klinik Mikrobiyolojik Tanı, Barış Yayınları Fakülteler Kitabevi, Đzmir, 2009, s Editörler: Günalp A, Yılmaz YA, Pınar A: Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı. Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Ankara, 2003, s Winn Jr. W, Allen S, Janda W, Koneman E, Procop G, Schreckenberger P, Woods G, Koneman s Color Atlas and Textbook of Diagnostik Microbiology, Sixth edition, Lippincott Williams and Wilkins, s

21 B-Mikrobiyolojide Kullanılan Boyama Yöntemleri Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Mikrobiyolojide kullanılan boyama yöntemlerinin öğrenilmesi Basit boyama ve Gram boyama yöntemlerinin öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Bakteri boyalarını sıralar. Basit boyama yönteminin basamaklarını sıralar. Gram boyama yönteminin basamaklarını sıralar. Basit boyama yöntemini basit boyama kılavuzuna uygun şekilde uygular. Gram boyama yöntemini Gram boyama kılavuzuna uygun şekilde uygular. Basit boyama yöntemi ile boyanmış preperatları mikroskobik olarak değerlendirir. Gram boyama yöntemi ile boyanmış preperatları mikroskobik olarak değerlendirir. Mikroskobu başkalarının yardımına ihtiyaç duymaksızın kullanır. Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Gerekli Malzemeler Gram boyama seti Mikroskop Lam Öze Bek Gram pozitif kok (Örn; Stafilokok ya da Streptokok) üremiş kültür plakları Gram negatif basil (Örn; E. coli) üremiş kültür plakları Giriş Mikrobiyolojik tanıda morfolojik incelemeler büyük değer taşır. İyi bir incelemenin en azından tanıya doğru yönlendirici değeri vardır. Morfolojik incelemelerden olan boyama işlemi, bakterilerin identifikasyonu ve sınıflandırılmalarında önemli bir işlemdir. Bunlar içinde en sık kullanılanlar şunlardır; 1. Basit boyama 2. Gram boyama 3. Asido rezistan boyama (Ehrlich- Ziehl-Neelsen boyama) 4. Metilen mavisi boyama 5. Giemsa boyama 6. Çini mürekkebi boyama 20

22 7. Laktofenol pamuk mavisi boyama 8. Spor boyama 9. Kapsül boyama 10. Neisser boyama Bütün boyama işlemlerinden önce preparatın hazırlanıp, uygun yöntemle tespit edilmesi gerekir. Preparatın Hazırlanması: Preparatlar doğrudan hastalık örneklerinden, kültürlerden ya da deney hayvanlarındaki patolojik lezyonlardan hazırlanır. Bunun için temiz lamlar kullanılır. Sıvı materyalden preparat hazırlanıyor ise öze ya da otomatik pipet yardımı ile bir damla örnek alınarak lamın orta kısmına bırakılır. Öze yardımı ile dairesel hareketler ile küçük bir bozuk para büyüklüğünde yayılır. Bakteri kolonisi ya da katı bir klinik materyalden preparat hazırlarken önce bir damla steril serum fizyolojik lamın ortasına damlatılır. Örnek öze ile alınarak damlanın kenarında ezilir. Dairesel hareketlerle sıvı ile karışması sağlanır. Preparat oda ısısında kurumaya bırakılır. Tespit Yöntemleri: Preparatın tespit edilmesinde amaçlanan, üzerindeki materyalin lama yapışmasını sağlamaktır. Üç yöntemle tespit işlemi yapılabilir: 1. Havada kurutularak tespit: En az güvenilir olanıdır. Hazırlanan preparat 2-18 saat bekletilmelidir. 2. Alevde tespit: En çok kullanılan yöntemdir. Preparat havada kurutulduktan sonra materyalli yüzü yukarı gelecek şekilde bir ucundan tutulur. Lamın alt yüzü yanmakta olan alevin mavi kısmına, yukarıdan aşağıya doğru yavaş yavaş hareket ettirilerek yalatılır. 3. Kimyasal maddeler ile tespit: Alevde tespit edildiğinde morfolojisini kaybedebilecek materyali (protozoa, lökosit, eritrosit, epitel hücresi vs.) tespitte kulanılır. Etil alkol (8-10 dakika), metil alkol (3 dakika) ve aseton (5 dakika) tespit işleminde en çok kullanılan kimyasallardır. Bu maddeler hazırlanan preperatın üstüne, materyal bulunan kısmını kaplayacak şekilde dökülerek kullanılır. Basit Boyama Bu yöntemde, boyama için genellikle tek bir boya kullanılır ve mikroorganizmaların morfolojileri gözlenir. 1. Preparat hazırlanıp tespit edilir. 2. Metilen mavisi, safranin veya kristal viyole gibi boyalardan birisi ile 1 dakika boyanır. 3. Su ile yıkanır. 4. Havada kurutulur. 5. İmmersiyon objektifi ile incelenir. Bu boyama sonucu bakteriler, metilen mavisi ile mavi, safraninle pembe/kırmızı, kristal viyole ile mor/lacivert boyanır. 21

23 Gram Boyama Bakterilerin hücre duvar yapılarındaki farklılıklara dayalı bir boyama yöntemi olup, bakterileri gram pozitif ve gram negatif olarak sınıflayan bir boyama yöntemidir. Gram Boyama Becerisi Öğrenim Rehberi ARAÇLAR: Gram boyama seti, lam, su, penset, incelenecek hasta örneği ya da bakteri kültürü BASAMAK NO BASAMAKLAR 1 Preparatı hazırlayınız. (Bakınız; preparatın hazırlanması) Preparatı uygun yöntem ile tespit ediniz. (Bakınız; Tespit yöntemleri) 2 Preparat yatay konumda iken üzerine kristal viyole dökerek1 dakika bekletiniz. 3 Preparatı tazyikli olmayan su ile boya tamamen akıncaya kadar yıkayınız. 4 Preparat yatay konumda iken üzerine lügol dökerek 1 dakika bekletiniz. 5 Preparatın üzerindeki lügol solüsyonunu dökünüz. 6 Preparatın üzerine damla damla aseton alkol dökerek dekolorizasyon (renksizleştirme) yapınız. Bu işlemi kristal viyole tamamen akana kadar sürdürünüz. 7 Preparatı tazyikli olmayan su ile yıkayınız. 8 Preparat yatay konumda iken üzerine safranin (zıt boya) dökerek 30 saniye bekletiniz. 9 Preparatı tazyikli olmayan su ile yıkayınız. 10 Preparatı oda ısısında kurutunuz. 11 Preparatı immersiyon objektifi ile inceleyiniz. Bu boyamayla gram pozitif bakteriler mor, gram negatif bakteriler pembe boyanır. Boyaların hazırlanışı: Metilen mavisi Kristal viyole Lugol Aseton alkol Safranin :1,5 gr metilen mavisi, 100 ml %95 lik etil alkol :1 gr kristal viyole, 10 ml %96 lık etil alkol, 100 ml saf su : 1 gr kristal iyot, 2 gr potasyum iyodür, 300 ml su :1:1 oranında %95 lik etil alkol ile %100 lük aseton karışımı :%1 lik sudaki eriyiği 22

24 Asido Rezistan Boyama Özellikle Mycobacterium'lar olmak üzere Nocardia'lar gibi hücre duvarlarında bol miktarda lipid içeren mikroorganizmaların boyanmasında kullanılan bir yöntemdir. Bu boyama yönteminde asit-alkole dirençli boyanan bakteriler kırmızı (karbolfuksin ile), diğer bakteriler ve zemin mavi (metilen mavisi ile) boyanır. Metilen Mavisi Boyama Özellikle dışkı örneklerinde polimorfonükleer lökositlerin ve mikroorganizmaların gözlenebilmesi amacıyla uygulanır. Polimorfonükleer lökositler, bakteriler ve diğer hücreler mavi gözlenir. Giemsa Boyama Protozoa (Plasmodium vs.) türlerinin ve kan hücrelerinin gözlenmesi amacıyla uygulanır. Parazitler mavi-mor renkte ve kırmızı çekirdekli olarak gözlenir. Beyaz kan hücrelerinin çekirdekleri mor, sitoplazmaları mavi renkte görülür. Eritrositler ise açık kahverengi olarak gözlenir. Çini Mürekkebi Boyama Çini mürekkebi ile boyama, en sık Cryptococcus neoformans ın kapsülünün gözlenebilmesi amacıyla uygulanır. Çini mürekkebi kapsülü boyamadığından, siyah zemin üzerinde mayayı çevreleyen açık renkli kapsül gözlenir. Laktofenol Pamuk Mavisi Boyama Küf mantarlarının tanınması amacıyla uygulanır. Mavi boyanmış hifa ve spor morfolojileri incelenir. Spor Boyama Spor yapan bakterilerin, sporlarının varlığını ve yerleşimini gözlemek için kullanılan bir boyama yöntemidir. Bu yöntemle bakteri kırmızı (safranin ile), içindeki spor yeşil (malaşit yeşili ile) boyanır. Neisser Boyama Corynebacterium diphteriae'larda bulunan metakromatik cisimcikleri boyamada kullanılan bir boyama yöntemidir. Bakteriler sarı, metakromatik cisimcikler kahverengi boyanır. 23

25 Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. Masalarda bulunan besiyerlerde üremiş bakteri kolonileri, basit ve gram boyama yöntemiyle boyanıp mikroskopta incelendikten sonra şekil (kok, basil) ve renkleri (mor, pembe) belirterek çizilecek. Boyama: Basit boyama Boyama: Gram boyama Boyama: Gram boyama Bakteri: Bakteri: S. aureus Bakteri:E.coli Şekil: Şekil: Şekil:.. Renk: Renk: Renk:. Tarih Laboratuvar görevlisinin imzası NOT: Diğer boyama yöntemleri daha sonra yapılacak olan ilgili laboratuvar saatlerinde uygulamalı olarak gösterilecektir. Kaynaklar 1. Bilgehan H (2004). Klinik Mikrobiyolojik Tanı. Dördüncü baskı. Barış yayınları, İzmir, Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı (2003). Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH,Landry ML, Pfaller MA (2009). Manual of Clinical Microbiology. Klinik Mikrobiyoloji. Cilt 1. 9th ed.,atlas Kitapçılık Tic. Ltd. Şti., Ankara,

26 Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-3 Sterilizasyon ve Dezenfeksiyon Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Gerekli Malzemeler Sterilizasyon ve dezenfeksiyon yöntemlerinin öğrenilmesi Sterilizasyon kontrol yöntemlerinin öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Sterilizasyon ve dezenfeksiyon ile ilgili tanımları açıklar. Sterilizasyon ile dezenfeksiyon arasındaki farkı açıkla.r Sterilizasyon yöntemlerini gruplandırır. Sterilizasyon yöntemlerinin önemli özelliklerini sıralar. Sterilizasyonun işlem basamaklarını sıralar. Sterilizasyonun kontrol yöntemlerini sıralar. Dezenfeksiyon yöntemlerini gruplandırır. Dezenfektanları sıralar ve önemli özelliklerini sayar. Laboratuvarda kullandığı bazı malzemelerin (öze vb.) sterilizasyonunu yapar. Laboratuvarda kullandığı bazı malzemelerin (Laboratuvar masası vb.) dezenfeksiyonunu yapar. Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Bu uygulamada öğrencilere Merkezi Sterilizasyon Ünitesi tanıtılacaktır. Sıvı sabun Kağıt havlu Alkol bazlı solüsyon Çamaşır suyu Eldiven Maske Bone Otoklav Pastör fırını Yıkama cihazları Etilen oksit sterilizasyon cihazı Giriş Bulaşıcı hastalıkların yayılması, besin maddeleri ve diğer materyallerin bozulması ve hastane enfeksiyonlarının önlenmesinde, sterilizasyon ve dezenfeksiyonun önemi yaklaşık 150 yıldan beri bilinmektedir. 25

27 Dezenfeksiyon ve Sterilizasyon ile İlgili Önemli Terimler Sterilizasyon Ortamın, bir madde ya da cismin mikroorganizmaların tüm canlı ve aktif şekillerinden (patojen, saprofit, spor veya vejetatif) kabul edilebilir sterilite güvence düzeyini sağlayacak ölçüde arındırılması işlemidir Dezenfeksiyon Bir cismin veya maddenin patojen (hastalandırıcı nitelikteki) mikroorganizmalarından arındırılması işlemidir. Bu işlem ile bakteri sporları dışındaki tüm formlar (bakteri, mantar, protozoon gibi tüm mikroorganizmaların vejetatif şekilleri ve viruslar) yok edilir. Dekontaminasyon Patojenik mikroorganizma sayısının koruyucu bir giysi olmaksızın kullanım için güvenli seviyesine indirgenmesidir. Antisepsi Vücut yüzeylerindeki (deri, mukoza gibi) ve çeşitli yaralardaki patojen mikroorganizmaların, kimyasal maddeler kullanılarak yok edilmesi işlemidir. Hastayla bağlantılı olarak; canlı bir dokunun veya derinin dezenfeksiyonudur Asepsi Patojen mikroorganizmalardan arındırılmış bir ortam anlamına gelmektedir Germisid Mikrorganizmaları öldüren ajanlar Sterilant (kimyasal) Yüksek düzey dezenfektan Orta düzey dezenfektan Düşük düzey dezenfektan Mikrobiyostatik Sterilizasyonu sağlayabilen kimyasal Çoğu bakteriyel endosporlar hariç mikrobiyal patojenlerin tümünü öldüren dezenfektan Bakteriyel endospor dışında tüm mikrobiyal patojenleri öldüren dezenfektan Vejetatif bakteriler ve zarflı virüsleri öldüren dezenfektan Mikroorganizmaların üremelerini önleyen madde ya da etmenlere mikrobiyostatik maddeler, bu etkiye de mikrobiyostatik etki denir. Merkezi Sterilizasyon Ünitesi Merkezi Sterilizasyon Ünitesi (MSÜ) kirli alan, temiz alan ve steril alandan oluşur. Şekil 3-1. Merkezi Sterilizasyon Ünitesi alanları 26

28 Şekil 3-2. Kirli alan Şekil 3-3. Temiz alan Şekil 3-4. Steril alan 27

29 Sterilizasyon Şekil 3-5. Sterilizasyon işlem basamakları I. Fiziksel Yöntemler ile Sterilizasyon A. Isı ile yapılan sterilizasyon 1. Kuru ısı ile sterilizasyon a) Yakma ve alevden geçirme b) Kuru sıcak hava ile sterilizasyon 2. Nemli ısı ile sterilizasyon a) Buharla sterilizasyon i. Basınçlı buharla sterilizasyon ii. Basınçsız buharla sterilizasyon iii. Akım halindeki buharla sterilizasyon b) Sıcak su ile sterilizasyon i. Kaynatma ii. Tindalizasyon iii. Koagulasyon B. Süzme (filtrasyon) ile sterilizasyon 1. Mekanik olarak süzme 2. Adsorbsiyon yoluyla süzme C. Işınlama ile sterilizasyon 1. Ultraviyole ışınları ile yapılan sterilizasyon 2. Gama ve x ışınları ile yapılan sterilizasyon II. Kimyasal Maddeler ile Sterilizasyon A. Sıvı ortamlara kimyasal maddeler eklenerek yapılan sterilizasyon 1. Timol 2. Kloroform B. Gazlar ile yapılan sterilizasyon 1. Etilen oksit 28

30 2. Beta propiolakton Kuru Sıcak Hava ile Sterilizasyon: Kuru sıcak hava ile sterilizasyon için Pastör fırını adı verilen elektrikli sterilizasyon aleti kullanılır. Üzerlerinde fırının ulaştığı ısıyı takip etmeye yarayan termometre bulunur. Kuru sıcak hava ile; Cam ve metalden yapılmış malzemeler (tüp, balon, petri kutusu, pipet, penset vb.), Nemin içlerine ulaşamaması nedeniyle nemli hava ile sterilize edilemeyen yağlar (vazelin, parafin vb.), Süzgeç kağıtları ve buna benzer nitelikte, yüksek ısıda bozulmayacak malzemeler sterilize edilir. Besiyerleri ve sıvılar kuru sıcak hava ile steril edilmezler. Genel olarak kuru sıcak hava ile sterilizasyon için malzemeler; 175 C'de bir, 165 C'de iki, 150 C'de üç ve 120 C de 8 saat tutulmalıdır. Şekil 3-6. Pastör fırını Basınçlı Buhar ile Sterilizasyon Otoklav: Bu yöntemde temel ilke, doymuş ve basınç altındaki su buharında, 100 C'nin üzerinde sterilizasyondur. Bu amaç için otoklav denilen aletler kullanılır. Otoklav ile sterillemede; 1 atmosfer basınç altında 121 C'de dakika ya da 115 C'de 30 dakika bekletmek yeterlidir. Otoklavda daha çok besiyerleri, çözeltiler, kullanılmış petriler vs. steril edilir. Basınçlı buharla sterilizasyon kullanılamadığı durumlar şunlardır: Yüksek ısı ve neme duyarlı aletler (krom kaplama, optik aletler, vs.) Buharın penetre olamayacağı maddeler (yağ, pudra vs.) Şekil 3-7. Değişik şekillerde dizayn edilmiş otoklavlar 29

31 Gazlar ile Yapılan Sterilizasyon Etilen Oksit: Etilen oksit 10.8 C'nin altında sıvı, üzerindeki ısılarda ise gaz halinde bulunan bir maddedir. Saf halde iken çok toksik, iritan ve patlayıcı olduğundan belli oranlarda karbondioksit ile karıştırılarak kullanılır. Etilen oksit çok etkin bir jermisit olup, sporları da öldürür. Hücre sitoplazmasındaki çeşitli maddelerle kimyasal bileşikler yaparak etki gösterir. Oldukça penetran özelliktedir, kağıt ve polietilenden yapılmış olan ambalajları geçerek, iç kısımda paketlenmiş olan aletleri steril ederken, sterillenen madde ve aletlerin niteliğini bozmaz. Şekil 3-8. Etilen oksit sterilizatörü Sterilizasyonun Denetlenmesi Isı ile yapılan sterilizasyonda; ısının derecesi ile yeterli sürede uygulanıp, uygulanmadığı ve steril edilmek istenen malzemelerin her yerine ulaşıp, ulaşmadığı sterilizasyon üzerine etkili faktörlerdir. Sterilizasyonun tam olabilmesi için otoklav ve pastör fırınlarının düzenli olarak bakımı yapılmalıdır. Ayrıca yapılan sterilizasyon işleminin etkili olup, olmadığını anlamak için de çeşitli denetleme mekanizmaları geliştirilmiştir: 1. Browne sterilite kontrol tüpleri denilen ve içlerinde 115 C'de 25 dakikada, 121 C'de 15 dakikada ve 160 C'de 1 saatte renk değiştiren sıvılar bulunan tüpler, otoklav ya da pastör fırınının ortasına yerleştirilir. Sürenin sonunda tüp içindeki sıvının renginin kırmızıdan yeşile dönmesi sterilizasyonun sağlıklı olduğunu gösterir. 2. Otoklavlar için yapılmış özel ilaçlı yapışkan bantlar bulunmaktadır. Steril edilmek istenen paketin üzerine yapıştırılan bu bantların, sterilizasyon süresi sonunda renk değiştirmesi, bu paketin otoklavlandığını, bazıları da sterilizasyonun derecesini gösterir. 3. Bacillus stearothermophilus ve Bacillus subtilis gibi sporları 121 C'de 12 dakikada ölen bakterilerin sporları uygun tüpler içinde otoklavın ortasına yerleştirilir. Sterilizasyon süresi sonunda otoklavdan çıkarılan bu tüplerin içine sporların üremesi 30

32 için uygun olan tiyoglukolatlı buyyon ilave edilir. Tam sterilizasyon sağlandı ise; sporların ölmüş olması ve besiyerinde herhangi bir üreme olmaması gerekir. Dezenfeksiyon I. Fiziksel Yöntemler ile Dezenfeksiyon A. Sıcak su ile dezenfeksiyon: Ucuz, kolay, güvenilir bir yöntemdir. Üç şekilde uygulanabilir: 1. Kaynar su ile dezenfeksiyon: 100 C de vejetatif şekiller birkaç dakikada ölürler C de sıcak suda tutma ile dezenfeksiyon. 3. Pastörizasyon: C arasında en az 30 dakika tutma ile dezenfeksiyon. B. UV ışınları ile işleme tabi tutma: II. Kimyasal Yöntemler ile Dezenfeksiyon A. Anorganik Bileşikler 1. Asit ve alkaliler: H 2 SO 4, HNO 3, HCl, KOH, NaO, vb. 2. Ağır madenler ve tuzlar: CuSO 4, HgCI 2, AgNO 3, vb. 3. Oksidan maddeler: %3 oranında H 2 O 2 ve 1/1000 oranında KMnO 4, vb. 4. Halojenler ve bileşikleri: Klor, brom ve iyot germisittir. 5. Kireçli maddeler B. Organik Bileşikler 1. Organik metal bileşikleri: Çoğunlukla Hg ve Ag bileşikleridir. 2. Fenoller ve alkoller a) Alkoller b) Klorheksidin 3. Deterjanlar: Yüzey aktif maddelerdir. a) Anyonik bileşikler: Sabunlar büyük moleküllü yağ asitlerinin Na ve K tuzlarıdır. b) Noniyonik bileşikler: Polieterler ve poligliserol esterleri bu gruptadır. c) Katyonik bileşikler: En çok bilineni benzalkonyum klörür (Zefiran), stilpiridiyum klorür ve diaperen klorürdür. C. Gaz dezenfektanlar 1. Kükürtdioksit 2. Formaldehit: Formalin formaldehitin %40 lık çözeltisidir. 3. Etilen oksit 4. Kloroform 5. Boyalar: Malaşit yeşili, brillant yeşili, kristal viole, metilen mavisi, rivanol 31

33 Tablo 3-1. Yaygın olarak kullanılan dezenfektanlar ve kullanım alanları Germisidler Glutaraldehid % 2-3,2 Hidrojen peroksit % 3-25 Klor Kullanım dilusyonu ppm bağışık klorin Dezenfeksiyon seviyesi Yüksek / Sterilizasyon Yüksek / Sterilizasyon Yüksek İzopropil alkol % Orta Hastane uygulamaları Endoskoplar Kontakt lensler Bazı yarı kritik cihazlar Küçük alan yüzeyleri Fenol bileşikleri % 0,4-5 Orta Cerrahi aletler İyodoforlar Dörtlü amonyum bileşikleri ppm serbest iyodin Orta % 0,4-1,6 akışkan Düşük Tıbbi cihazlar Gıda hazırlama sahaları ve yerler El antisepsisi Dezenfeksiyon ve Antisepsi Uygulama Yöntemleri Ellerin saniye süreyle sabunla yıkanmasıyla mevcut mikroplar, lipit içeren kir tabakası ile birlikte, lipit yapısının erimesi ve akması ile ortamdan uzaklaştırılırlar. Bu tür el yıkama işlemine hijyenik el yıkama adı verilir. Hijyenik el yıkama ile günlük yaşantı için yeterli antisepsi sağlanır. Hastanelerde doğrudan hasta ile ilişkisi olan sağlık personelinin %3 heksaklorofenli, %5 krezollü sabunlar ile el yıkamaları daha etkin bir önlemdir. Hijyenik el yıkama ile geçici floranın tamamı, kalıcı floranın ise bir kısmı ortadan kaldırılmış olur. Hijyenik el yıkamasından sonra, antiseptik maddelerle yapılan el yıkamasında ise mikroorganizmaların öldürülmesi ya da gelişmelerinin durdurulması amaçlanır. Bu tür el yıkama yöntemine cerrahi el yıkama yöntemi adı verilir. Cerrahi el antisepsisi için önerilen çeşitli yöntemler içinde en etkililerinden biri; ellerin önce %5 krezollü veya %3 heksaklorofenli sabun ya da emülsiyonlarla 7 dakika sabunlanıp, fırçalanmasından sonra 3 dakika süre ile %70'lik etil alkolle muamele edilmesidir. Önerilen bir diğer yöntem ise klorheksidinin deterjan içindeki %4'lük kremi ile ellerin 2-3 dakika fırçalanıp, yıkanmasıdır. Deri antisepsisi Çeşitli cerrahi girişimlerden önce, cerrahi girişim yapılacak olan bölgedeki derinin antisepsisi gereklidir. Bu amaçla önce deri çok kirli ise sabunlu su ile yıkanmalı, sonra çeşitli antiseptiklerle muamele edilmelidir. Kullanılan antiseptiklerin başında iyot tentürü gelir. Bunun yanısıra alkol, alkol iyot, merthiolat, mersol gibi antiseptikler de kullanılabilir. 32

34 Yara antisepsisi Toz, toprak gibi maddelerle kirlenmiş yaralardaki yabancı cisimler temizlenir ve yara bölgesi sabunlu su ile yıkanarak kaba kirleri giderilir. Daha sonra %1 benzalkonyum klorür ve %3 hidrojen peroksit ile yıkanır. Ayrıca yara, iyot tentürü, %0.1 merthiolat veya alkol ile de silinebilir. Suların dezenfeksiyonu Bu amaçla klor ve klor verici maddeler kullanılır. Şehir şebekesi suları gibi, büyük miktarlardaki suyun dezenfeksiyonunda klorinatör denilen cihazlarla su içerisine gaz halinde klor verilir. Etkin bir klorlamada, klorlama işleminden 1 saat sonra klorlanmış suda litrede 0.2 mg bağımsız klor bulunması gerekir. Laboratuvar dezenfeksiyonu Çalışma alanları (banklar) dezenfeksiyon için, her çalışma günü sonunda %5 fenol, %5 krezol, %3 lizol gibi dezenfektanlardan birisi ile temizlenmelidir. Virüs laboratuvarlarında ise, bu maddelerin viruslara etkisi az olduğundan ayrıca %1-3 sodyum veya kalsiyum hipoklorit ile silinmelidir. Kullanılan tüm mikroplu ekim ve materyaller otoklavlanmalıdır. Döşeme ve duvarlar, hastane uygulamasındaki gibi, önce sabunlu su ile iyice fırçalanmalıdır. Daha sonra %3-5 fenol veya %5 krezol eriyikleri ile silinebilir. Fayans ve yağlı boya duvarlara da aynı işlem uygulanabilir. Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. Sterilizasyon ve dezenfeksiyonda kullanılan alet ve malzemeleri inceleyiniz. Kaynaklar 1. Bilgehan H (2005). Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi. 11. baskı. Barış Yayınları Fakülteler Kitabevi, İzmir, Poyraz Ö (1998). Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Kılavuzu. T.C. Cumhuriyet Üniversitesi Yayınları No:68, Sivas, Günalp A, Yılmaz YA, Pınar A (2003). Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı. Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Ankara, Cengiz T (2001). Mikrobiyoloji Pratik Kitabı. Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, 3. baskı. Antıp A.Ş. Yayınları, Ankara,

35 Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-4 Mikrobiyota Dersin Amacı Dersin Hedefleri Bilgi Mikrobiyota bulunan mikroorganizmaların öğrenilmesi Antibiyogram yönteminin öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Mikrobiyotada bulunan mikroorganizmaları sayar Mikrobiyota ve patojen mikroorganizmaların ayrımını yapar Antibiyogram çeşitlerini öğrenerek antibiyogram testini yapar Tutum Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Gerekli Malzemeler %5 koyun kanlı agar EMB SDA Öze Transport besiyeri Müller Hinton Broth Müller Hinton Agar Antibiyotik diskleri Alkol Pens 0,5 McFarland Tüpü Eküvyonlu çubuk Giriş Sağlıklı insan vücudunda, vücuda zarar vermeden denge içinde yaşayan mikro-organizma topluluklarına normal mikrobiyal flora denir. Mikroorganizmaların neden oldukları hastalık etkenlerinin saptanması; bu bağlamda klinik örnek alınması, taşınması, gerektiğinde saklanması, uygun ortamlara ekim yapılması, değerlendirme ve tedavide normal vücut florasının bilinmesi gerekir. Mikrobiyota Mikrobiyal flora vücudumuzu örten deri ve dış çevre ile çeşitli bağlantılarla ilişkili olan yüzey, boşluk ve organlar ile mukoza membranlarına yerleşmiştir. Flora üyeleri vücudun çeşitli 34

36 bölgelerinde yaş, cins, hormonal durum, beslenme ve sağlık alışkanlıklarına bağlı olarak değişiklik gösterir. Mikrobiyal flora iki grupta ele alınır. 1- Kalıcı Flora: Belirli bölgelerde ve belirli yaşlarda genellikle değişmeyen, kısa süreli ortadan kaldırılsa bile yeniden oluşabilen, genellikle sabit kabul edilen, süreklilik gösteren mikroorganizma topluluğudur. Kalıcı floranın bozulan mikrobiyotayı yeniden oluşturma özelliği vardır. 2- Geçici Flora: Kalıcı floranın yanında, çoğu hastalık oluşturmayan, bazen patojen olabilen, belirli vücut bölgelerinde birkaç saatten birkaç haftaya kadar değişebilen sürelerde kalan mikroorganizma topluluğudur. İnsan vücudunun dış ortamla temasta olmayan dışarıya kapalı, vücut yüzeyi ile sıvı ve boşlukları flora üyeleri taşımazlar. KALICI FLORANIN ÖNEMİ Kalıcı flora üyeleri sağlığın korunmasında doğal direnç mekanizmalarından birini oluşturmaktadır. Kalıcı floranın etkinlikleri şu şekilde sıralanabilir. 1- Bazı bağırsak flora üyeleri, K vitamini sentezi ve besinlerin emiliminde rol alırlar. 2- Mukoza ve deride bakteriyel interferans mekanizması ile patojen bakterilerin kolonizasyonunu önlerler. 3- Besin maddeleri ve yerleşme yerleri için patojen bakteriler ile yarışırlar. 4- Bazı bakterilerin üremesini engelleyen bacterisoidin adlı maddeler salgılarlar. 5- Konak hücre yüzeyindeki reseptör ve diğer bağlanma yerleri için patojen mikroorganizmalarla yarışırlar. Mikrobiyotanın kalıcı üyeleri bazı özel durumlarda (travma, immün yetmezlik gibi) fırsatçı hastalık etkeni olarak değerlendirilmektedirler. ANTİBİYOTİK KULLANMANIN FLORA ÜZERİNE ETKİSİ Antibiyotiklere duyarlı mikrobiyota üyeleri canlılıklarını kaybederek yok olurken, dirençli flora üyeleri çoğalmaya devam ederek popülasyona hâkim olurlar. Dolayısıyla floranın dengesi bozulur ve bu durumda geçici flora olarak bulunan mikroorganizmalar patojen davranabilirler. Örnek C. difficile psödomembranöz enterokolit oluşturur. BAZI VÜCUT BÖLGELERİNİN FLORA ÜYELERİ 1- Derinin Mikrobiyotası: Derinin dış ortamla sürekli temasta bulunması, deride geçici flora üyeleri için yoğunluk, çeşitlilik ve bölgelere göre farklılık özelliklerini de getirmektedir. Derideki florayı etkileyen etkenler başlıca etkenler; epidermisin kalınlığı, yağ ve ter bezlerinin dağılımı, kılların dağılımı, derinin nem oranı, derinin üzerindeki anatomik deri kıvrımları, deri üzerinde bulunan yağ asidi, lizozim vb. enzimlerin varlığı. 35

37 Deri flora üyelerinden S.aureus yüksek oranda hastalık nedeni olabilmekte, bunu KNS takip etmektedir. Deri de ayrıca Propionibacteriım acnes, alfa hemolitik streptokoklar, mayalar, nonpatojen mikobakteriler ve peptokoklar flora üyesi olarak bulunmaktadır. 2- Ağız Ve Üst Solunum Yolları Mikrobiyotası: Doğum sırasında üst solunum yolları sterildir. Ağız florası doğumdan 6 8 saat sonra oluşmaya başlar ve 4 12 saat sonra viridans streptokoklar kalıcı floranın ilk ve yoğun üyesi olmaya başlar ve hayat boyu devam eder. Yeni doğan, çocukluk ve erişkin dönemleri ile ağız hijyeni ve besleme alışkanlıkları ağız florasını etkileyen evre ve faktörlerdir. Daha sonra dişler çıkmaya başlamadan önce aerobik ve anaerobik stafilokoklar, Gram negatif diplokoklar ve difteroidler görülür. Dişler çıkmaya başladıktan sonra ise viridans streptokoklar yeniden ağız florasını temel üyesi durumuna gelirler. Anaerop streptokoklar, anaerobik laktobasiller, fusiform basiller ve bacteroidesler normal ağız florasında yer alan bakterilerdir. Boğaz florasında hemoliz yapmayan streptokoklar, neisserialar, stafilakoklar, difteriodler, A grubu dışı beta hemolitik streptokoklar, peptostreptokoklar, haemophiluslar, koagülaz negatif stafilakoklar bulunur. A grubu beta hemolitik streptokoklar, boğazda yüksek oranda hastalık nedenidirler. Alt solunum yolları bronşiyol ve alveoller normal koşullarda flora taşımazlar. 3- Sindirim Sistemi Mikrobiyotası: Doğum sırasında gastrointestinal sistem sterildir. İlk beslenme ile flora oluşmaya başlar. Özofagusta mikrobiyota yoğunluğu azdır. Tükürük ve yiyeceklerle taşınan mikroorganizmalar yer alır. Mide ph sı asit olduğundan mide mikroor-ganizma sayısını minimum sayıdadır. Asidik ortam kolera ve bazı enterik patojenlerden vücudu korur. Doğumda bağırsaklar sterildir. Anne sütüyle beslenen çocuklarda laktobasiller ve laktik asit streptokokları yoğun olarak bulunurken, mama ile beslenen yenidoğanlarda laktobasiller az, buna karşılık Gram negatif çomaklar özellikle koliform bakteriler egemendir. Mideden itibaren gastrointestinal sistemde yukardan aşağıya doğru gidildikçe mikroorganizma yoğunluğu artar. Fekal florada %96 99 unu anaerop, %1 4 nü ise aerop ve fakültatif anaerop bakteriler bulunur. Kolunun bir gram dışkısında mikrorganizma yer alır. Gastrointestinal sistemin tümü ele alındığında mide için Helicobacter pylori, kalın bağırsak için bacteroides türleridir. 4- Üretranın Mikrobiyotası: Her iki cinste de aynı tip ve az sayıda olmak üzere koagülaz negatif stafilakok, propionibacteriumlar, alfa hemolitik streptokoklar, bazı mikobakteriler, kadında Candida albicans, Gardnerella vaginalis ve lactobacillus türleri bulunur. Vagina florası yaşa bağlı olmak üzere dört döneme ayrılır. 36

38 a. Doğumdan hemen sonra anne hormonlarını etkisi altında bulunan çocuğun vagina florası annenin vaginal florasına benzer(aerop laktobasiller). Ortam ph sı asit olup birkaç hafta sürer. b. Puberteye kadar glikojen olmadığından ph nötraldir. Gram pozitif ve Gram negatif kok ile Gram negatif koliform basiller bulunur. c. Puberteden menapoza kadar vajinal epitelinin glikojenden zengin yapısı ve aerop ve anaerop laktobasillerin varlığı nedeniyle ortam tekrar asidik olur. d. Menapozdan sonra laktobasiller azalıp ph yükselir ve karışık bakteri florası olu-şur. Normal vajina florasında laktobasil, stafilakok, Gardnerella vaginalis, B grubu strepto-kok ve bakteriodes türleri yer alır. Vagina flora üyeleri doğum sırasında yenidoğan bebeği infekte edebilirler. Özellikle B grubu streptokoklar, yenidoğan sepsislerinde bu açıdan önemlidir. 5- Göz Mikrobiyotası: Sağlıklı insanda göz konjunktivasında az miktarda bakteri bulunur. Sıklıkla koagülaz negatif stafilakok, laktobasiller nadiren de S. aureus, haemophilus, enterik bakteriler ile streptokoklar yer alır. Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. %5 koyun kanlı agar, EMB, SDA besiyerlerine boğaz, burun, deri örneklerini ekiniz. Kaynaklar 1. Bilgehan H. (2009) Klinik Mikrobiyoloji Tanı. Beşinci Baskı. Barış yayınları, İzmir. 2. Çotuk A. (2003) Genel Mikrobiyoloji Laboratuar Yöntemleri. Nobel Tıp Kitabevleri, İstanbul. 3. Bilgehan H. (2008) Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi, 12. Basım. Barış yayınları, İzmir. 37

39 Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik -5 Antibiyotik Duyarlılık Testleri Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Mikrobiyolojide kullanılan antibiyotik testlerinin neden yapıldığının ve çeşitlerinin ve yapılışlarının öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Antibiyotik testlerinin çeşitlerini sayar Niçin antibiyotik testi yapıldığını söyler Testlerin yapılışını öğrenir Antibiyotik testlerinin değerlendirmesini yapar Hangi testi nasıl kullanacağını bilir Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Gerekli Malzemeler Üreme olmuş örnek Öze Müller Hinton Broth Müller Hinton Agar Antibiyotik diskleri Alkol Pens 0,5 McFarland Tüpü Eküvyonlu çubuk Antibiyotik Duyarlılık Testleri Antibiyotiklerin mikroorganizmalarla ilişkileri çeşitli yönlerden incelenmektedir. Bunlardan başlıcaları şunlardır: 1- Antimikrobiklerin mikroorganizmalar üzerindeki etkinliklerinin ölçülmesi 2- Vücut sıvılarındaki antimikrobik etkinliğinin ölçülmesi 3- Sağaltım sırasında vücut sıvılarındaki antimikrobik maddenin hastalık etkeni üzerindeki etkinliğinin saptanarak dozunun ayarlanması 4- Mikroorganizmaların antimikrobiklere karşı oluşmuş dirençliliğinin saptanması 38

40 5- Antimikrobiklerin mikroplar üzerindeki birlikte etkilerinin saptanması Dilüsyon (sulandırım) yöntemlerinde kural; sıvı ya da katı besiyerleri içinde antimikrobiklerin belirli sulandırımları yapılarak mikroorganizmalarla karşılaştırılmasıdır. Antimikrobik maddenin hangı sulandırıma kadar mikroorganizma üzerinde etkili olduğu MIC (Minimal inhibitör konsantrasyon), MCC (Minimal sidal konsantrasyon) ya da MBC (Minimal bakterisidal konsantrasyon) yöntemleri ile saptanabilmektedir. Sıvı besiyerlerinde mikroorganizmalarla antimikrobikler doğrudan doğruya ilişkide bulunduklarından sonuçlar daha duyarlı olarak bulunmaktadır. Gerek antimikrobiklerin etkinliklerinin araştırılmasında gerekse mikroorganizmaların dirençlerinin araştırılmasındaki çalışmalarda kalite kontrolü yapmak için antimikrobiklere karşı dirençlilik durumları bilinen standart mikroorganizmalardan yararlanmak gerekmektedir. Mikroorganizmaların antibiyotiklere duyarlılıkları çeşitli yöntemlerle saptanır: 1- Katı besiyerinde yayılım (Difüzyon) (Kalitatif) Disk difüzyon yöntemi (Kirby - Bauer Disk Difizyon Yöntemi) 2- Katı besiyerinde sulandırma (Dilüsyon) (Kantitatif) 3- Sıvı besiyerinde sulandırma (Kantitatif) MİK (Minimal inhibitor Konsantrasyon) tayini.mikrodilüsyon ve makrodilüsyon olmak üzere iki şekilde yapılabilir. 4- E testi (Kantitatif) Besiyeri: Mueller Hinton Agar Kirby-Bauer Disk Difüzyon Yöntemi Ticaretten hazır olarak elde edilebileceği gibi laboratuvarlarda da hazırlanabilir. Besiyeri düz tabanlı 90 mm iç çaplı petri kutularına 4 mm kalınlıkta dökülür. Hemen kullanılacak besiyerleri katılaştıktan sonra yüzeylerinin kuruması için kapakları üstte ve hafif aralık olarak C de 30 dakika tutulurlar. Hemen kullanılmayacak besiyerleri ise nem kaybının önlenmesi için plastik torbalara doldurulup torbaların ağzı yapıştırıldıktan sonra buz dolabında bekletilirler. Bu şekilde + 4 ile + 10 derecede 2 hafta süre ile bozulmadan saklanabilirler. Bakteri yoğunluğunun standardizasyonu: Antimikrobiklere karşı duyarlılığı ölçülecek olan mikroorganizmanın besiyerine standart miktarda ekilmesi gerekir. Bunun için 0,5 numaralı Mac Farland bulanıklık standardı kullanılır.bu tüpün bulanıklığı 0,05 ml Ba Cl ve 9,95 ml H 2 SO4 karışımının bulanıklığına eşittir ve yaklaşık 10 8 Kob /ml bakteri yoğunluğuna karşılık gelir.mac Farland 0,5 no.'lu tüpün arkasına çizgiler çizilmiş bir kağıt konduğunda çizgiler net olarak görülmelidir (Şekil 1). 39

41 Şekil 5-1. Bulanıklığın ölçülmesi Hazırlanan bulanıklık sıvısı bir deney tüpüne konur. Ağzı sıkıca bir lastik tıkaç ile kapatılır. Oda derecesinde ve karanlıkta saklanmak koşulu ile 6 ay kullanılabilir. Kullanırken iyice çalkalanmalıdır. Ekimi yapılacak bakterinin bulanıklığı bu karışımın bulanıklığına ayarlanarak ekim yapılır. Bakteri ekimi için ucuna hidrofil pamuk sarılmış, kuru sıcak havada sterillenmiş eküvyonlar hazırlanır. Deneyin Yapılışı: 1- Duyarlılığı araştırılacak bakteri kültüründen 5-6 koloni seçilerek sıvı besiyerine aktarılır. 2- Bu kültür 4-5 saat inkübe edildikten sonra oluşan bulanıklık standart MacFarland No.0,5 bulanıklık tüpü ile karşılaştırılarak aynı bulanıklığın elde edilmesine kadar serum fizyolojik ile sulandırılır. 3- Bir pamuklu eküvyon alınıp kültüre daldırılır. Sıvının fazlası ekivyonun tüp yüzeyine bastırılarak burulması ile akıtılır. Eküvyon besiyerinin yüzeyine çevrile çevrile sürülerek tüm yüzeye yaygın, homojen ekim yapılır. 4- Antimikrobik disklerinin seçilmesi: Tedavide kullanılan bir çok antibiyotik vardır. Bunların bir kısmı mikroorganizmaların üzerinde aynı ya da benzer etki mekanizması ile etki ederler. Bir kısmına ise bazı mikroorganizmalar doğal olarak direnç gösterir.bunun için hastalık materyeline ve ayrımı yapılan mikroorganizmaya göre gerekli görülen disklerin seçilerek kullanılmaları gerekir. 5- Disklerin yerleştirilmesi: Besiyerinin yüzeyi kuruduktan sonra diskler belli bir plan dahilinde, ince uçlu bir penset ile tutulup besiyeri yüzeyine bırakılarak üzerlerine hafifçe bastırılıp yapışmaları sağlanır. Her defasında pensetin ucu alkole sokulup alevde yakılır. Diskler besiyeri kenarından yaklaşık 15 mm ve birbirlerinden mm uzaklıkta dizilirler. Bu şekilde 90 mm lik bir petri kutusuna 6-7 si kenarda, biri ortada olmak üzere 7-8 disk yerleştirilebilir. 40

42 6- Disklerin dizilmesinden itibaren en çok 15 dakika içinde besiyerleri 35 C lik etüvde üremeye bırakılır. Bir gecelik inkübasyondan sonra disklerin etraflarında oluşan üremenin olmadığı önlenim zonlarının çapları mm olarak ölçülerek not edilir. Ölçüm göz ile görülen üremenin olmadığı önleme zonunun çapı alınarak yapılır. 7- Sonuçların değerlendirilmesi: Milimetre olarak yapılan zon ölçümleri çizelgedeki sınırlar çerçevesi içerisinde incelenerek "dirençli, duyarlı ve orta derecede duyarlı" olarak değerlendirilir. Burada dirençli sonucu, o mikroorganizmanın, söz konusu antibiyotiğin sağaltımda kullanılan dozları ile elde edilen kan ve doku konsantrasyonlarına karşı dirençli olduğu anlamındadır.duyarlı sonucu, mikroorganizmanın antibiyotiğin aynı konsantrasyonlarına karşı duyarlı olduğunu gösterir. Orta derecede duyarlı sonucu ise kullanılan antimikrobiğin daha yüksek dozlarda verilmesi halinde sonuç alınabileceği anlamındadır. Şekil 5-2. Kirby - Bauer Disk Difüzyon Yöntemi Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. Kirby - Bauer Disk Difüzyon Yöntemi ile antibiyogram hazırlayınız. Kaynaklar 1. Bilgehan H. (2009) Klinik Mikrobiyoloji Tanı. Beşinci Baskı. Barış yayınları, İzmir. 2. Çotuk A. (2003) Genel Mikrobiyoloji Laboratuar Yöntemleri. Nobel Tıp Kitabevleri, İstanbul. 3. Bilgehan H. (2008) Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi, 12. Basım. Barış yayınları, İzmir. 41

43 Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-6 Serolojik Tanı Yöntemleri Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Gerekli Malzemeler Serolojik tanı yöntemlerinin öğrenilmesi En sık kullanılan serolojik test sonuçlarının yorumlanmasının öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Serolojik testlerin kullanım alanlarını açıklar. Serolojik tanı yöntemlerini sıralar. Serolojik tanı yöntemlerinin prensiplerini açıklar. En sık kullanılan serolojik testlerin sonuçlarını yorumlar. Lam aglütinasyon testlerini uygular. Aglütinasyon testlerinin sonuçlarını değerlendirir. Membrana bağlı immün test yöntemleri uygular. Membrana bağlı immün test sonuçlarını değerlendirir. Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Kontamine deney malzemelerini tıbbi atık kabına atar. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Brusella antikoru pozitif hasta serumu Rose Bengal lam aglutinasyon testi antijeni Lam Brusella antikoru pozitif tüp aglutinasyon testi Pozitif ve negatif örnekler içeren ELISA testi Membrana bağlı immün test (Örneğin; Helicobacter pylori dışkıda antijen testi gibi) Giriş Antijenlerle antikorlar arasındaki özgül reaksiyonlardan yararlanılarak yapılan çalışmalara serolojik testler denir. Bu testlerde temel amaç, bilinmeyen bir reaktifi (örneğin; antikor) bilinen bir reaktif (örneğin; antijen) kullanarak saptamaktır. Antijen veya antikordan birinin sabit miktarları ile diğerinin sulandırımları in vitro koşullarda karşılaştırılarak kantitatif sonuçlar elde edilebilir. Serolojik testler bakteriyel, viral, fungal, paraziter hastalıkların tanısında, bakteri serotiplerinin belirlenmesinde, otoantikorların tespitinde, ilaç düzeylerinin belirlenmesinde, immün sistemin değerlendirilmesinde, malignensilerin tanısında ve doku uygunluk antijenlerinin tespitinde kullanılabilmektedir. Serolojik testler serum, beyin omurilik sıvısı, idrar, tükrük, gaita gibi klinik örneklerden çalışılabilir. 42

44 En Sık Kullanılan Serolojik Tanı Yöntemleri: 1. Presipitasyon 2. Aglutinasyon a. Tam bakteri aglutinasyonu b. Lateks aglutinasyonu c. Koaglutinasyon d. Direkt hemaglutinasyon e. İndirekt (pasif) hemaglutinasyon (İHA) 3. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 4. Flouresan Antikor Tekniği a. Direkt flouresan antikor (DFA) tekniği b. İndirekt Flouresan antikor tekniği c. Kompleman bağlayan IFAT 5. Western blot ya da immünblot 6. Membrana bağlı immün testler 7. Radioimmun assay (RIA) 8. Kompleman fiksasyon testi Presipitasyon Testi Presipitasyon testi, çözünür (soluble) haldeki antijenlerin özgül antikorlarla birleşmesi ve kafes oluşturarak çözünür olmayan presipitin (çökelek) oluşturması esasına dayanır. Şekil 6-1. Presipitasyon testi( dan alınmıştır) Aglütinasyon Testi Partikül halindeki antijenlerin özgül antikorlar ile reaksiyona girerek gözle görülebilir kümeler oluşturması esasına dayanır. Bu test tüpte, lamda ya da özel karteksler üzerinde yapılabilir. Partiküler antijen olarak, bakteri hücresi, eritrosit veya taşıyıcı partiküller (örneğin lateks partikülleri) kullanılır. Tam bakteri aglutinasyonu: Bakteri hücreleri partikül olarak kullanılır. Tüpte ya da lamda uygulanabilir. Kullanılan bakteriler kültürde üretilmiş ve çeşitli kimyasal maddelerle muamele edilerek öldürülmüştür. Bir dizi tüp alınır. Bu tüplerde hasta serumunun seri dilüsyonları hazırlanır. Her tüpün üzerine standart miktarda bakteri süspansiyonu eklenir ve bir gece 43

45 etüvde inkübe edilir. Değerlendirmede, tüplerin çalkalanması ile oluşan kar yağdı manzarası şeklinde partiküllerin varlığı testin pozitif olduğunu gösterir. Şekil 6-2. Tüp aglütinasyon testi Test lamda yapılıyorsa bir damla bakteri süspansiyonu lama damlatılır. Hemen yanına bir damla hasta örneği konur. Her iki damla bir karıştırıcı (kürdan, plastik öze yada plastik karıştırıcı çubuk) yardımı ile birleştirilerek karıştırılır. Lama rotasyonlar yaptırılarak örneğin yavaşça karışması sağlanır. Genellikle 5-10 dakikalık süre sonunda gözle görülebilen partiküllerin oluşması testin pozitif olduğunun göstergesidir. Şekil 6-3. Lam aglütinasyon testi Mikrobiyolojide en sık kullanılan tam bakteri aglutinasyon testleri; Rose Bengal testi; Bruselloz tanısında kullanılır. Lam aglutinasyon testidir. Wright testi (Standart tüp aglutinasyon testi); Bruselloz tanısında kullanılır. Gruber Widal testi; Salmonelloz tanısında kullanılır. Lamda ya da tüpte uygulanabilir. Weil-Felix testi; Riketsiya enfeksiyonları tanısında kullanılır. Lamda ya da tüpte uygulanabilir. MAT (mikroaglutinasyon testi); Leptospira enfeksiyonları tanısında kullanılır. Lateks aglutinasyon testi: 1 µm çapında, polistren yapıda lateks partikülleri kullanılır. Genellikle lam ya da özel karteksler üzerinde yapılır. Antijen aranacaksa partiküller antikor ile, antikor aranacaksa antijen ile kaplanır. 1+ ile 4+ arası değerlendirilir. Şekil 6-4. Lateks aglütinasyon testi ( den alınmıştır). 44

46 Hemaglutinasyon testi: Partikül olarak eritrositler kullanılır. İki yöntem vardır. 1. Direkt hemaglutinasyon testi 2. İndirekt hemaglutinasyon testi Direkt hemaglutinasyon testi: Bazı enfeksiyonlarda eritrosit yüzeyindeki antijenlere karşı oluşan antikorların tespitinde kullanılır. Hızlı tanı sağlar. Özgüllük ve duyarlılıkları düşüktür. Mikrobiyolojide en sık kullanılan direkt hemaglutinasyon testleri; Soğuk aglutinasyon testi; M. pneumoniae enfeksiyonlarında, insan eritrositlerini soğukta aglutine eden soğuk aglutininlerin tespitinde kullanılır. Paul Bunnel testi; Epstein Barr Virus enfeksiyonlarında koyun ertrositlerini aglutine eden heterofil antikorlar tespit edilir. İndirekt (Pasif) Hemaglutinasyon (IHA) testi: Antikor saptanmasında kullanılan bir yöntemdir. Bu test için genellikle 96 kuyucuklu U tabanlı pleytler kullanılır. Çeşitli antijenler tannik asit ile eritrosit yüzeyine bağlanır (duyarlılaştırma). Hasta serumu üzerine duyarlılaştırılmış eritrositler eklenir. Pozitiflik olduğunda hemaglutinasyon, negatiflik olduğunda ise düğme gibi çökme olur. Şekil 6-5. İndirekt Hemaglutinasyon Testi ( dan alınmıştır). Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Bu metod bir enzim ile bir antijenin veya bir antikorun konjugasyonu esasına dayanır. Antikor ölçümü için bilinen antijenler mikrodilüsyon pleytlerine fikse edilir. Serum dilüsyonları eklenir. Serumda antijene spesifik antikor varsa antijen ile birleşecektir. Daha sonra peroksidaz veya alkalen fosfataz gibi bir enzimle işaretlenmiş antikorlar ile yeniden inkübe edilir. Enzime spesifik substrat eklenerek renk değişimi spektrofotometrede değerlendirilir. 45

47 Şekil 6-6. Ticari ELISA kitleri Şekil 6-7.Otomatize ELISA cihazı Şekil Kuyucuklu ELISA pleyti Floresan Antikor Tekniği (İmmunofloresan Antikor Yöntemi, IFA) İmmunoflouresan ankikor (IFA) yönteminde katı faz olarak lam (slide) kullanılır. Konjugat florokrom boyası ile işaretlenir. En sık kullanılan boya fluorescein isothiocyanate (FITC) tır. Direkt ve indirekt floresan antikor testi şeklinde uygulanabilir. Floresan mikroskobunda değerlendirilir. Şekil 6-9. Cytomegalovirüs (CMV) IFA testi Şekil Antinükleer antikor IFA testi Western Blot (WB) Yöntemi Bu yöntemde bir mikroorganizmaya ait antijenlerin bantlar halinde nitroselüloz kağıt membranlara geçirilmesi ile elde edilen stripler kullanılır. Striplerin üzerine hasta serumu eklenir. Enzimle işaretli konjugat ve sonra substrat eklenir. Hasta serumunda antikor varlığı koyu renkli bant oluşumu ile tespit edilir. Etkene özgül en az iki ve daha fazla bant oluşumu pozitif kabul edilir. 46

48 Şekil Borrelia western blot testi Sık Karşılaşılan Serolojik Profillerin Yorumlanması Hepatit A Virusu (HAV) Enfeksiyonunun Serolojik Tanısı Tablo 6-1. HAV enfeksiyonun serolojik tanısında kullanılan testlerin yorumlanması HAV IgM HAV IgG YORUM + - Yeni kazanılmış enfeksiyon, akut faz + + Geçirilmekte olan enfeksiyon - + Geçirilmiş enfeksiyon, kazanılmış bağışıklık Hepatit B Virusu (HBV) Enfeksiyonunun Serolojik Tanısı Tablo 6-2. HBV enfeksiyonun serolojik tanısında kullanılan testlerin yorumlanması HBs Ag Anti-HBs Anti-HBc Anti-HBc YORUM IgM IgG Erken akut enfeksiyon yada Anti- HBc nin oluşmamasına yol açan immun bozukluk /- Yeni kazanılmış enfeksiyon, akut faz Kronik enfeksiyon HBeAg(+): yüksek enfektivite AntiHBe(+): düşük enfektivite Aşıya bağlı bağışıklık Geçirilmiş enfeksiyon, kazanılmış bağışıklık /- Düşük düzey HBV taşıyıcısı HBsAg nin kaybolması, anti-hbs nin 47

49 saptanması arasındaki pencere dönemi Transfüzyon Yalancı pozitiflik veya nonspesifik reaksiyon + + +/- +/- Kronik aktif hepatit Farklı subtip enfeksiyonları İmmun kompleks ayrışması Hepatit C Virusu (HCV) Enfeksiyonunun Serolojik Tanısı Tablo 6-3. HCV enfeksiyonun serolojik tanısında kullanılan testlerin yorumlanması Anti-HCV RIBA HCV-RNA YORUM Geçirilmiş enfeksiyon, viremi yok Yalancı pozitiflik nonspesifik reaksiyon Aktif enfeksiyon, viremi var HIV Enfeksiyonunun Serolojik Tanısı ELISA, HIV antikorlarının tespitinde tarama amacıyla en sık kullanılan yöntemdir. ELISA ile reaktif sonuç tespit edildiğinde, test hastadan alınacak farklı bir örnekle tekrar edilir. İkinci örnekte de reaktif sonuç görülürse anti-hiv antikorları western blot ya da immünblot yöntemi ile araştırılır. Bu yöntemler ile pozitif sonuç alındığında anti-hiv antikorlarının pozitif olduğu söylenebilir. HIV enfeksiyonu tanısında polimeraz zincir reaksiyonu da kullanılabilir. Brusella Enfeksiyonunun Serolojik Tanısı Brusella enfeksiyonunun serolojik tanısında kullanılan aglutinasyon testleri; Rose Bengal testi: Lam aglutinasyon testidir. Hızlı tarama amacı ile kullanılır. B. abortus S99 suşu boyalı antijen olarak kullanılır. Sonuçlar Wright testi ile doğrulanmalıdır. Wright testi (Standart tüp aglutinasyon testi): Antijen olarak B. abortus S99 ya da B. melitensis antijenleri kullanılır. Hem B. abortus hem de B. melitensis antikorları tespit edilebilir. 1/160 ve üzerindeki pozitiflikler anlamlıdır. 1/80 dilüsyonda pozitiflik durumunda 2-4 hafta sonra test tekrar edilmelidir. Rose Bengal testi kuvvetli pozitif olduğu halde, Wright testi negatif veya zayıf reaksiyon gösteriyorsa Blokan antikorlardan şüphelenilir. Blokan antikorların varlığı Coombs testi veya enzim immunoassay ile tespit edilir. Spot test: Tam kanda çalışılan aglutinasyon testidir. 48

50 Brucella tanısında kullanılabilecek diğer serolojik testler; ELISA ile IgG ve IgM türü antikorların tespit edilmesi, kompleman birleşme deneyi ya da radioimmunoassay olarak sıralanabilir. Ebstein Barr Virus (EBV) Enfeksiyonunun Serolojik Tanısı Enfeksiyöz mononükleoz geçiren insanların kanında iki çeşit antikor oluşur; EBV e karşı oluşan antikorlar ve heterofil antikorlar (Paul-Bunnel antikorları). Heterofil antikorlar monospot test ya da Paul Bunnel testi ile değerlendirilebilir. EBV antijenleri: Viral kapsid antijenleri (VCA), Erken (Early) antijenler, Nükleer antijen (EBNA 1-6), Lenfosit-determinant membran antijenleri (LYDMA), Latent membran proteinleri (LMP- 1, LMP-2) dir. Tablo 6-4. EBV enfeksiyonun serolojik tanısında kullanılan testlerin yorumlanması İmmün olmayan Yeni enfeksiyon Yakında geçirilmiş enfeksiyon Eski enfeksiyon VCA-IgM - + -/+ - - VCA-IgG - +/ EA-IgG - +/ /- EBNA - - +/- + + Monospot test /+ Reaktivasyon Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. Rose Bengal testini uygulayarak değerlendiriniz. 2. Membrana bağlı immün test yaparak değerlendiriniz. 3. Size gösterilen testleri inceleyerek not ediniz. Tarih Laboratuvar görevlisinin imzası 49

51 Kaynaklar 1. US D (2006). Serolojik Tanı Yöntemleri. Hacettepe Universitesi Yayınları, Ankara; Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller AM (2010). Vibrio ve Aeromonas. Tıbbi Mikrobiyoloji. 6th ed. Çeviren: Akgün Y, Atlas Tıp Kitapçılık Ltd Şti., Ankara, Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller AM (2010). Kampilobakterler ve Helikobakterler. Tıbbi Mikrobiyoloji. 6 th ed. Çeviren: Aydın F, Atlas Tıp Kitapçılık Ltd Şti., Ankara,

52 Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-7 Gr (+) Koklar A- Stafilokok Türlerinin Laboratuvar Tanısı Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Stafilokokların genel özelliklerinin öğrenilmesi Stafilokokların laboratuvar tanısında kullanılan testlerin öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Stafilokokların genel özelliklerini açıklar. İnsanlarda en sık hastalık etkeni olan Stafilokok türlerini sıralar. Stafilokok türlerinin hangi hastalıklara neden olduğunu sıralar. Stafilokokların Laboratuvar tanısında kullanılan testleri sıralar. Staphylococcus aureus un diğer stafilokoklardan ayrılmasında kullanılan özellikleri sıralar. Katalaz testinin kullanım amacını açıklar. Koagülaz testinin kullanım amacını açıklar. Katalaz testinin uygulama basamaklarını sıralar. Koagülaz testinin uygulama basamaklarını sıralar. Stafilokok kolonilerinin özeliklerini değerlendirir. Katalaz testini uygular. Katalaz testini değerlendirir. Koagülaz testini uygular. Koagülaz testini değerlendirir. Kontamine deney malzemelerini tıbbi atık kabına atar. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Gerekli Malzemeler Işık mikroskobu Lam Öze %3 H 2 O 2 (Hidrojen peroksit) 1/5 oranında sulandırılmış insan veya tavşan plazması Staphylococcus aureus, Koagülaz negatif stafilokok ve streptokok üremiş kültür plakları Stafilokoklardan hazırlanmış Gram boyalı preperatlar Eldiven Tıbbi atık kabı 51

53 Giriş Stafilokoklar Gram pozitif, kok morfolojisinde, µm çapında, hareketsiz, fakültatif anaerop, yüksek tuz konsantrasyonu (örneğin %10 sodyum klorid) içeren ortamlarda, C de üreyebilirler. İnsanlarda bulunan 40 tür ve 24 alt tür tanımlanmıştır. İnsanlarda en sık hastalık etkeni olan türler: 1. Staphylococcus aureus 2. Staphylococcus epidermidis 3. Staphylococcus saprophyticus 4. Staphylococcus lugdunensis 5. Staphylococcus haemolyticus Metisilin dirençli S. aureus (MRSA) hastanede yatan hastalarda ciddi enfeksiyonlara ve son yıllarda sağlıklı insanlarda hastane dışında da enfeksiyonlara neden olmaya başlayan en tehlikeli Stafilokok türüdür. İnsanlarda en sık hastalık etkeni olan stafilokok türlerinin yaptıkları hastalıklar Tablo 4 de gösterilmiştir. Tablo 7-1. Stafilokok türlerinin yaptığı hastalıklar Stafilokok türü Yaptığı hastalıklar Besin zehirlenmesi, haşlanmış deri sendromu, toksik şok sendromu, karbonkül, folikülit, impetigo, yara enfeksiyonu, S. aureus bakteriyemi, endokardit, pnömoni, ampiyem, osteomyelit, septik artrit Bakteriyemi, endokardit, cerrahi yara enfeksiyonu, idrar yolu S. epidermidis enfeksiyonu, kateter, şant, prostatik alet ve peritoneal diyaliz fırsatçı enfeksiyonları S. saprophyticus İdrar yolu enfeksiyonu, fırsatçı enfeksiyonlar Endokardit, artrit, bakteriyemi, fırsatçı enfeksiyonlar, idrar S. lugdunensis yolu enfeksiyonları Bakteriyemi, endokardit, kemik ve eklem enfeksiyonları, S. haemolyticus idrar yolu enfeksiyonları, yara enfeksiyonları, fırsatçı enfeksiyonlar Stafilokokların Laboratuvar Tanısı Mikroskopi: Stafilokoklar katı besiyerinde üretildiklerinde üzüm salkımı şeklinde kümeler yapan fakat klinik örneklerde tek tek veya küçük gruplarlar halinde görülen gram pozitif koklardır. 52

54 Kültür: Stafilokoklar aerobik ve anaerobik koşullarda, seçici olmayan besiyerlerinde büyük, beyaz - altın sarısı pigmentli, S tipi koloniler yaparak 24 saat içinde hızla üremektedir. Nükleik asit bazlı testler: Stafikokların hızlı üremesi nedeniyle bu testler sadece tarama kültürlerinde (hastalarda dirençli bakteriler açısından burun taşıyıcılığı taraması) oksasilin direncini belirlemek için kullanılmaktadır. İdentifikasyon: S.aureus un tanımlanmasında nispeten basit biyokimyasal bir test olan koagülaz testi sıklıkla kullanılmaktadır. Koagülaz negatif stafilokokların tanımlanması daha karmaşık olup, ticari tanımlama sistemleri ya da nükleik asit sekanslama teknikleri ile türe özgül genlerin gösterilmesini gerektirmektedir. Katalaz Testi: Hidrojen peroksitin (H 2 O 2 ) katalaz enzimi tarafından su ve oksijene parçalanması esasına dayanır. Stafilokokların streptokoklardan ayrılması amacı ile kullanılır. Bu test için bir lam üzerine birkaç damla %3 lük H 2 O 2 [Hidrojen peroksit (%30) 1 ml, distile su 9 ml] damlatılır. Stafilokok şüpheli kolonilerden yada bakteri süspansiyonundan bir miktar alınarak %3 lük H 2 O 2 ile steril bir öze yardımı ile karıştırılır. Bu esnada hava kabarcıklarının oluşması testin pozitifliği şeklinde yorumlanır. Pozitif kontrol: Stafilokoklar, Negatif kontrol: Streptokoklar Koagülaz Testi: S. aureus un ayrımında kullanılan bir testtir. Koagülaz sayesinde bakteri fibrin bir zırhla kaplanarak fagositozdan korunur. Serumun bakterisid etkinliğini de engeller. Koagülaz deneyi lamda veya tüpte uygulanabilir. Lam deneyinde temiz bir lam üzerindeki bir damla serum fizyolojik içinde katı besiyerinden bol miktarda stafilokok alınarak süt görüntüsünde bir çözelti oluşturulur. Bu süspansiyon üzerine bir damla 1/5 oranında sulandırılmış plazma damlatılır saniyede pıhtı kümelerinin oluşması olumlu sonuçtur. Tüp deneyi için 1/5 oranında sulandırılmış sitratlı insan veya tavşan plazması kullanılır. 1 ml sulandırılmış plazma üzerine, 1 ml taze buyyon kültürü veya katı besiyerinden alınan koloniler konur. Kontrol olarak plazma + steril buyyon kullanılır. 37 C de bekletilen tüplerde 1., 3., 6. ve 24. saatlerde pıhtılaşma olup olmadığına bakılır. Pozitif kontrol: S. aureus Negatif kontrol: S. epidermidis Şekil 7-1. Solda katalaz negatif, sağda katalaz pozitif test görünümü 53 Şekil 7-2. Solda koagülaz negatif, sağda koagülaz pozitif test görünümü

55 Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. Laboratuvara hazır olarak getirilen preperatları inceleyerek gördüklerinizi çiziniz. 2. Laboratuvara getirilen kanlı agar yüzeyindeki bakteri kolonilerinden katalaz testi yaparak sonuçları değerlendiriniz. Gördüklerinizi çiziniz. Bakteri:....Bakteri: Sonuç: Pozitif Sonuç: Negatif 3. Laboratuvara getirilen kanlı agar yüzeyindeki bakteri kolonilerinden koagülaz testi yaparak sonuçları değerlendiriniz. Gördüklerinizi çiziniz. Bakteri:.Bakteri:.. Sonuç: Pozitif Sonuç: Negatif Tarih Laboratuvar görevlisinin imzası Kaynaklar 1. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA (2010). Medical Microbiology. Tıbbi Mikrobiyoloji. 6th ed., Atlas Kitapçılık Tic. Ltd. Şti., Ankara, Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı (2003). Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Tünger A., Çavuşoğlu C., Korkmaz M.: Mikrobiyoloji (2005). Dördüncü baskı. Asya Tıp Kitabevi, İzmir,

56 B- Streptokoklar ve Enterokok Türlerinin Laboratuvar Tanısı Dersin Amaçları Streptokokların genel özelliklerinin öğrenilmesi Streptokok türlerinin ayırt edilmesinde kullanılan testlerin öğrenilmesi Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Bu dersi alan öğrenciler; Streptokok türlerinin hemoliz yapma özelliklerini sayar. Alfa, beta ve gama hemoliz yapan streptokoklara örnek verir. Streptokoklarının morfolojik özelliklerini söyler. Streptokok türlerini diğer gram pozitif koklardan ayırt etmede kullanılan özellikleri sayar. Basitrasin ve optokin duyarlılık testlerinin ne amaçla yapıldığını söyler. PYR ve CAMP testlerinin amacını söyler. Safrada erime testinin amacını söyler. Safra eskülin agarda üreme testinin amacını söyler. Streptokok kolonilerinden Gram boyalı preparat hazırlayabilir. Basitrasin ve optokin duyarlılık testlerini yapabilir. PYR ve CAMP testlerini yapabilir. Safrada erime testini yapabilir. Safra eskülin agarda üreme testini yapabilir. Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Gram boyama yöntemi ile hazırlanmış preparatda gram pozitif kok zinciri ya da diplokok morfolojisindeki bakterileri tanımlar. Kanlı agarda üremiş olan Streptokok kolonilerinin hemoliz türünü değerlendirir. Basitrasin ve optokin duyarlılık testlerini değerlendirir. PYR ve CAMP testlerini değerlendirir. Safrada erim testini değerlendirir. Safra eskülin agarda üreme testini değerlendirir. Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Gerekli Malzemeler Sıvı sabun Kağıt havlu Alkol bazlı solüsyon Atık kapları %70 lik etanol Çamaşır suyu 55

57 Eldiven Öze Lam Mikroskop Gram boyama seti %3 lük hidrojen peroksit %5 kanlı agar Safra eskülin agar 0.04 U Basitrasin diski 1.25/23.75 µg trimetoprim-sülfametoksazol (SXT) diski 5 µg optokin diski Ticari olarak hazırlanmış Pyrolidonyl-beta naphtilamid (PYR) emdirilmiş kağıt şeritler ve ayıracı %10 luk sodyum deoksikolat Kanlı agara pasajlanmış S. pyogenes, S. agalactia, S.pneumonia, S. viridans, E. feacalis, S. bovis izolatlarının taze kültürleri Giriş Streptopcoccus cinsine ait bakteri türleri katalaz negatif özellik gösterirler ve sıvı besiyerinde zincirler oluşturan gram pozitif koklardır. Sınıflandırılmasında serolojik özellikleri (Lancefield gruplaması: A dan V ye kadar), hemoliz özellikleri (alfa, beta, gama hemoliz) ve biyokimyasal özellikleri kullanılmaktadır. Klinik olgularda en sık karşılaşılan Streptokok türleri ve sınıflandırılma özellikleri Tablo 5 te verilmiştir. Tablo 7-2. Sık karşılaşılan Streptokok türleri ve sınıflandırılması Filogenetik Grup Tür Lancefield Grup Hemoliz Özellikleri S. pyogenes A Beta Pyojenik Streptokoklar S. agalactiae B Beta S. equisimilis C Beta S. pneumoniae O Alfa Mitis grup S. mitis S. oralis O Tanımlanmadı Alfa Alfa S. sanguis H Alfa 56

58 S. gordonii H Alfa Anginosus grup S. anginosus S. intermedius G, F (ve A) Alfa Alfa Salivarius grup S. salivarius K Gama Bovis grup S. bovis D Alfa veya gama Mutans grup S. mutans S. sobrinus Belirlenmedi Gama Gama Streptokokların Laboratuvar Tanısı I. Streptokokların Fenotipik Olarak Tanımlanması a. Makroskopik Değerlendirme ve Koloni Görüntüsü: Streptokoklar çoğunlukla gri-beyaz renkte, ıslak ya da parlak özellikte küçük koloniler oluşturmaktadırlar. Kanlı agardaki kolonileri alfa, beta veya non (gama) hemolitik olabilirler. Resim 7-3. Hemoliz çeşitleri 57

59 b. Mikroskobik Değerlendirme ve Gram Boyama: Gram boyalı preparatların mikroskobik incelemesinde Streptokoklar ve Enterokoklar gram pozitif çiftler veya zincir şeklinde koklar; S. pneumoniae ise çoğunlukla Gram pozitif uzamış görünümlü diplokoklar şeklindedir. Şekil 7-4. Gram pozitif kok zincirleri ve Gram pozitif diplokoklar c. Lam Metoduyla Katalaz Testi: Test edilecek bakterinin katalaz enzimi olup olmadığını araştırmaya yönelik bir test olup, sıklıkla gram pozitif koklardan Stafilokok türlerinin Streptokok türlerinden fenotipik olarak ayırt edilmesinde kullanılmaktadır. Temiz bir lam üzerine test edilecek bakteri kolonisi aktarılır ve üzerine bir miktar %3 lük H 2 O 2 damlatılır. Gaz kabarcığı oluşumu gözlenir. Kabarcık oluşumu testin pozitifliği yani bakterinin katalaz enzimi varlığı lehinde yorumlanır. II. Beta Hemolitik Streptokokların Fenotipik Olarak Tanımlanması: a. Pirolidonil-beta-naftilamid (PYR) Hidrolizi Testi: S. pyogenes in diğer beta hemolitik Streptokoklardan ayırt edilmesinde kullanılan bu test, bakteride PYR enzimi varlığının araştırılmasını temel almaktadır. L-pirolidonil-betanaftilamid PYR enzimi aracılığıyla Beta-naftilamidin ürününe hidroliz olur ve ilgili reaktif eklendiğinde kırmızı renk alır. S. pyogenes dışında Enterokokların, bazı hayvan kaynaklı Streptokok türlerinin ve diğer bazı bakteri türlerinin de PYR testinin pozitif olduğu unutulmamalıdır. 58

60 Şekil 7-5. Pirolidonil-beta-naftilamid (PYR) hidrolizi testinin yapılışı b. Basitrasin Duyarlılık Testi: S. pyogenes, diğer A grubu Streptokoklar ve diğer beta hemolitik Streptokoklardan farklı olarak basitrasine duyarlılık gösterir. S. pyogenes olabileceğinden şüphelenilen bakteriden 3-4 koloni alınarak kanlı agara pasajlanır ve 0.04 U Basitrasin diski plağa yerleştirilir. 35 o C de %5 CO 2 li ortamda bir gece inkübe edilir. Diskin etrafında bakteri üremesinin inhibe olması, test edilen bakterinin basitrasine duyarlı olduğunu düşündürür. Şekil 7-6. Basitrasin duyarlılık testinin yapılışı c. Christie Atkins Munch Peterson (CAMP) Testi: S. agalactia nın diğer beta hemolitik Streptokolardan ayırt edilmesi için yapılan bu test S. aureus un yaptığı hemolizin S. agalactia tarafından artırılması esasına dayanmaktadır (sinerjik lizis). Test edilecek suş ve S. aureus suşu kanlı agara 90 o açıyla çizgi olarak ekilir. 36±1 o C de bir gece inkübe edilir. S. aureus beta hemolizini ve CAMP faktörü diffüzyon bölgesinde üçgen şeklinde artmış hemoliz görülmesi CAMP testinin pozitifliği şeklinde yorumlanır. 59

61 Şekil 7-7 Christie Atkins Munch Peterson (CAMP) testinin yapılışı III. Streptococcus pneumoniae ve Viridans Grubu Streptokokların Fenotipik Olarak Tanımlanması: a. Optokin Duyarlılık Testi: S. pneumoniae suşunun optokine duyarlı olduğu bilgisini temel alan bu test S. pneumoniae nın diğer alfa hemolitik Streptokoklardan ayırt edilmesinde kullanılır. Test edilecek organizmanın kültüründen birkaç koloni kanlı agara pasajlanır ve 5 µg optokin içeren disk üzerine yerleştirilir. 35 o C de %5 CO 2 li ortamda bir gece inkübe edilir. Diskin etrafında bakteri üremesinin inhibe olması, test edilen bakterinin optokine duyarlı olduğunu düşündürür. Optokine duyarlı S. mitis ve optokine dirençli S. pneumoniae suşlarının da olabileceği unutulmamalıdır. Şekil 7-8. Optokin duyarlılık testinin yapılışı 60

62 b. Tüp Metoduyla Safrada Erime Testi: S. pneumoniae nın muhtemel tanısında kullanılmaktadır. Sodyum deoksikolat bir tür safra tuzu olup hücre duvarına etki ederek hücrenin erimesine neden olmaktadır. İki adet tüp içerisinde fizyolojik tuzlu suda (ph: 7.0) test edilecek bakteriden yoğun bakteri süspansiyonu hazırlanır. Tüplerden birine %10 luk sodyum deoksikolat solusyonu damlatılır diğerine (kontrol olarak kullanılacaktır) ise fizyolojik tuzlu su damlatılır. Tüpler 35 o C de 3 saatte bir kontrol edilerek inkübe edilir. %10 luk deoksikolat damlatılmış olan tüpdeki bakteri bulanıklığı kaybolmuş ve viskositesi artmış ise test edilen bakterinin safrada erime özelliği olduğu şeklinde yorumlanır. Şekil 7-9. Tüp metodu ile safrada erime deneyinin yapılışı IV. Enterokoklar ve D Grubu Streptokokların Fenotipik Olarak Tanımlanması: a. Safra Eskülin Agarda Üreme Testi: Safra eskülin agar, Enterococcus ve grup D Streptokoklar (Streptococcus bovis) türlerini diğer Streptokoklardan ayırt etmek amacıyla kullanılan seçici ve ayırıcı bir besiyeri türüdür. Besi yerinde mevcut olan safra Enterococcus ve grup D Streptokoklar dışındaki streptokokları ve diğer gram pozitif kokların üremesini baskılamaktadır. Besiyerinde mevcut olan eskülin ise söz konusu mikroorganizma tarafından hidrolize edilerek eskületin ve dekstroza ayrıştırılır. Eskületin yine besiyerinde kullanılan demir tuzu ile etkileşerek siyahkahve renk oluşumuna neden olmaktadır. Şüphelenilen koloniler safra eskülin agara pasajlanıp uygun koşullarda inkübe edildikten sonra siyah-kahve renk oluşturan kolonilerin gözlenmesi bakterinin safralı ortamda üreyebildiği, eskülini hidroliz etme yeteneği olduğu ve Enterococcus ve Streptococcus bovis olabileceği şeklinde yorumlanır. 61

63 Şekil Safra eskülin agarda üreme testinin yapılışı Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. Laboratuvara hazır olarak getirilen preperatları inceleyerek gördüklerinizi çiziniz. 2. Laboratuvara getirilen kanlı agar yüzeyindeki bakteri kolonilerini renk ve hemoliz oluşumu yönünden inceleyiniz. Optokin, basitrasin ve CAMP deneylerini inceleyerek gördüklerinizi çiziniz. 3. Laboratuvara getirilen kanlı agar yüzeyindeki bakteri kolonilerinden katalaz testi yaparak sonuçları değerlendiriniz. Gördüklerinizi çiziniz. 4. Üreme görülen plaklardan Gram boyama yaparak sonucu değerlendiriniz. Gördüklerinizi çiziniz. 62

64 Tarih Laboratuvar görevlisinin imzası Gram pozitif kok Üzüm salkımı şeklinde gram pozitif koklar Katalaz pozitif Zincir şeklinde koklar Katalaz negatif Stafilokok? Streptokok? Beta hemoliz Alfa hemoliz Gama hemoliz Basitrasin Duyarlılık Testi Basitrasin duyarlı ve SXT dirençli PYR (+) Basitrasin dirençli ve SXT duyarlı CAMP (+) Gram pozitif diplokok Optokin duyarlı Safrada erime (+) Optokin diski Optokin dirençli Safra eskülin agara ekim S.pyogenes (A grubu Beta Hemolitik Streptokok) S.agalactia (B grubu Beta Hemolitik S.pneumonia Üreme ve siyah renk yok Üreme ve siyah renk var S. viridans? %6.5 NaCl de üreme yok PYR (-) %6.5 NaCl de üreme var PYR (+) 63 Non-enterokok D grubu Streptokok Enterococcus spp

65 Kaynaklar 1. Killian M (2002). Streptococcus and Enterococcus, (Ed: Greenwood D, Slack RBC and Peutherer FF). Medical Microbiology 16th ed. Churchill Livingstore, Philadelphia. p Spellerberg B, Brandt,C. (2007). Streptococcus. Manual of Clinical Microbiology (Ed: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry LM, Pfaller A). 9th ed. Çeviren: Özenci H. Washington, D.C.American Society for Microbiology, Kimberle CC, Tsai-Ling L (2007). Ayraçlar, Boyalar ve Besiyerleri: Bakteriyoloji. Manual of clinical microbiology (Ed: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry LM, Pfaller A). 9th ed. Çeviren: Başustaoğlu A, Güçlü AÜ). Washington, D.C.American Society for Microbiology, 64

66 Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-8 Gram (-) Koklar A- Moraxella ve Haemophilus Türlerinin Laboratuvar Tanısı Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Moraxella ve Haemophilus ların genel özeliklerinin öğrenilmesi Moraxella ve Haemophilus ların laboratuvar tanısının öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Moraxella ve Haemophilus ların genel özelliklerini açıklar. Moraxella ve Haemophilus ların kültür özelliklerini açıklar. Moraxella ve Haemophilus cinsi bakterileri diğer bakterilerden ayıran özellikleri sayar. Moraxella ve Haemophilus ların boyanmış preparatlarını mikroskobik olarak değerlendirir. X ve V faktörlerine olan gereksinimlerine göre Haemophilus türlerini tanımlar. Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Gerekli Malzemeler Mikroskop Moraxella ve Haemophilus üremiş kültür plakları Moraxella ve Haemophilus a ait boyalı preparatlar X, V ve XV faktörlerini içeren diskler Süt anne fenomeni ile Haemophilus kolonileri olan kültür plakları DNA içeren besiyeri, 1 N HCl Lam Fizyolojik tuzlu su BOS santrifüj çökeltisi %1 lik metilen mavisi boyası Moraxella türleri Moraxella lar kısa basil, kokobasil ya da Moraxella catarrhalis te olduğu gibi diplokok şeklinde, gram negatif, aerobik ve hareketsiz bakterilerdir. Bu genus içindeki en önemli patojen tür M. catarrhalis tir. Üst solunum yolu florasında bulunmakla birlikte akut bronşit, sinüzit, menenjit, endokardit, konjuktivit, otitis media ve pnömoni etkeni olabilirler. 65

67 Kanlı ve çikolatamsı agarda üreyebilirler. Gri-beyaz renkte, konveks, hemoliz yapmayan, mat S tipi koloni oluştururlar. Agar yüzeyinde buz hokeyi topu gibi kaymaları tipiktir. Oksidaz ve katalaz pozitiftirler. Nitrat redüktaz enzimi ile nitratı nitrite indirgerler. Şekerleri oksidatif ya da fermantatif yolla kullanmayan (asakkarolitik), DNaz enzimi pozitif olan bakterilerdir. Tanımlanması için karbonhidrat fermentasyon testleri de kullanılır. Çoğu β-laktamaz üretir ve penisilinlere dirençlidir. Haemophilus türleri Gram negatif, küçük, kokobasil görünümünde, hastalık materyalinde bazen lökosit içinde, kültürde ikişerli, çoklu gruplar veya zincirler oluşturan, hareketsiz, sporsuz bakterilerdir. Taze izolatlarda ince bir kapsül bulundururlar. Pasajlarda kapsül kaybolur. Sulu fuksin ile 2-10 dakikada iyi boyanırlar. Basit besiyerinde üremezler. Üremesi için besiyerlerine üreme stimüle edici faktörlerden X faktörü (protoporphyrin IX) ve V faktöründen (nikotinamid adenin dinükleotid, NAD) bir veya her ikisinin eklenmesine ihtiyaç duyarlar. Su damlası şeklinde koloniler oluştururlar. H. influenzae: Çocuklarda menenjit, pnömoni, bronkopnömoni, laringotrakeit, nazofarenjit gibi hastalıklar oluşturabilirler. Bu bakteriler kapsüllerinin yapı değişikliklerine bağlı olarak a,b,c,d,e,f diye adlandırılan 6 serotipe ayrılırlar. Bunlardan b serotipi invaziv olup Haemophilus enfeksiyonlarının en sık nedenidir. H. influenzae gibi kapsüllü bakterinin BOS'ta varlığından şüphelenilirse kapsül şişme reaksiyonu yapılarak bu bakteriler saptanabilir. Tablo 8-1. X ve V faktörü ihtiyacına göre bazı Haemophilus türleri Tür X V H. influenzae + + H. aegypticus + + H. haemolyticus + + H. parainfluenzae - + H. parasuis - + H. parahaemolyticus - + H. ducreyi + - H. aegypticus: Bu bakteri halk arasında pembe göz olarak bilinen konjuktivit etkenidir. H. ducrei: Yumuşak şankr etkenidir. 1. X ve V Faktörlerine Olan Gereksinimin Saptanması: Haemophilus türü bakteriler triptik soy agar ya da kalp infüzyon agarı plak besiyerlerine bol miktarda ekilir. Besiyeri kurutulur. 66

68 Daha sonra X, V ve XV faktörlerini içeren üç disk, aralarında en az 20 mm olacak şekilde besiyerinin üzerine bırakılır. Besiyeri 37 C'de, bir gece inkübe edilir. H. influenzae sadece XV faktörü içeren diskin etrafında ürer. 2. Süt anne fenomeni (satellit üreme): Koyun ya da tavşan kanlı agara incelenecek olan Haemophylus türü bakteri yaygın olarak ekilir. Aynı besiyerine (çizgi ekimi şeklinde ya da belirli bölgelere) S. aureus ekilir. H. influenzae S.aureus kolonileri etrafında daha iyi üreme gösterir. Şekil 8-1. Süt anne fenomeni (satellit üreme) 3. DNAse (deoksiribonuclease) deneyi: Deoksiribonükleik asiti (DNA) parçalama özelliği olan DNaz enzimi içeren bakteriler DNA içeren besiyerinde onu parçalayıp oligonükleotidler oluştururlar. Bu test ile Neisseria'lar ile Moraxella'ları birbirinden ayırmak mümkündür. DNA lı plak besiyerine saf kültürden çizgi ekimi yapılır. 35 C de saat bekletildikten sonra plak yüzeyine 1N hidroklorik asid (HCl) damlatılır. HCl bozulmamış DNA ile birleşerek presipite olur. Bakteri DNaz yapıyorsa ekim çizgisinin çevresinde saydam bir zon oluşur, diğer bölgeler opak görünüm alır. Besiyeri içine indikatör olarak toluidin mavisi konmuşsa DNaz olumlu bakteriler ekim çizgisi çevresinde parlak pembe bir zon oluşturur. Negatif durumda mavi renkli kalır. 4. Kapsül şişme reaksiyonu: Bu yöntem N. meningitidis, S. pneumoniae, H. influenzae, K pneumoniae gibi kapsüllü bakterilerin ön identifikasyonu amacı ile yapılmaktadır. Temiz bir lam alınır, bir yanına bir damla sulandırılmış antiserum, diğer yanına bir damla fizyolojik tuzlu su (kontrol) damlatılır. Her iki damlanın üzerine sırasıyla BOS santrifüj çökeltisi ve bir damla %1 lik metilen mavisi boyası damlatılır. Her birinin üzerine temiz lamel kapatılır. İmmersiyon objektifi veya 400 büyütme ile yapılan incelemede ortası maviye boyanmış bakterilerin etrafındaki renksiz ya da soluk mavi renkli kapsülleri, kontrole göre daha belirgin ve genişlemiş olarak görülürler. 5. ELEK testi: 10 ml agar içine 2 ml at serumu eklenir. Bir petriye dökülür ve katılaşmasına yakın besiyerinin ortasına difteri toksini emdirilmiş bir filtre kağıdı yerleştirilir. Besiyeri katılaşıp yüzeyi kuruduktan sonra test edilecek suşlar filtre kağıdına dik olacak şekilde ekilirler. Testin çalışıp çalışmadığını kontrol etmek için toksijenik olan ve olmayan iki suş; pozitif ve negatif kontrol olarak ekilir. Plaklar 35 C de saat inkübe edilir. İnkübasyon sonunda pozitif kontrol ve toksin yapan suşların ekim çizgisi ile anti toksin bulunan filtre 67

69 kağıdı arasında 45 derece açı yapacak şekilde presipitasyon çizgileri gözlenir. Toksin yapmayan suşlarda presipitasyon gözlenmez. Şekil 8-2. Elek immundifüzyon testi ( dan alınmıştır). Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. Difteroid bakterileri Gram boyama yöntemi ile boyayarak inceleyiniz ve çiziniz. 2. DNAse testi yaparak testin sonucunu not ediniz. 3. X ve V faktörlerine olan gereksinimin saptanması ile ilgili testleri inceleyerek çiziniz. 4. Süt anne fenomenini (satellit üreme) inceleyerek çiziniz. 68

70 Tarih Laboratuvar görevlisinin imzası Kaynaklar 1. Bilgehan H (2009). Klinik Mikrobiyolojik Tanı. Beşinci Baskı. Barış Yayınları Fakülteler Kitabevi, İzmir, Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA (2010). Tıbbi Mikrobiyoloji. Altıncı Baskı. Çev. Edit. Başustaoğlu AC, Atlas Kitapçılık, Ankara, Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA (2009). Klinik Mikrobiyoloji Manual of Clinical Mikrobiology. Dokuzuncu baskı. Çev. Edit. Başustaoğlu AC, Atlas Kitapçılık, Ankara, cilt 1, / Editörler: Günalp A, Yılmaz YA, Pınar A (2003). Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı. Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Ankara,

71 B- Neisseria Türlerinin Laboratuvar Tanısı Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Neisseria ların genel özelliklerinin öğrenilmesi Neisseria ların laboratuvar tanısında kullanılan yöntemlerin öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Neisseria ların genel özelliklerini sıralar. İnsanlarda hastalık etkeni olan Neisseria türlerini sayar. Oksidaz testinin yapılış basamaklarını sıralar. Oksidaz testinin yapılış amacını açıklar. Gram boyanma yaparak preperatta Neisseria türü bakteri varlığını değerlendirir. Oksidaz testini uygulayarak sonucunu değerlendirir. Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Gerekli Malzemeler Sıvı sabun Kağıt havlu Eldiven Neisseria gonorrhaoe üremiş kültür plakları Neisseria gonorrhoae içeren örneklerden hazırlanmış preparatlar Oksidaz ayıracı Giriş Neisseria türleri aerobik, hareketsiz, sporsuz, gram negatif bakterilerdir. Genellikle birbirine komşu kenarları düzleşmiş, kahve çekirdeği şeklinde çiftler (diplokoklar) halinde görünür. İnsanlardan en sık izole edilen Neisseria türleri N. gonorhoeae, N. menengitidis, N. lactamica, N. sicca, N. subflava, N. flavescens, N. mucosa, N. cinerae, N. denitrificans, N. elongata, N.canis tir. Bu ailede iki tür insanlarda patojendir. N. gonorhoea ve N. menengititis. N. gonorrhoeae seksüel geçişli bir hastalık olan gonore etkenidir. Bu infeksiyon genellikle erkekler ve kadınlarda genital mukozayı tutmaktadır fakat kolumnar epitelin bulunduğu herhangi bir vücut bölgesini de etkileyebilir. 70

72 N. meningitidis sağlıklı bireylerde daha çok asemptomatik olarak taşınır. Duyarlı şahıslarda kan akımına karışarak bakteriyemiye, kan beyin bariyerini aşarak menenjit tablosuna neden olabilir. Hastalardan örnek alınması Neisseria Türlerinin Laboratuvar Tanısı Gonore tanısı için erkeklerde üretral akıntı örneği alınır. Belirgin bir pürülan akıntı yoksa pamuklu eküvyon anterior üretradan 2-3 cm içeriye sokulup yavaşça çevrilerek örnek alınır. Kadınlarda ise servikal sürüntü örnekleri, üretral ve vajinal örneklere tercih edilir. Menenjit tanısı için beyin omirilik sıvısı (BOS) alınmalıdır. Ayrıca kan, plevral sıvı, peteşi aspirat sıvısından da inceleme yapılabilir. BOS 1 ml den fazlaysa 1500 rpm de 15 dak santrifüj edilerek üstteki sıvı atılır dipteki çökelti tanı için kullanılır. Alınan örneklerden direk mikroskobik inceleme için preparat hazırlanır ve kültür yapılır. Direk Mikroskobik İnceme Örnekler Gram boyama yöntemi ile boyanarak incelenir. Boyanan preparat immersiyon yağı damlatılarak x100 büyütme ile incelenir. Nötrofiller içinde ve dışında gram negatif diplokokların varlığı gonore için oldukça karakteristiktir. Kültür Şekil 8-3. Hasta örneğinde gram negatif diplokoklar Şekil 8-4. Kültürde üreyen Neisseria lardan yapılan Gram boyama preparatı Alınan örnekler Neisseria türlerinin sıcaklık değişimlerine çok duyarlı olmasından dolayı laboratuvara hızlı bir şekilde ulaştırılmalıdır. En başarılı izolasyon hasta başı ekimlerde görülmektedir. Üretral ve servikal örnekler çukolata agara ekilir. Genital bölge gibi floralı bölgelerden alınan örnekler için selektif besiyerleri tercih edilir. Thayer-Martin, Modifiye Thayer Martin, Martin Lewis, New York City veya GC-LECT besiyerleri Neisseria türleri için kullanılan selektif besiyerleridir. Bu besiyerleri flora elemanlarını baskılamak için çeşitli antibakteriyaller ve/veya antifungaller içerir. Tüm besiyerleri %3-5 CO 2 li ortamda 35 C de 72 saat inkübe edilir saat inkübasyondan sonra küçük şeffaf, konveks, düzgün koloniler oluşturur. Hemoliz ve pigment yapmaz. 71

73 Şekil 8-5. Kültürde üreyen Neisseria kolonileri Oksidaz Testi Neisseria ların ayırıcı tanısında kullanılır. Sitokrom oksidaz oksidatif fosforilasyonla solunum yapan bakterilerin kullandığı bir enzimdir. Oksidaz testi için oksidaz ayıracı (%1 lik dimetil para fenilen diamin dihidroklorid ya da tetrametil para fenilendiamin dihidroklorid) kullanılır. Bu solüsyondan kurutma kağıdına birkaç damla damlatılıp üzerine öze ile birkaç koloni sürülür. 10 saniye içinde koyu mor renk görülürse test pozitiftir. Renk değişmiyorsa oksidaz testi negatiftir. Bu testte E. coli standart suşu negatif, N. gonorrhoeae standart suşu pozitif olarak kullanılır. Şekil 8-6. Oksidaz testi (Sağdaki pozitif, soldaki negatif) Karbonhidrat kullanım testi Karbonhidratların kullanımı patojenik Neisseria ların diğer saprofitik türlerden ayrılmasında kullanılır. Belirli karbonhidratların kullanımı asit üretimi yoluyla indikatörün renginin değişmesiyle gösterilir. Neisserialar karbonhidratları genellikle oksidatif olarak kullanır ve asit oluşturur. 72

74 Tablo 8-2. Bazı Neisseria türleri ve karbonhidrat kullanım testi sonuçları Tür Glukoz Maltoz Laktoz Sükroz N. gonorrhoeae N. meningitidis N. lactamica N. cinerea N. sicca N. flavescens Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. Neisseria türü bakteri üremiş kültür plaklarından Gram boyama yaparak inceleyiniz, gördüklerinizi çiziniz. 2. Hasta örneklerinden hazırlanan preperatları inceleyerek gördüklerinizi çiziniz. 3. Neisseria türü bakteri üremiş kültür plaklarından ve Escherichia coli üremiş kültür plaklarından oksidaz testi yaparak değerlendiriniz. Tarih Laboratuvar Görevlisinin İmzası 73

75 Kaynaklar 1. Mahon CR, Lehman DC, Manuselis G, eds. (2011). Textbook of Diagnostic Microbiology. 4th ed. W.B. Saunders Company, Maryland Heights (MO), p

76 Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-9 A-Nonfermentatif Gram Negatif Bakterilerin Laboratuvar Tanısı Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Nonfermentatif gram negatif bakterilerin genel özelliklerinin ve laboratuvar tanısının öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Nonfermentatif gram negatif basillerin isimlerini sayar. Nonfermentatif gram negatif basillerin özelliklerini sayar. Tanı için incelenebilecek hasta örneklerini sayar. Oksidasyon-fermentasyon testinin basamaklarını anlatır. Sitokrom oksidaz aktivitesi testinin basamaklarını sayar. İndol testinin basamaklarını sayar. Nonfermentatif gram negatif basillerin mikroskobik incelemesini yapar. Oksidasyon-fermentasyon testini yapar ve sonucunu yorumlar. Sitokrom oksidaz aktivitesi testini uygular ve sonucunu değerlendirir. Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Gerekli Malzemeler Mikroskop Lam Öze Bek alevi Gram boya seti Nonfermentatif basiller ekilmiş Kanlı ve EMB agar besiyeri plakları Oksidasyon-fermentasyon testi besiyerleri Hareket besiyeri %1 lik tetrametil p-fenilen diamin dihidroklorid çözeltisi Giriş Nonfermentatif bakteriler karbonhidratları fermente edemeyen sadece oksidatif yolla kullanabilen mikroorganizmalardır. Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrphomonas, Burkholderia, Alcaligenes, Aeromonas, Flavobacterium gibi cinsler nonfermentatif gram negatif basiller grubunu oluşturmaktadır. Tanı için İncelenebilecek örnekler İnceleme maddesi hastalığa göre değişmek üzere irin, yara ve yanık sürüntüleri, idrar, balgam gibi örnekler olabileceği gibi BOS, torasentez sıvısı, parasentez sıvısı gibi steril vücüt sıvıları da olabilir. 75

77 Sık Karşılaşılan Nonfermentatif Gram Negatif Basillerin Mikrobiyolojik Tanımlama Testleri 1. Oksidasyon-Fermentasyon Testi Bakterilerin glikozu hangi yolla parçaladıklarını gösterir. Fermentasyon yolunu kullananlar anaerob ortamda, oksidasyon yolunu kullananlar ise aerob ortamda asit üretecekler ve ayıraç olarak bulunan bromtimol mavisinin yeşil rengini sarıya dönüştüreceklerdir. Testin yapılışı: Testi uygulamak için %0.02 pepton ve %1 karbonhidrat içeren Oksidasyon- Fermentasyon (O-F) Besiyeri kullanılır. İncelenecek koloniler iki O-F besiyeri tüpüne iğne öze ile batırma şeklinde ekilir. Tüplerden birinin kenarından steril parafin yağı yavaşça sızdırılarak havayla teması kesilir. Ekimler 37 C de en fazla 4 gün takip edilip asit ortam oluşması gözlenir. Parafinli tüpün rengi sarıya dönmüşse bakteri üremiş ve fermentasyon ile ortamda asit oluşturmuştur; parafinsiz tüpün rengi sarıya dönmüşse bakteri oksidasyon yolu ile glikozu parçalamış ve ortamı asidik hale getirmiştir. Kontrol ekimleri: E. coli fermentatif, P. aeruginosa oksidatif, Moraxella asakkarolitik". Testin değerlendirilmesi: 3 durum gözlenebilir: Kapalı tüp Yeşil Üstü açık tüp Sarı Kapalı tüp Sarı Üstü açık tüp Sarı Kapalı tüp Yeşil Üstü açık tüp Yeşil Aerob ve Oksidatif Fakültatif anaerob ve Fermentatif Nonsakkarolitik Şekil 9-1. Oksidasyon fermentasyon testi ve değerlendirilmesi 76

78 2. Sitokrom oksidaz aktivitesi testi Testin yapılışı: %1 lik tetrametil p-fenilen daimin dihidroklorid çözeltisi kullanılır. Beyaz filtre kağıdına çözeltiden damlatılır. Öze ya da tahta çubuk yardımıyla incelenecek koloniden çözeltinin üzerine sürülür. Sitokrom oksidaz aktivitesi olan bakteri yaklaşık 10 saniyede koyu mavi renk oluşturur. Kontrol: E. coli oksidaz negatif, P. aeruginosa oksidaz pozitif. Şekil 9-2. Oksidaz testi pozitif Şekil 9-3. Oksidaz testi negatif 3. MacConkey Agarda Üreme Nonfermentatif gram negatif basiller MacConkey agarda üreyemezler ya da toplu iğne başı gibi küçük koloniler oluştururlar. 4. Hareket testi Şekil 9-4. MacConkey agarda üreme (lib.jiangnan.edu.cn den alınmıştır). Nonfermentatif bakterilerin çoğu hareketlidir. Hareket besiyerine iğne öze ile ekim yapılır. Bakteriler hareket besiyerinin yüzey kısmında üreyebilecekleri için testi değerlendirmek güçtür. Bu nedenle besiyerine tetrazolyum eklenmesi faydalı olacaktır. Şekil 9-5. Hareket testi 77

79 5. İndol testi Bakterilerin karbon kaynağı olarak triptofan aminoasidini kullanıp kullanmadıklarını gösterir İndol testi pozitif İndol testi negatif Şekil 9-6. İndol testi Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. Size verilen OF testini değerlendiriniz ve gördüklerinizi çiziniz. 2. Nonfermantatif gram negatif bakterileri Gram boyama yöntemi ile boyayarak mikroskopta inceleyiniz. Gördüklerinizi çiziniz. 3. Size verilen plaklardan oksidaz testi yaparak sonucu değerlendiriniz. Tarih Laboratuvar görevlisinin imzası 78

80 Kaynaklar 1. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA (2010). Tıbbi Mikrobiyoloji. Altıncı Baskı. Çev Edit. Başustaoğlu AC, Atlas Kitapçılık, Ankara, s Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA (2009). Manual of Clinical Mikrobiology Dokuzuncu baskı. Çev Edit. Başustaoğlu AC, Atlas Kitapçılık, Ankara, cilt 1, s Tünger A, Çavuşoğlu C, Korkmaz M (2005). Mikrobiyoloji. Dördüncü Baskı. Asya Tıp Kitabevi, İzmir, s Bilgehan H (2004). Klinik Mikrobiyolojik Tanı. Dördüncü Baskı. Barış Yayınları Fakülteler Kitabevi, İzmir, s Günalp A, Yılmaz YA, Pınar A (2003). Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı. Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Ankara, s

81 B- Aerop ve Fakültatif Anaerop Gram (-) Bakteriler Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Gerekli Malzemeler Aerop ve fakültatif anaerop gram negatif bakterilerinin incelenmesi Bu dersi alan öğrenciler; Aerop ve fakültatif anaerop gram negatif bakterilerinin isimlerini söyleyebilir Örneklerin nasıl incelendiğini öğrenir Aerop ve fakültatif anaerop gram negatif bakterilerinin izole edildiği örneklerin isimlerini bilir. Mikroorganizmaların tanımlanmasında hangi testi kullanacağını bilir Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Hazır preparatlar Mikroskop İmmersiyon yağı Rose Bengal Testi Tüp Pipet ve pipet ucu Brucella antijenleri Tüp aglütinasyon testi ÖRNEKLERİN İNCELENMESİ Brucella spp. ve Tanısı - Kokobasil görünümünde sporsuz, hareketsiz, organizmadan yeni ayrıldıklarında mikrokapsülleri olan bakterilerdir. - Aerop ve mikroaerofilik bakterilerdir. B. abortus %5-10 CO 2 li ortamda iyi ürerler - Özellikle serum, glikozlu besiyerinde üremeyi sever. Jelozdaki kolonileri küçük yuvarlak kabarık saydam şebnem tanesi görünümünde kolonilerdir. - B. suis en çok ve en uzun süre, B. melitensis ise az ve kısa süre H 2 S oluşturur. - Brucella ların insanlarda yaptıkları hastalıklar bruselloz adı altında toplanır. - 80

82 TANI : Brucella bakterilerinin soyutlanması: Materyal olabildiğince hızlı laboratuvara gönderilmelidir. Hemen ekilmeyecekse soğukta saklanmalıdır. Besiyerleri: Brucella buyyonu ve agarı, Çikolatamsı agar, Kanlı jeloz, Antibiyotikli glikozlu serumlu buyyon ve agar. Brucella kültürleri için genel ilkeler: 1) Kan, BOS gibi içinde az miktarda bakteri bulunan materyaller çok miktarda besiyerine ekilmelidir. 2) Tüm ekimlerin çift yapılarak birinin %5-10 CO 2 li ortamda inkübe edilmelidir. 3) İlk izolasyonda bakteriler yavaş ürediklerinden ekimler 30 gün bekletilmeden çıkarılmamalıdır. 4) Genellikle hastalığın akut döneminde ya da aktivasyon döneminde elde edilme olasılığı fazladır. Brucella ların identifikasyonu: Kuşkulu kolonilerden gram preparatı ve katı besiyerlerine ekimler yapılmalıdır saf kültürden aşağıdaki incelemeler yapılmalıdır. - H 2 S Üretimi: Bir yatık besiyerine ekim yapılır.bakterinin kaç günde H 2 S yaptığına bakılır. Brucella suis 3 gün ve daha çok B. abortus 2 gün, B. melitensis 1 gün ve daha kısa sürede yapar. - Boyalarla birlikte üreme: Amaç thionin ve fuchsin gibi boyaların çeşitli konsantrasyonlarını içeren besiyerlerinde Brucellaların üreyebilme özelliklerinin araştırılmasına dayanır. - Crystensen üre agar: Besiyerinin yüzeyine saf kültürden çizgi ekimleri yapılır. B. suis dk da, B.abortus 2 saatten sonra üreaz etkinliğini göstererek besiyerinin rengini kızartır. B. melitensis saatler sonra veya olumsuz sonuç verir. - Monospesifik antiserumlarla aglütinasyon: Lam aglütinasyonları yapılarak B.melitensis i diğer ikisinden ayırt etmek mümkündür. B. suis bakterisini B. abortus tan ayırt etmek imkansızdır. - Hayvan deneyi: Doğrudan hasta kanından 5-10 ml kobayların peritonuna enjekte edilerek yapılır. Brucella varsa hayvanlar ateş, septisemi, düşük yaparlar. 81

83 Şekil 9-7. Brucella spp. Şekil 9-8. Brucella melitensis Şekil 9-9. Brucella abortus Serolojik tanı Brucella tanısında büyük yer kaplamaktadır. (Rose Bengal ve Wright Testi, Brucella capt) Rose Bengal testi: Lam aglutinasyon testidir. Hızlı tarama amacı ile kullanılır. Antijen: Rose Bengal boyası ile özel teknik ile boyanan Brucella abortus bakterilerinin tamponlu tuzlu sudaki standart süspansiyonlarıdır. Yapılışı: Test kartlarına bir kuyucuğa bir damla hasta serumu damlatılır. Rose bengal antijeni iyice karıştırılarak serumun üzerine damlatılır ve bir kürdan ile iyice karıştırılır. Elde çevirmeli hareketler yapılarak 4 dakika çevrilir. Sonuçta iri tanecikli çökelti oluşursa olumlu, ince tanecikli çökelti oluşursa kuşkulu, homojen görüntü olumsuz olarak değerlendirilir. 82

84 Şekil Rose Bengal testi Wright testi (Standart tüp aglutinasyon testi): Antijen olarak B. abortus S99 ya da B. melitensis antijenleri kullanılır. Hem B. abortus hem de B. melitensis antikorları tespit edilebilir. 1/160 ve üzerindeki pozitiflikler anlamlıdır. 1/80 dilüsyonda pozitiflik durumunda 2-4 hafta sonra test tekrar edilmelidir. Rose Bengal testi kuvvetli pozitif olduğu halde, Wright testi negatif veya zayıf reaksiyon gösteriyorsa Blokan antikorlardan şüphelenilir. Blokan antikorların varlığı Coombs testi veya enzim immunoassay ile tespit edilir. Yapılışı: 1- Tüp taşıyıcısına 10 adet tüp sıralanır. Bunlardan birincisine 0.9 diğerlerine 0.5 er ml fizyolojik tuzlu su dağıtılır. 2- Birinci tüpe hasta serumundan 0.1 ml konur. Yeni bir pipet ile birkaç kez karıştırıldıktan sonra bu tüpten 0.5 ml ikinci tüpe aktarılır. Aynı pipet kullanılarak bu kez aynı şekilde ikinci tüpten üçüncüye ve bu şekilde sondan bir önceki tüpe kadar tüpten tüpe 0.5 er ml aktarılır. Bu tüpten 0.5 ml dışarı atılır. Son tüpe serum konmaz (Antijen kontrol tüpü). 3- Antijen süspansiyonu iyice karıştırıldıktan sonra tüm tüplere (kontrol tüpü dahil) 0.5 er ml antijen dağıtılır. Bu işlemle tüpteki serum serum sulandırımları birer kat artmıştır. 4- Tüpler çalkalanarak karıştırılır. 37 o C de 48 saat bekletildikten sonra değerlendirilir. 5- Önce kontrol tüpünde aglütinasyon olup olmadığına bakılır. Sonra ilk tüpten başlanarak tüpte aglutinasyon olup olmadığı kontrol edilir. İlk Tüp sulandırıma göre 1/80, 1/160, 1/320 şeklinde pozitiflik belirlenir. 1/160 ve üzerindeki pozitiflikler anlamlıdır. 1/80 dilüsyonda pozitiflik durumunda 2-4 hafta sonra test tekrar edilmelidir. Brucella tanısında kullanılabilecek diğer serolojik testler; Spot test, ELISA ile IgG ve IgM türü antikorların tespit edilmesi, kompleman birleşme deneyi ya da radioimmunoassay olarak sıralanabilir. 83

85 Şekil Wright testi Şekil Brucella capt testi Haemophilus spp. ve Tanısı Haemophilus influenza - Küçük kokobasil görünümünde hastalık materyalinde bazen lökositlerin içinde kültürlerde ikişerli, çoklu gruplar oluşturabilen hareketsiz, sporsuz bakterilerdir. Yeni soyutlanan bakterilerde küçük bir kapsül bulunur. - Basit besiyerlerinde üremezler, üremeleri için besiyerinde kanda da bulunan X faktörü (protoporphyrin IX) ve V faktörünün (nicotinamide adenine dinucleotid ) bulunmasını gereksinirler. Bu maddeler kanın ısıtılması ve eritrositlerin parçalanması ile açığa çıktıklarından normal taze kanlı agarda üremede güçlük gösterirler. En iyi üredikleri besiyeri çikolatamsı jeloz olup bu besiyerinde koloniler küçük şebnem tanesine benzeyen düzgün koloniler yapar. 84

86 Şekil Haemophilus influenza - Plak yüzeylerine yapılan ekimlerden sonra çizgi halinde bir Staphylococcus aureus ekimi yapılacak olursa H.influenza kolonileri çizgi boyunca daha büyük ve bol oluşur. Süt anne veya satellit etki denilenilen bu etki Stafilokokların V faktörü sentezlemeleri ile ilgilidir. Şekil Süt anne görüntüsü - H.influenza çoçuklarda menenjit, pnömoni, bronkopnomoni, laringotrakeit, nazofarenjit gibi hastalıklar oluşturur. - H.influenza bakterileri kapsüllerinin yapı değişikliklerine bağlı olarak a,b,c,d,e,f, gibi 6 değişik serovara ayrılır TANI : Olabildiğince çabuk incelenmeli ve bekletilirse oda ısısında bekletilmelidir. Hemophylus bakterileri soğuğa ve kuruluğa karşı dayanıksızdır. Direkt boyalı preparatlar: BOS nın santrüfüj çökeltisinden yapılan preparatta lökositlerin içinde ve dışında tipik Gram negatif bakteriler görülmeye çalışılır. Yeterli bakteri varsa H.influenza type b antiserumu ile kapsül şişme testi ile tanıya gidilebilir. 85

87 Şekil Haemophilus influenza nın boyalı preparatları Ekimler : BOS gibi steril materyaller çikolatamsı agara bolca damlatılarak ekim yapılır. Karışık flora içeren materyallerde ise bacitracin+kloxacillin içeren çikolatamsı plaklara ekim yapılmalıdır. İlk izolasyonlarda süt anne fenomoni için koyun yada tavşan kanlı jeloz ya da çikolatamsı besiyerine S.aureus ile birlikte ekilebilir. İlk izolasyonda tüm ekimler %5-10 CO 2 li ortamda 37 0 C de enkübe edilmelidir. Tipik koloniler saat içinde oluşur. X ve V faktöre ihtiyacın saptanması: H.influenza kolonileri triptikazlı soya buyyonda ezilip sulandırılarak bu süspansiyon triptakazlı soya agarı veya kalp infüzyon agarı plak besiyerlerine ekilir. Aralarında 20 mm kalacak şekilde hazır X,V ve X+V faktörlerini içeren diskler konulur. H.influenza yalnızca X+V diskinin etrafında üreme gösterir. Şekil H.influenza kolonileri Karbonhidrat fermentasyon deneyi: Bunun için ayrı ayrı glukoz, laktoz, sukrozdan %1 oranında ve ayrıca her birinden X ve V faktör içeren fenol kırmızılı buyyon besiyeri kullanılır. Serolojik identifikasyon : Özel serovar monospesifik serumlar ile lamda kapsül şişme reaksiyonları yapılabilir. Ko-aglütinasyon yöntemi ile de serovarları araştırılabilir. Floresanlı antikor deneyleri doğrudan klinik materyallerden tanı konabilir. 86

88 Haemophilus parainfluenza - Normal üst solunum yolu florasında bulunur insanlarda endokarditlerden soyutlanmıştır. Haemophilus aegyptius - H.influenza ya benzer X ve V faktörüne ihtiyaç duyar bulaşıcı konjoktivitlere sebep olur. Haemophilus aphrophylus - Endokardit, beyin apseleri kolesistitlerden soyutlanmıştır. Dental plak florasında bulunabilir. Haemophilus ducrei - Küçük kokobasil görünümünde uç uca ikişerli veya zincir biçiminde hareketsiz, sporsuz,kapsülsüz gram olumsuz bakteriler olup çoğu kez kutupsal boyanır. - Üreyebilmek için X faktörüne ihtiyaç duyarlar. Yumuşak yara (şankroid) adı verilen cinsel ilişki ile bulaşan hastalık yaparlar. Tanısı; Yara tabanı kazınarak örnek alınır. Şişmiş ganglionlar varsa ponksiyon ile irin alınıp incelenmelidir. Preparatlar gram, giemsa veya sulu fuksin ile boyanır. Olguların %60-80 de hücre içlerinde ve dışında uçuca ikişerli kokobasiller görülmesinin tanı değeri vardır. Kültürleri oldukça zordur. Çikolatamsı agar veya vankomisin içeren çikolatamsı agara yapılan ekimlerde 33 0 C de ve %5-10 CO 2 li ortamda inkübe edilirse koloniler 2-9 günde oluşur. Şekil Haemophilus ducrei 87

89 Bordetella pertussis ve Tanısı - Küçük ovoid hareketsiz, sporsuz çoğu kez tek tek bazen uçuca ikişerli görünümünde gram negatif bakteriler olup ilk izolasyonlarında bir mikrokapsülleri bulunur. Kutupsal boyanma eğilimindedirler. - En iyi üredikleri besiyeri Bordet-Gengou besiyeridir. Burada saatte oluşan koloniler düzgün saydam küçük civa damlası görünümdedir. - Boğmaca hastalığının etkenidir. TANI: Ekimler: Nazofarenks sürüntü örneği alınmalı ve bekletilmemelidir. En iyi yöntem plak besiyerine öksürtülerek yapılan yöntemdir. Ekimler Bordet-Gengou plaklarına yapılır ve koloniler 3-4 günde oluşur. Şekil Bordetella pertussis ekim görüntüleri Boyalar: Gram boyama, florasanlı antikor boyaması ve homolog serum ile lam aglütinasyonu yapılarak identifiye edilir. 88

90 Şekil Bordetella pertussis ELİSA: Soyutlanan bakterinin identifikasyonu için monoklonal antikorlar kullanılabilir. Pertusis tokinine karşı antikorların saptanması ile erken tanı B.pertusis toksinine karşı Ig M ve Ig G tipi antitoksik antikorları hastalığın erken dönemlerinde oluşur. ELİSA yöntemi ile bu antikorlar tespit edilebilir ve erken tanı konabilir. PCR: Doğrudan klinik materyallerden DNA sı tespit edilip çoğaltılabilir. Francisella tularensis ve Tanısı - Çok küçük kokobasil, hareketsiz, sporsuz ve gram olumsuz olup zor boyanırlar. Kutupsal boyanma gösterirler. - Genel kullanım besiyerlerinde üremezler. Francis besiyerinde küçük saydam damlacık şeklinde koloniler oluşturur. - Çeşitli yabani hayvanlardan ve kemiricilerden bulaşmak sureti ile insanlarda tularemi hastalığı yaparlar. İnsanlarda ülseroglandüler, oküloglandüler ve tifoid formları vardır. 89

91 Şekil Tularemi lezyonu, ülseroglandüler ve mikroskopik görüntüsü TANI: Ekimler: İnceleme örneği olarak lenf ponksiyon sıvısı ve kan örneği alınabilir. Kültür için kanlı, glikozlu ve sistinli besiyeri olan Francis besiyerine ekim yapılır. Ekimler 37 0 C de 2-5 gün tutulur. Tipik koloniler oluşunca spesifik antiserum ile lam aglütinasyonu yapılır. Şekil Francisella tularensis in besiyeri görüntüsü Hayvan deneyi: Kobaylara inokulasyon daha iyi sonuç verir. 90

92 Serolojik testler: Antikorlar ikinci haftadan başlayarak yükselir ve dört-yedinci haftalarda en yüksek titreye ulaşır. Oluşan Ig G antikorları bir iki yıl daha kaybolmaz. Legionella pneumophila ve Tanısı TANI: - Pleomorfizm gösteren sporsuz, kapsülsüz, tek veya birkaç kirpikleri ile hareketli bir basildir. - Gram olumsuz olmakla birlikte güç boyanır. - Genel kullanım besiyerlerinde üremez. İsovitale eklenerek zenginleştirilmiş Mueller Hinton besiyeri, Feely Gorman besiyeri, Charcoal yeast extract agar besiyeridir.ilk izolasyonlarında %3 CO 2 li ortamda üremeyi sever. - Solunum yollarında incelenecek materyal balgam,trekeobronşial aspirasyon sıvısı,plevra sıvısıdır. Ekimler: L.pneumophila yı üretmek zordur. %3 lük CO 2 li ortamda 3-5 günde toplu iğne başı gibi konveks gri koloniler oluşur. Serolojik testler: İndirekt floresan antikor deneyi ile serolojik tanı yapılabilir. Antikor titresinin 1:128 den fazla olması ve iki hafta sonra titrenin belirgin artmasının tanı değeri vardır. Şekil Legionella pneumophila 91

93 Gardnerella vaginalis - Küçük pleomorfizm gösteren sporsuz kapsülsüz, hareketsiz çomakçıklardır. Gram olumlu olmakla birlikte bazen boyalarını bırakırlar. - Genel kullanım besiyerlerinde üremezler. Çikolatamsı jeloz ve insan kanlı agar besiyerinde ürerler. - Kadınlarda non spesifik vaginosis denilen hastalığın etkeni olarak kabul edilen bu bakteri normal vaginal flora da bulunabilir. Vaginitlerde çoğu kez Bacteriodes ve peptococcus lar ile birlikte bulunur. TANI: Boyalar: Vaginal, serviks ve üretral salgılarda G.vaginalisin saptanması ile konur. Direkt materyalin gram ve giemsa preparatlarında ilk göze çarpan lökositlerin azlığıdır. Vaginal epitelyum hücrelerinin üzerinde çok sayıda gram olumlu ve gram labil bakterilerin yapıştıklarının ve arada gram olumlu laktobasillerin görülmesi tanı koydurucudur. Ekimler: Üretilmeleri zordur. Genelikle vaginit yakınmalarını açıklayacak başka bir etken bulunmamış ise ve mikroskopik incelemede yukarıdaki görünüm görülüyorsa G.vaginalis tanısı için yeterlidir. Şekil Gardnerella vaginalis 92

94 Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1- Önceden hazırlanmış preparatları inceleyiniz. 2- Rose Bengal, Wright ve Brucella capt testlerini inceleyiniz. Kaynaklar 1. Bilgehan H. (2009) Klinik Mikrobiyoloji Tanı. Beşinci Baskı. Barış yayınları, İzmir. 93

95 Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-10 Enterik Bakteriler Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Enterobacteriaceae familyasının genel özelliklerinin öğrenilmesi Enterobacteriaceae familyasında bulunan ve klinik önemi olan bakterilerin öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Enterobacteriaceae familyasındaki cinsleri sayar ve özelliklerini sıralar. Enterik bakterilerin izolasyonunda kullanılan besiyerlerini sayar. Enterik bakterilerin besiyerlerindeki makroskopik görüntülerini tanımlar. Enterik bakterilerin tanımlanmasında kullanılan biyokimyasal testleri sayar. Gram boyama yöntemiyle boyanmış preparatlardaki enterik basilleri mikroskopik olarak inceler. Enterik bakterilerin tanımlanmasında kullanılan biyokimyasal testlerin sonuçlarını değerlendirir. Laboratuvara gelirken kurallara uygun şekilde giyinir. Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Gerekli Malzemeler Mikroskop Lam Lamel Öze Bek Enterik bakteri (Örn; Escherichia coli, Klebsiella ve Salmonella ssp.) üremiş kültür plakları Mc Conkey/ Endo/ EMB (Eosine Methylene Blue), Selenit F / tetra tiyonat Salmonella-Shigella(SS) agar Triple Sugar Iron (TSI) Agar, İndol besiyeri, Metil red- Voges Proskauer besiyeri ve Simmon's Citrate Agar, Hareket besiyeri, Fenilalanin agar Kovaks ayıracı, Metil Red ayıracı, Ferrik Klorür ayıracı Giriş Enterobacteriaceae klinik olarak önemli gram negatif basil izolatlarının yaklaşık %80 ini ve klinik mikrobiyoloji laboratuvarındaki klinik olarak önemli bakterilerin yaklaşık %50 sini oluşturur. Septisemi olgularının neredeyse %50 sinden, üriner sistem enfeksiyonlarının %70 inden fazlasından ve barsak enfeksiyonlarının önemli bir kısmından 94

96 sorumludur. Enterik bakteriler toprakta, suda, bitkilerde yaygın olarak bulunduğu gibi insan ve hayvanların barsaklarında normal flora elemanı olarak da yerleşirler. Nazokomiyal enfeksiyonlardan sıklıkla izole edilirler. Salmonella serotip Typhi tifoya neden olur ve sadece insanlarda bulunur. Bununla beraber Klebsiella pneumoniae suşları asemptomatik barsak kolonizasyonundan, üriner sistem ve solunum sistemi enfeksiyonlarına, hatta fatal pnömoniye, septisemiye ve menenjite varan enfeksiyonlara neden olur. Şigelloz etkeni olan Shigella insanda diyarenin en önemli nedenlerinden birisidir. Yersinia enterocolitica ve bazı Escherichia coli türleri (Enteropatojenik E.coli, Enterotoksijenik E.coli, Enterohemorajik E.coli O157:H7) gastrointestinal enfeksiyon etkeni olan diğer patojen türlerdir. Menenjitlerden ve üriner sistem enfeksiyonlarından sıklıkla izole edilen bakteri yine Escherichia coli' dir. Citrobacter diversus ve Enterobacter sakazakii beyin apsesine neden olan Enterobacteriaceae üyeleridir. Enterobacteriaceae familyasının genel özellikleri: 1. Gram negatif basildirler. 2. Sporsuzdurlar. 3. Peritriş flajellalarıyla hareketli veya hareketsizdirler. 4. Mac Conkey agarda iyi ürerler. 5. Fakültatif anaeropturlar. 6. D-glikoz ve diğer şekerleri sıklıkla gaz oluşturarak fermente ederler. 7. Katalaz pozitiftirler ( Shigella dysenteriae tip 1 hariç). 8. Oksidaz negatiftirler. 9. Nitratı nitrite indirgerler ( Yersinia ve Erwinia hariç). Şekil Işık mikroskobu altında Gram boyama yöntemi ile boyanan gram negatif basillerin görünümü. Enterobacteriaceae familyasındaki cinslerin bazıları: Escherichia Klebsiella Salmonella Shigella Serratia Citrobacter Enterobacter Providencia Proteus Hafnia Erwinia Morganella Edwardsiella Yersinia 95

97 Dışkının Enterik Bakteriler Açısından İncelenmesi Enterobacteriaceae suşlarının identifikasyonunda birçok farklı yaklaşım bulunmaktadır. Tüpte yapılan biyokimyasal testler bütün klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında kullanılmıştır. Ayrıca bilgisayar analizi yardımıyla yapılan identifikasyon yöntemleri ve moleküler yöntemler de mevcuttur. Bakterilerin koloni morfolojisi, pigment oluşumu, hareketlilik gibi bazı karakteristik özellikleri de tanı koymada yardımcıdır. Örneğin; Klebsiella türleri kapsülleri nedeniyle mukoid koloni oluştururlarken, Proteus türleri kanlı agarda buğu tarzında yayılma özelliği gösterirler. E. coli türlerinin bazıları EMB agarda mavi-yeşil metalik refle verirler. Serratia türlerinin bazıları ise kırmızı pigment oluştururlar. A B C D Şekil A: EMB besiyerinde mukoid koloni yapmış Klebsiella spp. B: EMB agarda mavi-yeşil metalik refle veren E. Coli C: Kanlı agarda buğu tarzında yayılma özelliği gösteren Proteus spp. D: Kırmızı pigment oluşturan Serratia spp 96

98 Biyokimyasal Testler İNDOL TESTİ: Bu test için triptofan içeren bir besiyeri kullanılır. Bakteri bu besiyerine ekilerek 37 C lik etüvde bir gece bekletilerek değerlendirme yapılır. Bakteri triptofanaz aktivitesine sahip ise besiyerine Kovacs ayıracı ilave edildiğinde yüzeyde kırmızı renkli bir halka oluşur ve test pozitif olarak yorumlanır. İndol testi E. coli için pozitif, Klebsiella ve Enterobacter türleri için negatiftir. A B C Şekil A: İndol Besiyeri B: İndol Testi Negatif C: İndol Testi Pozitif METİL KIRMIZISI TESTİ: Glukoz fosfatlı bir besiyeri kullanılır. Bakteri besiyerine ekildikten sonra 37 C lik etüvde 48 saat inkübe edilir. Bakteri ortamdaki glukozu kullanıyorsa, karışık asit fermentasyonu son ürünleri nedeniyle metil kırmızısı damlatıldığında besiyerinin rengi kırmızıya döner ve test pozitif olarak yorumlanır. Besiyeri sarı renkte kalırsa test negatiftir. Metil Kırmızısı testi E. coli için pozitif, Klebsiella ve Enterobacter türleri için negatiftir. A B C Şekil A: Metil Kırmızısı besiyeri B: Metil Kırmızısı Negatif C: Metil Kırmızısı Pozitif VOGES-PROSKAUER TESTİ: Butilen glikol fermentasyonu yoluyla glukozu fermente eden bakteriler tarafından, butilen glikol oluşumunda bir ara ürün olan asetoin üretimini tespit etmek için kullanılır. Glukoz fosfatlı besiyerinde bakteri 48 saat inkübe edildikten sonra alfanaftol ve potasyum hidroksit damlatılır. On-on beş dakika içinde kırmızı renk değişiminin olması diasetil oluşumunu gösterir ve test pozitif olarak yorumlanır. Renk değişimi olmazsa test negatif kabul edilir. Voges-Proskauer testi E. coli için negatif, Klebsiella ve Enterobacter türleri için pozitiftir. 97

99 SİTRAT TESTİ: Bakterinin sitratı tek karbon kaynağı olarak kulanma yeteneğini belirlemek için kullanılır. Sitratın hücre içine alınımını sağlayan sitrat liyaz enzimine sahip bakteriler, iyi bilinmeyen bir yolla alkali reaksiyon gerçekleştirirler. Bu test için Simmon' un Sitrat agarı kullanılır ve ayıraç kullanılmaz. Besiyeri içindeki brom timol mavisi ayıracının, yeşil renginin maviye dönmesi testin pozitif olduğunu gösterir. Sitrat testi E. coli için negatif, Klebsiella ve Enterobacter türleri için pozitiftir. A B Şekil A: Sitrat Testi Pozitif B: Sitrat Testi Negatif ÜREAZ TESTİ: Üreyi hidrolize eden bakterileri tespit etmek için kullanılır. Ürenin üreaz enzimiyle hidrolizi sonucu amonyak ve karbondioksit oluşur. Amonyağın oluşması besiyerini alkali yapar. Bu ortam Christensen' s urea agardaki indikatör madde olan fenol kırmızısının rengini kırmızıya dönmesine neden olur. Üreaz testi Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Providencia rettgeri türleri için pozitif, E.coli için negatiftir. A B Şekil A: Üreaz Testi Negatif B: Üreaz Testi Pozitif HAREKET TESTİ: Hazırlanan yarı-katı bir besiyerine ekim yapılır ve 37 C lik etüvde inkübasyona bırakılır. Ertesi gün bakterinin hareket özelliği değerlendirilir. Ekim yerinin etrafına doğru yayılan bulanıklık bakterinin hareketli olduğunu gösterirken, besiyerinin berrak görülmesi bakterinin hareketsiz olduğunu gösterir. Klebsiella ve Shigella hareketsizdir. Yersinia enterocolitica oda sıcaklığında hareketli olduğu halde, 37 C de hareketsizdir. Bu nedenle gerekli durumlarda farklı ısılarda besiyerini inkübe etmek gereklidir. 98

100 A B Şekil A:Hareket testi pozitif, B: Hareket testi negatif TRIPLE SUGAR IRON AGAR ( TSIA) = ÜÇ ŞEKERLİ DEMİRLİ BESİYERİ: Bakterinin glukoz, laktoz ve sukrozu fermentatif olarak kullanıp kullanmadığını ve hidrojen sulfid (H 2 S) oluşturup oluşturmadığını belirlemek için kullanılır. Besiyeri içindeki fenol kırmızısı asidifikasyonun ayıracı, demir sülfat H 2 S gazının ayıracıdır. Bakterilerin fermentatif özelliklerinin gösterilmesi yatık besiyerindeki karbonhidratların oranına bağlıdır. (10 kısım laktoz, 10 kısım sukroz, 1 kısım glukoz ) TSIA' ya ekim yapıldıktan sonra 8-12 saat sonra bakteri glukoz kullanmış ise fermentasyon sonucu organik asitler oluşur ve fenol kırmızısının rengi sarıya dönüşür. Aynı besiyerinin yatık kısmındaki bakteriler, glukozu oksijen karşısında respirasyon yoluyla parçalarlar. Bu parçalanmada az miktarda organik asitler ortaya çıkar. Bunların da besiyerinin rengini sarıya çevirmesi beklenirse de bakteriler aynı zamanda parçaladıkları proteinlerden alkali ürünler oluştururlar. Bu ürünler yatık kısımda glukozun aerobik parçalanmasından oluşan zayıf asit reaksiyonunu nötralize ederek alkali ortam oluşturur. Bu şekilde TSI' da bulunan üç şekerden sadece glukozu parçalayanlar dipte asit (sarı), yatık kısımda alkali (kırmızı) reaksiyon gösterirler. Bu parçalanma esnasında aynı zamanda gaz da oluşursa tüp dibinde gaz kabarcıkları oluşur. Besiyerinde yüksek oranda bulunan laktoz ve sukrozun her ikisini de parçalayan bakteriler hem dip hem de yatık kısmı sarıya çevirecektir. H 2 S Oluşumu: TSIA' da kükürt kaynağı olarak sodyum tiyosülfat ve H2S ayıracı olarak ferrik amonyum sülfat bulunmaktadır. Bakteri eğer kükürtlü bileşikleri parçalıyor ve H2S oluşturuyor ise siyah renkli demir sülfit oluşacağı için besiyerinin rengi siyahlaşır. H2S oluşumu SS besiyerinde siyah kolonilerin oluşumu şeklinde de gözlenebilir. Salmonella ve Proteus türleri H2S pozitif bakterilerdir. A B C Şekil Triple sugar iron (TSI) besiyerinde çeşitli reaksiyonlar A:H 2 S pozitif, gaz pozitif, B:Alkali/ alkali reaksiyon, C: Asit/ asit reaksiyon) 99

101 Tablo Enterobacteriaceae'nin biyokimyasal test paternleri Citobacter Enterobacter Escherichia Klebsiella Morganella Proteus Providencia Salmonella Serratia Shigella Arginine ± ± ± Citrate + + ± ± + ± + Dnase ± + Gas ± ± ± ± ± ± Glukose H 2 S ± + ± Đndole ± + ± + ± + ± Lysine ± + + ± + + Motility + + ± Ornithine ± + ± + ± + + ± Phenylalanine Sucrose ± + ± + ± ± + Urease ± ± + + ± VP ± + + MR TSI yüzey dip Alk (A) AG A AG Alk (A) AG A AG ± : Değişken A : Asit (sarı) + : %90 pozitif G : Gaz : %90 negatif Alk : Alkali VP : Voges-Proskauer reaksiyonu MR : Metil kırmızısı TSI : Triple Sugar Iron agar (üç şeker ) Alk AG Alk AG Alk AG Alk A;G ± Alk (A) A Alk A 100

102 Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1- EMB agardaki bakteriyel koloni morfolojilerini inceleyiniz. 2- Bizmut sülfit agardaki kolonileri inceleyiniz. Gördüklerinizi çiziniz. 3- SS agardaki kolonileri inceleyiniz. Gördüklerinizi çiziniz. 4- IMVIC yapılan kültürleri inceleyiniz, sonuçları değerlendirerek çiziniz. 101

103 5- Üreaz kültürlerini inceleyiniz. 6- TSI agarları inceleyiniz, gördüklerinizi çiziniz, değerlendirme sonuçlarınızı yazınız. Tarih Laboratuvar görevlisinin imzası Kaynaklar 1. Farmer JJ, Boatwright KD, Janda JM (2009). Enterobacteriaceae: Giriş ve Tanımlama. Manual of Clinical Microbiology (Ed: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry LM, Pfaller A). 9th ed. Çeviren: Kayacan ÇB. Washington, D.C. American Society for Microbiology Murray PR, Rosenthall KS, Pfaller MA (2010). Medical Microbiology. Tıbbi Mikrobiyoloji. 6th ed. Çeviren: Başustaoğlu AC, Atlas Kitapçılık Tic. Ltd. Şti., Ankara,

104 Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-11 Sporlu Bakteriler Dersin Amacı Dersin Hedefleri Bilgi Hastalık oluşturan sporlu bakterilerin ve tanısında kullanılan yöntemlerin öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Sporlu bakterilerin neler olduğunu öğrenir Tanısında kullanılan besiyerleri, testleri ve boyama yöntemini bilir Tutum Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Gerekli Malzemeler Hazır preparat Mikroskop İmmersiyon yağı Ekilmiş (Bacillus spp.) kanlı besiyeri Giriş Basillus cinsi, aerop yada fakültatif, spor oluşturan Gram pozitif çomakları içerir. Bu cins içinde yer alan mikroorganizmaların çoğu hava, toprak ve suda saprofit olarak bulunur. Gram Pozitif Çomaklar A- Bacillus spp. B. anthracis 1-B. anthracis 2-B. cereus Her iki türde insanlarda ve hayvanlarda hastalık oluşturan etkenlerdir. G(+) ve sporu basil ortasında ve basilin şeklini değiştirmeden yer almıştır. Kapsüllü basillerdir. Katı besiyerinde kapsül yapısı kaybolur. Basiller Gram boyamada bambu kamışı görünümündedir. 103

105 Genel kullanım besiyerlerinde kolayca üreyebilirler. Aerop ve anaerob üreme özelliğindedir. Katı besiyerinde R tipi koloni yaparlar. Beyazımsı, düzensiz kenarlı ve incelendiğinde ondüle saç görünümündedir. Bu görüntü B. anthracis için tipiktir. Yarı katı besiyerinde dik ekim yapıldığında h. içinde ters çam biçiminde üreme özelliğindedir. Yaptığı hastalık şarbondur. Deri, akciğer ve bağırsağa yerleşir. Septisemi yapma özelliğindedir. Tanı: Gram boyama ile inceleme: Gram pozitif sporlu ve kapsüllü bakteriler görülür Kültür: Koyun kanlı agar besiyerine ekim yapılır. 24 saatlik inkibasyonla üretilebilir. Üreyen mikroorganizma Hareketi (-), Kapsül (+), Pen-G-duyarlı, B hemoliz (-) ise B. anthracis tir. Hareket (+), kapsül (-) Pen-G-R ise B.cereus tur. Şekil Bacillus anthracis B- Clostridium sp. Clostridium genusu zorunlu anaerob bakterilerdir. Spor yapıları subterminal yerleşimli ve bakteriden daha geniş olduğu için raket görünümlü bakterilerdir. İnsan GİS florası ve doğada yaygın olarak bulunan bakterilerdir. C. tetani: Tetanus hastalığını yapan Clostridium türüdür. Zorunlu anaeroptur. Hastalığı oluşturduğu tetanus exotoksini ile yapar. 104

106 Tanı: - Daha çok klinik bulgularla yapılır. ekilir. - Kültürü yapılmak istenirse, kanlı besiyeri, kıymalı buyyon, tiyoglikolatlı sıvı besiyerine - Gam inceleme yapılarak bakterilerin görülmesi - Hayvan deneyi yapılır. Not: Çoğunlukla mikst enfeksiyon oluşturur. (Çoklu bakteri çeşidi) C.botulinum: Besin zehirlenmesi, Yara botulismusu, Bebek botulismusu oluşturur Tanı: Hasta serumu ve dışkıdan toksin araştırılması besin maddelerinden toksin araştırılmasıyla yapılır. Dışkı ve besin maddelerinden kültür yapılır. C.perfringens, C.septicum, C.Novyi, C.histolyticum, C.sporogenes Gazlı gangren yapan organizmalardır. Tanı: -İnfeksiyon bölgesinde alınan materyaldir. -Gram inceleme yapılarak -Kültür yapılır. Bunun için; 1. Kıymalı buyyon 2. Tiyo besiyeri anaerob şartlarda h. İnkübe edilir 3. Kanlı agar C inkübe edilir. Sıvı besiyerinden örnek alınır ve Gram boyama yapılır. Gram (+) ve sporlu basillerin görülmesi, hareket incelemesinde pozitif sonuç alınması, kanlı besiyerinde hemoliz (+) ve kolonileri yarı saydam, grimsi- opak ve ince, ayrıca yayılma özelliği gösteren kolonilerin Clostridium sp. olabileceği düşünülmelidir. C. perfringens: Besin zehirlenmesinde etkendir. 105

107 C. difficile: Pseudomembranöz kolit yapar Dışkı kültürü yapılarak C. difficile izalosyonu ile tanı konur. Dışkıda toksin araştırılabilir. Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. Hazır preparatları inceleyiniz ve çizim yapınız (Bacillus ve Clostridium). 2. Kanlı besiyerinde R tipi koloni oluşumunun inceleyiniz. Basillus spp. Kaynaklar 1. Bilgehan H. (2009) Klinik Mikrobiyoloji Tanı. Beşinci Baskı. Barış yayınları, İzmir. 2. Bilgehan H. (2008) Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi, 12. Basım. Barış yayınları, İzmir. 106

108 Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-12 Mikobakteri Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Mycobacterium ların genel özelliklerinin öğrenilmesi Mycobacterium ların tanısında kullanılan laboratuvar testlerinin öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Mycobacterium ların genel özelliklerini sayar. Mycobacterium cinslerini ve başlıca özelliklerini sayar. Mycobacterium ların mikrobiyolojik tanısı için uygun örnekleri sıralar. Mycobacterium ların mikrobiyolojik tanısı için uygun örnek alımını tarifler. Homojenizasyon- dekontaminasyon basamaklarını sayar. Mycobacterium ların boyanması amacıyla kullanılan boyalarının adlarını sayar. Asido Rezistan Boyama (ARB) yönteminin basamaklarını sayar. Mycobacterium kültür yöntemlerini sayar. Lowenstein - Jensen besiyerinin özelliklerini sayar. ARB boyama yapar. ARB boyama yöntemi ile boyanmış preperatları mikroskobik olarak değerlendirir. Mikroskobi sonucunu yorumlar. Mikroskobu başkalarının yardımına ihtiyaç duymaksızın kullanır. Laboratuvara gelirken kurallara uygun şekilde giyinir. Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Gerekli Malzemeler Mikroskop ARB ile boyanmış preparat Hasta balgamından hazırlanmış preparat ARB boya seti Ekim yapılmamış Lowenstein - Jensen Besiyeri M. tuberculosis üremiş Lowenstein - Jensen Besiyeri Giriş Mycobacterium lar 1 4 x 0,2 0,4 µm büyüklüğünde hareketsiz, kapsülsüz, sporsuz, hafif kıvrık veya düz, dallanabilen zorunlu aerop basiller olup, sporsuz bakterilerin en dirençlilerindendir. En iyi üreme sıcaklığı 37 C'dir. 25 C'nin altında ve 42 C'nin üstünde 107

109 üremezler, hücre duvar yapısı diğer bakterilerden farklı olduğu için Gram ve birçok diğer laboratuvar boyası ile kolay boyanmazlar. Mycobacterium cinsinde 200 kadar farklı tür belirlenmiştir. Bunların bir kısmı saprofittir ve hastalık oluşturmaz. M. leprae; lepra (cüzzam) hastalığının etkenidir, tüberküloz (verem) hastalığının etkeni olan Mycobacterium tuberculosis kompleks ise M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum ve Mycobacterium microti türlerinden oluşmaktadır. Mycobacterium tuberculosis Tek tek, küçük zincirler veya küçük demetler halinde bulunabilirler. Kültürden hazırlanan preperatlarda kokoid veya filamantöz biçimde görülebilirler. Tüberküloz enfeksiyonu, başta akciğerler olmak üzere plevra, böbrek, deri, meninks, periton gibi birçok organı tutabilir. Mikrobiyolojik tanı için; lezyonun lokalizasyonuna göre balgam, mide yıkama suyu, eklem sıvıları, idrar, BOS, kan, dışkı, deri kazıntısı gibi örnekler direkt mikroskobi, kültür, PCR, ELISA, kompleman fiksasyon testi, hemaglütinasyon testi veya hayvan inokülasyonu ile incelenir. Tüberküloz tanısı, genellikle balgamın veya patolojik materyalin yayma preparatlarda ve kültürlerde incelenmesi ile kesinlik kazanır. Bu nedenle tüberküloz tanısında bakteriyoloji en başta yer alan yöntemdir. Materyalin Alınması ve İşlenme Yöntemleri Balgam: Sabahları aç karnına, ardışık günlerde, her gün bir örnek olmak üzere toplam üç örnek verilmelidir. Balgam çıkarmadan önce ağız çevresi ve ağız içi temizlenmeli, gerektiğinde dişler fırçalanmalıdır. Balgam çıkarılamıyorsa balgam yumuşatıcı ilaçlar verilir, bol su içirilir. İndüklenmiş balgam örneği görünüm açısından tükrüğe benzer. Bu nedenle örneğin yanlışlıkla reddedilmemesi için istem kağıdına indüklenmiş balgam notu eklenmelidir. Mide açlık suyu: Bebek ve küçük çocuklarda balgam yutulduğu için nazogastrik sonda ile mide suyu alınarak incelenir. Bu amaçla mideye steril serum fizyolojik verilir. Bu sıvı içindeki balgam parçacıkları steril kaba aktarılır. Örneğin ph sı sodyum karbonat ile nötralize edilir. Sabahları mümkün olan en erken zamanda ve üç gün üst üste örnek alınır. İdrar: Mümkün olduğu kadar fazla miktarda (40 ml den fazla), üç gün üst üste sabah ilk yapılan (dolayısıyla gece uyku süresince mesanede birikmiş) idrarın orta akımından elde edilmiş örnekler ve mesaneden kateter ile alınan idrar örneği kabul edilmelidir. Biyopsi materyali: Mümkünse en az bir gram doku steril kap içinde tuzlu su veya diğer sıvılara batırılmadan veya gazlı beze sarılmadan laboratuvara gönderilmelidir. Formalin içinde teslim edilen örnekler yayma ve kültür için kabul edilmez. Steril vücut sıvıları: Mümkün olduğu kadar fazla miktarda, steril kapaklı tüpte ya da steril kapaklı enjektörde laboratuvara gönderilir. 108

110 Diğer örnekler: Aseptik koşullarda mümkün olduğu kadar çok materyal aspire edilmeli veya alınmalıdır. Kemik iliği / Kan: Steril serum fizyolojik ya da transport besiyeri içeren tüpte, mümkünse SPS (sodium polyanethol sulfonate) (0,25 0,50 mg/ml) ya da heparin (0,2 mg/ml) içeren tüplere örnek konulduktan sonra birkaç kez ters-düz edilir. EDTA lı tüpteki kan ve pıhtılaşmış kan kabul edilmez. Direkt olarak BACTEC 13A kültür şişelerine ekim de etkili bir yöntemdir. Örneklerin laboratuvara ulaştırılması ve işlenmesi ile ilgili bazı hususlar: Tüm örnekler en kısa sürede laboratuvara ulaştırılmalıdır. Laboratuvara hızlı ulaştırılması mümkün değilse örnek buzdolabında 2-8 C de dondurulmadan saklanmalıdır. Herhangi bir tespit edici ya da koruyucu madde eklenmemelidir. Saprofit mikobakteriler bulunacağından musluk suyu ile temas ettirilmemelidir. BOS, parasentez, torosentez gibi steril vücut sıvılarına homojenizasyondekontaminasyon işlemi yapılmasına gerek yoktur. Santrifüj edilip pellet ile işlem yapılır. İdrar örnekleri önce 3500 rpm de santrifüj edilip pellet ile işlem yapılır Katı kıvamda gelen numuneler N-asetil-L-sistein (NALC) - NaOH eklenip parçalanır ve daha sonra işlem yapılır. Homojenizasyon - Dekontaminasyon Balgam ve mide lavaj sıvısı gibi flora elemanlarıyla temas eden numunelere dekontaminasyon ve homojenizasyon işlemleri uygulanmalıdır. Böylece az sayıda ve homojen olarak dağılmamış Mycobacterium basilleri bir araya toplanacak, flora elemanları uzaklaştırılmış olacaktır. Uyulması gereken adımlar Numune miktarı kadar (1:1 oranda) %4 lük NaOH konulur. Örnek yoğun kıvamlı ise N- asetil-l-sistein eklenir. NaOH diğer canlı hücre ve bakterileri yok ederken M. tuberculosis e zarar veremez. Vortekslenir, oda ısısında 15 dakika beklenir. Tampon solusyonu (PBS) ile 40 ml ye tamamlanır. Fosfat tamponu NaOH konsantrasyonunu azaltır ve mikobakteri üremesi için uygun olan ph 6.8 i sağlar rpm de 15 dak santrifüj edilir Süpernatant dökülüp pellet üzerine 5 ml tampon solüsyonu konur. Vortekslenir. Bu şekilde elde edilen karışım tüm tanı işlemlerinde kullanılabilir. 109

111 Bakteriyolojik İnceleme Yöntemleri 1. Mikroskobik Tanı a. Balgamın veya patolojik materyalin hiç bir işleme tabi tutulmadan, varsa irinli veya nekrozlu tanecikli kısımlarından lama yayılması ve doğrudan boyanarak basil araştırılması (direkt preparat). b. Balgamın veya patolojik materyalin işlenmesinden (homojenizasyon-dekontaminasyon) sonra konsantre edilmiş sedimentin boyanarak basil araştırılması. Her iki teknikte, lama ince bir tabaka halinde yayma yapılır, preparat havada kurutulur ve alevden üç defa geçirilerek tespit edilir. Mycobacteriumlar ın Gram boyanma özellikleri yoktur. Preparatın boyanmasında genellikle Ehrlich-Ziehl-Neelsen metodu uygulanır, mavi zemin üzerinde kırmızı basiller görülür. Kinyon yönteminde ise yeşil zemin üzerinde kırmızı basiller görülür. Ayrıca preparatlar floresan boyama (Auramine Rhodamine Floresan Boyama) yöntemleriyle de incelenebilir. Erlich-Ziehl-Neelsen (EZN) veya Asido Rezistan Boyama (ARB) Lama fikse edilen basillere aşağıda gösterildiği sırayla boyama işlemi uygulanır. Karbol fuksinle lam tamamen kaplanıp, 5 dak kaynatılmadan ısıtılır. Suyla yıkanır. %3 lük HCl içeren asit-alkol dökülüp 5 10 dak beklenir Suyla yıkanır. Kuruduktan sonra mikroskopta 1000 lik büyütmede incelenir. Metilen mavisi dökülür 1 dakika beklenir, suyla yıkanır. Şekil Erlich-Ziehl-Neelsen (EZN) boyama yönteminin uygulanışı 110

112 Ehrlich-Ziehl-Neelsen tekniği ile aside dirençli bakteriler hariç, balgamda bulunan bakteriler mavi renge boyanmışlardır. Cerahatli balgamlarda mavi renge boyanmış bol miktarda lökosit vardır. Ayrıca epitel hücreleri ve fibrin görülebilir. Her incelemeden sonra immersiyon objektifinin de iyice temizlenmesi gerekir. Bu duruma dikkat edilmezse daha önceki numuneye ait basiller objektifle yeni lama aktarılarak yanlışlıklara sebep olabilir. Tablo Mikroskopi sonucunun yorumlanması Basil Sayısı Sonuç 0 Asido-resistan basil görülmedi Yaymanın tümünde 1 2 tane 1 2/300 alan Yaymanın tümünde 3 9 tane 1 9/100 alan Yaymanın tümünde 10'dan fazla 1 9/10 alan Her immersiyon alanında 1 tane veya daha fazla 1 9/her alan >9/her alan Saptanan basil sayısı verilir ve yeni materyal istenir Seyrek veya + (1+) basil görüldü Bir kaç tane veya ++ (2+) basil görüldü Çok veya +++ (3+) basil görüldü (4+) basil görüldü. Mikroskopide basil türünü tayin etmek mümkün olmadığından inceleme sonucu: Asidorezistan basil görüldü veya görülmedi olarak rapor edilir. 2. Kültür Bu amaçla geliştirilmiş birçok besiyeri vardır. Bunların çoğu semisentetiktir. En çok kullanılanı Lowenstein-Jensen besiyeri dir. Bu besiyeri yumurta, patates, gliserol, çeşitli mineraller ve malaşit yeşili içerir. Malaşit yeşili diğer bakterilerin üremesini engeller. Numuneden pastör pipeti yardımıyla tüpteki yatık besiyerinin yüzeyine 3-4 damla damlatılır. Besiyeri eğilip doğrultularak materyalin tüm yüzeye yayılması sağlanır. İlk gün yatay konumda, ertesi gün dik konuma getirilerek inkübe edilmeye devam edilir. Ekilen kültürler 37 C ye ayarlı etüvde aerop koşullarda, 4-8 hafta takip edilmelidir. Jenerasyon zamanı yaklaşık 18 saat olduğundan üreme en erken 2 haftada gözlenir. Ekilen örnekte

113 bakteri olması halinde üreme görülür. Oluşan koloniler krem rengi, kuru, buruşuk yüzeyli, düzensiz kenarlıdır ( ekmek kırıntısı şeklinde). Sıvı besiyerleri hem mikobakterilerin primer izolasyonu hem de sub-kültürlerinin yapılması için kullanılabilirler. Günümüzde, mikobakterilerin izolasyonu için özenle hazırlanmış ticari kültür sistemleri mevcuttur: MGIT (Bactec Mycobacterium Growth Indicator Tube) gibi basit şişe ve tüpleri, yarı otomatize sistemler (BACTEC 460TB system; BD) ve tam otomatize sistemler (BACTEC 9000MB ve BACTEC MGIT 960 vs ). Şekil Lowenstein - Jensen besiyerinde üreyen M. tuberculosis kolonileri (ann-clinmicrob.com dan alınmıştır). Şekil BACTEC MGIT 960 sistemi görüntüsü 3. Hayvan Deneyleri Hayvan deneylerinde tüberkülin negatif beyaz kobaylar kullanılır. Geçmiş yıllarda tüberküloz basillerini izole etmek için kobay inokülasyonları sıklıkla kullanılan bir yöntemdi. Günümüzde kültür tekniğinin gelişmesi ve izoniazide dirençli basillerin kobayları hastalandırma özelliğini kaybetmesi ve kobaylarda dissemine lezyonlara neden olan diğer mikobakterilerin ayırt edilememesi gibi nedenlerden dolayı hayvan deneyleri büyük oranda terk edilmiştir. Mycobacterium leprae Birçok yönden M. tuberculosis'e benzeyen lepra basili düz veya hafif kıvrık, hareketsiz sporsuz basildir. Doku kesitlerinden ve salgılardan yapılan preparatlarda bakteriler tek tek görülebilmekle beraber çoğu kez lepra hücreleri de denilen mononükleer hücrelerin içlerinde çalı demeti ve sigara dizisi biçiminde kümeler şeklinde görülürler. Ehrlich-Ziehl-Neelsen yöntemi ile asido rezistan boyanırlar. Lepranın tanısı, hastalık materyalinden yapılan preparatlarda Mycobacterium leprae'nın görülmesi temeline dayanır. Kültür ve hayvan deneyi yoktur (kültürde üretilememiştir). Lepralılar burun salgıları ile bol lepra basili çıkarırlar, bir pamuklu silgicin burun septum mukozasına sertçe sürtülmesiyle alınan materyalden temiz lamlara yayılarak hazırlanan preparatlar Aside rezistan boyama yöntemleriyle (Ehrlich-Ziehl-Neelsen metodu) boyanırlar. Yapılan incelemelerde özellikle globi lerin (mavi zemin üzerinde toplu halde duran kırmızı basiller) görülmesi kesin tanı değeri taşır. 112

114 Şekil Hastalık materyalinde M. leprae nın görünüşü (tr.wikipedia.org dan alınmıştır). Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. Örnek olarak mikroskoplara yerleştirilmiş olan Ehrlich-Ziehl-Neelsen boyası ile boyanmış preperatları inceleyerek gördüklerinizi çiziniz. 2. Hasta balgamından hazırlanmış preperatları Ehrlich-Ziehl-Neelsen boyama yöntemi ile boyayarak immersiyon objektifi ile inceleyiniz. 3. Löwenstein- Jensen besiyerinde üremiş olan M. tuberculosis kolonilerini inceleyerek şekillerini çiziniz. Tarih Laboratuvar Görevlisinin İmzası 113

115 Kaynaklar 1. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA (2010). Tıbbi Mikrobiyoloji. Altıncı Baskı. Çev. Edit. Başustaoğlu AC, Atlas Kitapçılık, Ankara, Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA (2009). Klinik Mikrobiyoloji Manual of Clinical Mikrobiology. Dokuzuncu baskı. Çev. Edit. Başustaoğlu AC, Atlas Kitapçılık, Ankara, cilt 1, Tünger A, Çavuşoğlu C, Korkmaz M (2005). Mikrobiyoloji. Dördüncü Baskı. Asya Tıp Kitabevi, İzmir, Editörler: Günalp A, Yılmaz YA, Pınar A (2003). Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı. Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Ankara,

116 Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik- 13 Mikoloji 1- Dermatofitlerin Laboratuvar Tanısı Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Gerekli Malzemeler Dermatofitlerin öğrenilmesi Dermatofitlerin tanımlama yöntemlerinin öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Dermatofitleri tanımlar. Dermatofitleri gruplandırır. Dermatofitlerin enfeksiyon bölgelerini sayar. Dermatofitleri hifa ve sporlarını sayar. Materyallerin direkt mikroskobik incelemesini yapar. Materyallerin ekimini yapar. Agar blok yöntemini uygular. Agar blok yöntemiyle hazırlanmış preparatların mikroskobik incelemesini değerlendirir. Laboratuvara gelirken kurallara uygun şekilde giyinir. Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Dermatofit bulunan materyal Steril bistüri Potasyum hidroksit (KOH) solusyonu Lam Lamel Mikroskop Sabouraud Dekstroz Agar (SDA) Dermatofit üremiş kültür plakları Steril pleyt Steril su Agar blok yöntemiyle ekim yapılmış kültür plakları Giriş Dermatofitoz insan ve hayvanlardaki keratinize dokuların (saç, tırnak ve deri) fungal enfeksiyonudur. Dermatofitoz etkeni olan mantarlara dermatofit adı verilmektedir. Dermatofit grubu içerisinde üç farklı cins bulunur: Microsporum, Epidermophyton, Trichophyton. Epidermophyton (tek tür içerir) deri ve tırnakta, Microsporum türleri saç ve deride, Trichophyton türleri ise saç, deri ve tırnakta enfeksiyonlara yol açar. Bu mantarlar küf fazında üreme gösterirler. Septalı hifa yapısına sahiptirler ve aseksüel spor oluştururlar. Bu 115

117 aseksüel sporlar dermatofit türlerini birbirinden ayırt etmek için en çok başvurulan kriterler arasındadır. I. Örnek Alma Dermatofitleri Tanımlama Yöntemleri Enfekte bölge örnek alınmadan önce normal bakteriyel flora elemanlarının uzaklaştırılması amacı ile % 70 alkol ile silinir. Steril bir keskin olmayan bistüri ile özellikle lezyonun kenarlarından olacak şekilde kazıntı materyalleri toplanır. Enfekte saç penset yardımı ile köklerinden koparılır. Tırnak için ise distal uçtan kazıntı materyali alınır. Örnekler steril bir kap veya temiz bir kağıt parçası içerisine konularak Laboratuvara gönderilir. II. Direkt Mikroskopik İnceleme Kazıntı örnekleri temiz bir lam üzerine alınır. Üzerine bir damla %10-20 lik potasyum hidroksit (KOH) solüsyonu damlatılır. Üzerine lamel kapatılarak oda sıcaklığında yaklaşık 20 dakika bekletilir. Preparat 400X büyütmede hifa ve artrokonidia varlığı açısından incelenir. %10 KOH Hazırlanışı Potasyum hidroksit Gliserol Distile su 10 g 20 ml 80 ml Potasyum hidroksit distile su içine koyularak iyice çözünmesi sağlanır. Gliserol ilave edilip iyice karıştırıldıktan sonra ağzı kapaklı şişede oda ısısında saklanır. Epitel hücre Mantar hifaları Şekil Deri kazıntı örneklerinin direk miroskopik inceleme görüntüleri III. Dermatofitlerin Kültürü Kloramfenikol ve siklohekzimid eklenmiş Sabouraud dekstroz agar (Mikobiyotik agar) kullanılır. Kloramfenikol bakterilerin, siklohekzimid ise saprofit küf mantarlarının üremesini baskılar. Çengel öze yardımı ile alınan materyaller besiyerine gömülerek ekimleri yapılır. 25 C lik etüvde 3-4 hafta süre ile inkübasyona bırakılır. Üreme gözlenen örnekler için tanımlama işlemlerine geçilir. 116

118 IV. Dermatofitlerin Tanımlanması Tür tayinleri agar blok kültürlerinde görülen hifa ve spor yapıları ve SDA besiyerindeki subkültürleri neticesinde oluşturdukları koloni morfolojileri ve pigmentasyonlarına göre yapılır. Trichophyton Bu cinse ait türler pamuksu veya kadifemsi koloniler oluşturur. Koloniler değişik renklerde görülebilirler (kırmızı, kahverengi, krem rengi, violet vs.). Genellikle az oranda, ince duvarlı mekik şeklinde ve az bölmeli makrokonidia lar ve çok miktarda mikrokonidya oluşturur. makrokonidya Şekil Trichophyton türlerinin mikroskopik görünümü ( dan alınmıştır). Microsporum Bu genusa ait türler karakteristik bol miktarda kalın duvarlı, çok bölmeli ve yüzeyleri düzgün olmayan makrokonidyalar oluştururlar. Mikrokonidyalar ya hiç görülmez ya da çok az görülür. makrokonidya Şekil Microsporum türlerinin mikroskopik görünümü ( dan alınmıştır). 117

119 Epidermophyton Bu genusta patojen olarak sadece E. floccosum bulunmaktadır. Bu mantar türü karakteristik uçları yuvarlak az bölmeli makrokonidya lar oluştururken hiç mikrokonidya oluşturmaz. makrokonidya Agar Blok Kültürü Şekil Epidermophyton floccosum un mikroskopik görünümü ( dan alınmıştır). Agar blok kültürü ile üreyen mantarın spor ve hifa yapıları daha ayrıntılı olarak görülebilir. Beş milimetre kalınlığında SDA besiyerinden 1cm 2 lik bloklar kesilir. Cam petri içinde steril bir lamın ortasına yerleştirilir. Çengel seklinde kıvrılmış öze ile mantar kolonisinden bir miktar alınarak besiyerinin her bir kenarının ortasına ekim yapılır. Üzerine steril bir lamel kapatılarak petri kutusunun içerisine 1-2 mililitre steril su koyulur. Etüve kaldırılarak bir hafta bekletilir. Bu sürenin sonunda agar bloğu üzerindeki lamel alınarak bir damla laktofenol pamuk mavisi boyası konulmuş lamın üzerine kapatılır. Hafifçe bastırılarak kenarları entellan ile kapatılır ve mikroskopta incelenir. Şekil Agar blok kültürünün yapılışı. 118

120 Laboratuvarda Yapılacak işlemler 1. Hasta materyalinden örnek hazırlayarak mikroskopta inceleyiniz, gördüklerinizi çiziniz. 2. Mikobiyotik Agar (SDA) besiyerlerinde üremiş olan dermatofit türlerini inceleyerek gördüklerinizin renklerini belirterek çiziniz. 3. Agar blok kültürü yöntemiyle hazırlanmış preparatları mikroskopta inceleyerek gördüklerinizi çiziniz. Tarih Laboratuvar görevlisinin imzası Kaynaklar 1. Kern ME, Blevins KS (1997). Medical Mycology. A Self-Instructional Text. Second Edition. F.A. Davis Cmpany, Philadelphia 2. Arıkan S (2003). Mantar Enfeksiyonlarında Tanı Yöntemleri. Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı (Günalp A, Yılmaz Akyön Y, Pınar A), Hacettepe Üniversitesi Yayınları,

121 2- Fırsatçı ve Sistemik Mikoz Etkenlerinin Laboratuvar Tanısı Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Gerekli Malzemeler Fırsatçı mantar enfeksiyonlarının öğrenilmesi Fırsatçı mantar enfeksiyonlarının laboratuvar tanısının öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Fırsatçı mantar enfeksiyonunu tanımlar. Fırsatçı mantar enfeksiyonları etkenlerini sayar. Fırsatçı mantar enfeksiyonlarının üreme koşullarını tarifler. Sistemik mantar enfeksiyonunu tanımlar Sistemik mantar enfeksiyonlarının etkenlerini sayar. Sistemik mantar enfeksiyonlarının etkenlerinin üreme koşullarını tarifler. Üremiş kolonilerden mikroskopta incelemek için preperat hazırlar. Gram boyama yöntemi ile boyanmış preperatları mikroskobik olarak değerlendirir. Laboratuvara gelirken kurallara uygun şekilde giyinir. Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Mikroskop Lam Öze Bek Gram boyama seti Sistemik enfeksiyon etkeni üremiş kültür plakları Fırsatçı enfeksiyon etkeni üremiş kültür plakları Gram boyama ile hazırlanmış preperatlar Giriş Fırsatçı mantar enfeksiyonları, immün sistemi baskılanmış kişilerde önemli morbidite ve mortalite nedenleri arasındadır. Bu enfeksiyonlar, normal flora üyeleri ya da doğada sıkça bulunan mantarlar ile oluşur. En sık karşımıza çıkan fırsatçı mantar enfeksiyonu etkenleri Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Cryptococcus neoformans, Blastoschizomyces capitatus, Zygomycetes, Fusarium, Acremonium, Scedosporium, Scopulariopsis, Paecilomyces ve Trichoderma türleridir. Sistemik mantar enfeksiyonları ise doğa ve toprakta bulunan dimorfik mantarlar tarafından oluşturulan, genellikle mantar sporlarının inhalasyon yolu ile alınması ile başlayan, akciğer enfeksiyonunu takiben diğer organlara da yayılım gösteren, belirgin coğrafik dağılımı olan, mantar enfeksiyonlarıdır. Sağlıklı insanlarda da görülebilirler. En sık görülen sistemik mantar enfeksiyonu ajanları Coccidioidomycosis, Histoplasmosis, Blastomycosis ve Paracoccidioidomycosis tir. 120

122 Candida Candida türleri tüm dünyada en sık fırsatçı mikoz etkeni olan mantarlardır. Candida maya morfolojisinde bir mantardır. Candida cinsi içerisinde yüze yakın sayıda tür bulunur. Candida albican senfeksiyonlarda en sık etken olan türdür. I. Direkt Mikroskopik İnceleme Candida ların Laboratuvar Tanısı Klinik örneklerden preparat hazırlanarak fiske edilir. Daha sonra Gram boyama yöntemi ile boyanarak 1000X büyütme ile incelenir. Kandidalar oval, yuvarlak tomurcuklanan maya hücreleri şeklinde görülür. Birçok kandida türü bu yapılara ek olarak psödohif oluşturur. Maya hücreleri Psödohif Şekil Maya hücrelerinin direkt mikroskopik görüntüsü II. Kültür Klinik örnekler Sabouraud dekstroz agar (SDA) besiyerine tek koloni ekim yöntemi ile ekilir. Kültürler C lik etüvlere kaldırılarak 1 hafta süreyle inkübe edilirler. Kandidalar genellikle krem renkli, yumuşak kıvamlı, kendilerine has kokuları olan koloniler oluştururlar. Şekil Candida kolonilerinin kültürdeki görünümleri 121

123 III. Kandidaların tür düzeyinde tanımlanması a. Germ tüp testi Germ tüp testi 0.5 ml Serum (insan, tavşan, dana) Taze Candida kültürü Serum örnekleri eppendorf tüp içine koyulur. Test edilecek kültürden bir öze dolusu alınarak serum içerisine ilave edilir. Tüpler 37 C de 2-3 saat inkübe edilir. Tüp içeriğinden bir damla alınarak temiz bir lamın üzerine koyulur. Üzeri lamel ile kapatılıp 400X büyütmede uzun tüp benzeri yapıların varlığı açısından incelenir. Şekil Germ tüp oluşumu Şekil 13-9.Pozitif germ tüp testi b. Mısırunlu tween 80 besiyerindeki morfolojik görünüm Şekil Mısırunlu tween 80 besiyerinde farklı spor yapılarının görünüşü 122

124 c. Biyokimyasal identifikasyon Bu amaçla karbohidrat fermentasyon ve asimilasyon testlerine dayanan hazır maya tanımlama kitleri bulunmaktadır. Örneğin API 20C Yeast system, ID32C, Remel RapID vb. sistemler rutin laboratuvarlarda en yaygın kullanılanlardır. Şekil RapID identifikasyon sisteminin görünümü Aspergillus Aspergillus doğada (toprak, çürümüş bitkiler, vb.) yaygın olarak bulunan bir küf mantarıdır. Bu mantarlar yaygın ve lokal enfeksiyonlara neden olurlar. Ayrıca hipersensivite reaksiyonu sonucu bronkopulmoner aspergilloz da oluşturabilirler. Enfeksiyonlarda en sık izole edilen tür A. fumigatus tur. Fırsatçı mikozlarda Candida türlerinden sonra en sık görülen Aspergillus türleridir. Aspergillus türleri tarafından oluşturulan enfeksiyonlar ekzojen kaynaklıdır. a. Direkt Mikroskopik inceleme Aspergillus ların Laboratuvar Tanısı Klinik örneklerden (balgam, bronşiyal lavaj, akciğer ve paranazal sinüs biyopsisi vb.) KOH damlatma yöntemi ile nativ preperat hazırlanıp 400X lük büyütmede incelenir. Mikroskopik incelemede 45 lik açı oluşturan septalı hifler (dikotom) görülmesi Aspergillus için tipiktir. Şekil Aspergillus hifalarının dokudaki görüntüsü ( 123

125 b. Kültür Örneklerin SDA ya ekimleri yapılarak C de 7-21 gün inkübe edilir. Pamuksu, kadifemsi, türlere göre farklı renkleri olan koloniler oluştururlar. Örneğin A. fumigatus kolonileri maviyeşil, A. flavus kolonileri çimen yeşili renktedir. Koloni özellikleri tür tanımlanmasında kullanılan kriterlerden biridir. Şekil A. flavus koloni görünümü ( Şekil A. fumigatus koloni görünümü ( c. Aspergillus türlerinin tanımlanması Oluşan kolonilerden küçük bir parça kesilerek lam üzerine koyulur. Üzerine bir damla laktofenol pamuk mavisi damlatılır ve lamel kapatılır. Lamelin üzerine hafifçe bastırıldıktan sonra 400X lük büyütmede incelenir. Gerek görüldüğü takdirde agar blok kültürü yapılarak daha ayrıntılı inceleme yapılır. Mikroskopik incelemede septalı hif, konidyofor, vezikül ve fiyalidlerin yapıları incelenerek tür tanımlaması yapılır. Vezikül Konidiyofor Şekil Aspergillus türlerinin mikroskobik görünümü 124

126 Şekil Aspergillus türlerinin mikroskopik görünümleri ( Zygomycetes Doğada yaygın olarak bulunan küf mantarlarıdır, oluşturdukları enfeksiyonlara zigomikoz denir. Bu sınıfta çok sayıda cins bulunur. Mucor, Rhizopus, Absidia en sık enfeksiyon yapanlardır. a. Direkt mikroskopik inceleme Zygomycetes lerin Laboratuvar Tanısı İncelenecek örneklerden (paranazal sinus direnajı, akciğer biyopsisi, bronşiyal lavaj, balgam vb.) KOH yöntemi ile nativ preperat hazırlanır ve 400X lük büyütmede incelenir. Bu incelemede seyrek septalı ya da septasız, dik açıyla dallanan hifler görülür. Dokular Gomori metenamin gümüşleme yöntemi ile boyanıp vasküler invazyon, infarkt ya da nekroz alanları tespit edilebilir. Şekil Zygomikoz etkenlerinin dokudaki görünümü ( www. Mycology.adelaide.edu.au) 125

127 b. Kültür Zygomycetes sınıfı mantarların izolasyonu için örnekler SDA ya ekim yapılır. Birkaç gün (24-96 saat) sonra petrinin tamamını kaplayan, tüylü, gevşek, beyaz-gri ya da kahverengi koloniler oluşur. Koloniler besiyerinin tüm yüzeyini kaplar ve yüksekliği petri kutusunun kapağına kadar ulaşabilir. Koloni rengine bakılarak cins ayırımı yapılamaz. Şekil Zigomikoz etkenlerinin koloni görünümü ( a. Zygomycetes türlerinin Tanımlanması Üreyen kolonilerden laktofenol pamuk mavisi ile hazırlanan preperatlar 400 lük büyütmede incelenir. Septasız ya da seyrek septalı, düzensiz konturlu hifler, içlerinde sporongiyospor bulunduran sporongiyumlar görülür. Bazı cinslerde (Rhizopus, Absidia ) rizoid (köksü yapılar) bulunur. Şekil Zygomycetes grubu mantarların mikroskopik grünümü ( 126

128 Cryptococcus neoformans Genellikle immün yetmezliği olan kişilerde görülen fırsatçı mikoz etkenlerinin başlıcalarındandır. Meningeal enfeksiyon sıktır ve en kolay tanınan şeklidir. Enfeksiyonları Kriptokokkoz olarak adlandırılır. Tıbbi önem taşıyan mayalar arasında kapsüllü olması ile ayrıcalıklı bir mantardır. C.neoformans, hem 37 C, hem de 26 C de tomurcuklanarak üreyebilen 5-12 µm çapında, kapsüllü, maya fazında bir mantardır. Cryptococcus neoformans ın Laboratuvar Tanısı a. Direkt mikroskopik inceleme Klinik örnekler (çoğunlukla BOS) C. neoformans açısından çini mürekkepi ile incelenir. Örnekler mutlaka santrifüj edilmelidir. Temiz bir lam üzerinde örnek ve çini mürekkebi birebir oranında karıştırılır. Üzeri lamel ile kapatılarak 400X büyütmede incelenir. Gri-siyah zeminde kapsüllü, bazen tomurcuklanmış veya ikili şekillerde görülür. Mantarın çevresinde çini mürekkebi preperatında görülen kapsül asidik mukopolisakkarit yapısında olup kapsül genişliğinin patojenite ile ilişkisi vardır. b. Kültür Şekil C. neoformans ın mikroskopik görünümü ( Örnekler SDA ya ekimleri yapıldıktan sonra C lik etüvde saat arası inkübe edilirler. Süre sonunda krem renkli, yassı, parlak, ıslak görünümlü çoğunlukla sümüğümsü ve çevresi düzgün koloniler oluştururlar. Kapsülün kalınlığı arttıkça oluşan koloniler daha mukoid olur. c. Cryptococcus Türlerinin Tanımlanması Kolonilerin mukoid olması ve mikroskopik incelemede kapsüllü maya hücrelerinin görülmesi C. neoformans ı düşündürmelidir. Kesin tanımlama için üreaz testi ve difenol oksidaz enzim aktivitesi bakılır. Her iki enzimde C. neoformans ta pozitiftir. Ayrıca karbohidrat fermentasyon ve asimilasyon testlerine dayanan hazır maya tanımlama kitleri ile kesin tanımlama yapılır (bkz. Candida). 127

129 Laboratuvarda Yapılacak işlemler 1. Hazır olarak size gösterilen preparatları inceleyiniz ve şekillerini çiziniz. 2. Maya fazında üremiş olan mantar kolonilerinden boyama yaparak inceleyiniz. Tarih Laboratuvar görevlisinin imzası Kaynaklar 1. Kern ME, Blevins KS (1997). Medical Mycology. A Self-Instructional Text. Second Edition. F.A. Davis Cmpany, Philadelphia 2. Arıkan S (2003). Mantar Enfeksiyonlarında Tanı Yöntemleri. Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı (Günalp A, Yılmaz Akyön Y, Pınar A), Hacettepe Üniversitesi Yayınları,

130 Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-14 Parazitoloji Dersin Amacı Dersin Hedefleri Bilgi Tutum Parazitlerin ve tanılarının öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Parazit çeşitlerini öğrenir Parazit incelenmesi ve tanısını öğrenir Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Gerekli Malzemeler Lam Lamel Tahta çubuk Lugol Mikroskop İmmersiyon yağı Gaita örneği Giriş Parazitik yaşamı benimsemiş o tip yaşama uyum sağlamış canlıya parazit denir. Parazitik yaşam ise bir canlının yaşamını üzerinde veya içinde yaşadığı bir diğer canlının zararına sürdürmesidir. Parazitler 1- Protozoonlar: Tek hücreli canlılardır. Bunlarda doku ve organlardan bahsedilmez.katı ve sıvı besinlerle beslenirler. Besinleri absorsiyon, fagositoz ve pinositoz ile alırlar. Hareket organeli olarak kamçı, yalancı ayak veya kirpik bulunur. Protozoonlar eşeysiz üreme, basit ikiye bölünme, tomurcuklanma şekillerinden biriyle ürerler. Eşeyli üreme ise gametogoni ya da konjugasyonla gerçekleşir. Bu grupta 4 şube bulunmaktadır. a. Sarcomastigophora: Bunlar da kamçılılar ve yalancı ayaklar olmak üzere ikiye ayrılırlar. Örneğin Leishmania, Trypanasoma, Giardia, E.histolytica gibi. b. Apicomplexa: Hücre içi parazitidirler. Plasmodium. Toksoplazma, Pneumocystis, Cryptosporidium gibi. 129

131 c. Microspora: Pirimitif ökoryatik organizmalar olarak kabul edilirler. d. Ciliophora 2- Metazoonlar : Bilateral simetrili omurgasız hayvansal parazitlerdir. Solucanlar ve eklem bacaklılar olmak üzere 2 ye ayrılır: A- Solucanlar (Helmintler) 1) Trematodlar: Vücutları yassı yaprak şeklinde tek parçadan yapılmış biri hariç hermafroditdirler. Örnek: Fasciola, Dicrocoelium, Schistosoma gibi 2) Sestodlar: Vücutları yassı halkalardan oluşmuş hermafrodit parazitlerdir. Taenia, H.nana, E.granulosus gibi 3) Nematodlar: Vücutları silindir şeklinde tek parçadan yapılmış yuvarlak solucanlardır. Örnek: Ascaris lumbricoides, E.vermicularis, N.americanus B- Eklem bacaklılar: Vücutları kitinden yapılmış hakiki bir vücut boşlukları olan erkek ve dişileri ayrılmış çoğunlukla ektoparazit olarak yaşarlar. Akarlar ( keneler) gibi ve böcekler ( sivri sinek, bit, pire ) bu gruptandır. Laboratuar Tanısı Parazitozların kesin tanısı ancak laboratuvar incelemeyle konur. 1-Direkt etiyolojik tanı: Bu tip tanıda laboratuvarda dışkı idrar kan balgam vücut sıvıları kazıntı ve otopsi materyalleri fonksiyon ve biyopsi örnekleri incelenir ve bu örneklerden parazit ve parazit örneğin varlığı araştırılır. Dışkı İncelenmesi: Dışkı steril çok temiz yıkanmış kaplar içinde toplanır ve mümkün olduğunca incelemeler için taze olması gerekir. Ayrıca dışkıdaki nem oranının azalması protozoonlarının trofozoitlerinin kist şekillerine dönüşürler. Bu yüzden erken incelenmelidir. Bunun için: a) Direkt preparat hazırlanması: Bir lam üzerine aynı anda biri boyasız biride boyalı ( iyot) iki preparat hazırlanır. Bunu için lamın 1/3 ne yakın yerine %85 lik tuzlu su diğer bir 1/3 kısmına ise 1/5 oranında sulandırılmış iyot eriyiği konur. Bir kürdan ile alınan dışkı ayrı ayrı iki damla içerisinde ezilerek süspansiyon haline getirilir her birinin üzerine birer lamel bırakılır lamellerin etrafı parafin ile çevrilerek kurumaları önlenir daha sonra mikroskobun kondansatörü hafif aşağı olacak biçim de diyafram kısılarak önce 10x daha sonra 40x büyütme ile incelenir. Varsa protozon trofozoit ve kistleri ile helmint yumurtaları görülür. 130

132 b. Yoğunlaştırma yöntemleri: Az sayıda bulunabilecek helmint yumurtaları için 2 türlü yoğunlaştırma uygulanabilir. 1) Çöktürme yöntemi: Bir tüp içerisine yaklaşık 1,5 cm. çapında bir dışkı parçası ve üzerine 10 ml tuzlu su konur ve süspansiyon olacak şekilde karıştırılır. Bu süspansiyondan 10 ml kadar alınarak bir tülbentten başka bir tüpe süzülerek alınır. Daha sonra 2 dak santrifij edilir. Üstteki sıvı dökülür ve dipte kalan sedimente ( ki yaklaşık 1 ml dir) 9 ml formalin eriyiği ilave edilir 5 dakika beklenir üzerine 4 ml etil asetat konur bir dakika santrifüjlenir. Tüpün üst kısmı dökülerek dipte kalan materyalden lam lamel arası preparat yapılarak incelenir. Etil asetat yerine eterde çöktürme yapılabilir. 2) Yüzdürme yöntemi: Doymuş sodyum klorür eriyiği hazırlanır kahve fincanı büyüklüğündeki bir kap içerisine sodyum klorür eriyiği konur üzerine bir parça dışkı ilave edilir. İyice karıştırılarak süspansiyon yapılır. Bir lamel bu sıvının yüzeyine yavaşca bırakılır daha sonra buradan alınarak mikroskopla incelenir. 3) Dışkı preperatlarının boyanması : Trikrom boyanma 4) Seloteyp (selofan bant) yöntemi: E.vermicularis ve Taenia yumurtalarını daha çok perianal bölgeye bıraktıklarından bu amaç için geliştirilmiş pratik bir yöntemdir. Şeffaf olması gereken 5-6 cm uzunluğunda bir parça selofan banttan kesilir ve bu parça bir dil basacağının üzerine öyle katlanarak konur ki yapışkan yüzü, dışta yapışkan olmayan yüzü dil basacağına gelecek şekilde olur. Bu şekilde duran selofan bantın yapışkan yüzleri anüs çevresine çepeçevre dokundurulur. Seloteyp uçlarından tutarak temiz bir lama gergin olarak yapıştırılır daha sonra mikroskopta incelenir. 5) Boyalı preperat yapma: Giemsa 2- İndirekt Etiyolojik Tanı a) Serolojik deneyler: Aglütinasyon, presipitasyon, elisa vb. b) Cilt testler NEMATOD ŞEKİLLERİ Şekil A.lumbricoides larvaları 131

133 Şekil Enterobius vermicularis Şekil Strongyloides stercoralis Şekil Trichuris trichiura 132

134 Şekil Trichinella spiralis larvası kasta SESTOD ŞEKİLLERİ Şekil Hymenolepis nana Şekil Diphyllobothrium latum 133

135 TREMATOD ŞEKİLLERİ Şekil Schistosoma mansoi ve yumurtası Şekil Fasciola hepatica Şekil Paragonimus westermani 134