MOLEKÜLER BİYOLOJİ LABORATUVARI güz dönemi 2. HAFTA GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN FAKÜLTESİ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ

Transkript

1 MOLEKÜLER BİYOLOJİ LABORATUVARI güz dönemi 2. HAFTA GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN FAKÜLTESİ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ

2 MOLEKÜLER BİYOLOJİ LABORATUVARINDA KULLANILAN CİHAZLAR

3 ÇEKER OCAK

4 STERİL KABİN

5 HASSAS TERAZİ

6 PH METRE

7 KARIŞTIRICI

8 VORTEKS

9 DİSTİLE SU CİHAZI

10 EVAPORATÖR

11 AGAROZ JEL ELEKTROFOREZ SİSTEMİ

12 POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZ SİSTEMİ

13 TRANSİLLÜMİNATÖR

14 GÜÇ KAYNAĞI

15 SONİKATÖR

16 MİKROSANTRİFÜJ

17 ULTRASANTRİFÜJ

18 OTOKLAV

19 ETÜV

20 BUZDOLABI

21 DERİN DONDURUCU

22 İKLİM DOLABI

23 MİKROPİPETLER

24 HİBRİDİZASYON FIRINI

25 LİYOFİLİZATÖR

26 SPEKTROFOTOMETRE

27 HPLC

28 THERMAL CYCLER (PCR CİHAZI)

29 DNA İZOLASYONU

30 DNA genetik bilgiyi taşıdığı nükleotidlerin sekansında şifrelenmiş olarak saklayan, fosforik asit ve deoksiriboz ünitelerinin oluşturduğu iki paralel zincirin, pürin ve pirimidin bazlarınca çapraz olarak bağlanması ile ortaya çıkan sağ yönlü sarmal yapıya sahip bir moleküldür.

31 DNA nın genetik materyal olarak tanımlanmasını sağlayan önemli özellikleri; kendini eşleme (replikasyon), bilgiyi depolama, bu bilgiyi ifade etme ve mutasyonla çeşitlenme (varyasyon) dir.

32 NÜKLEOTİD

33

34 DNA nın yapısında bulunan azotlu bazların yapısı

35 DNA nın Watson-Crick modeli

36 Watson ve Crick in 1953 te keşfettikleri DNA modelinin özellikleri 1. İki uzun polinükleotid zinciri, bir merkez eksen etrafında kıvrılarak, sağ-el ikili sarmal yapısını oluşturur.

37 2. İki zincir birbirine antiparaleldir; yani iki zincirin C-5' ucundan C-3' ucuna doğru olan yönleri birbirine göre terstir.

38 3. Her iki zincirin bazları düzlemsel yapıdadır ve düzlemsel eksene diktir; bazlar aralarında 3,4 Å (0,34 nm) mesafe olacak şekilde birbiri ardına istiflenir ve sarmalın içinde yer alır.

39 4. Karşı zincirlerdeki azotlu bazlar hidrojen bağları ile bağlanarak birbirleri ile eşleşirler; DNA da sadece A=T ve C G eşleşmesi mümkündür.

40 5. Sarmalın tam bir dönüşü 34 Å (3,4 nm) dir; böylece her bir dönüşte 10 baz yer alır.

41 6. Molekülün herhangi bir bölümünde; eksen üzerinde sıra ile daha geniş olan büyük oluklar ve daha dar olan küçük oluklar yer alır. 7. Sarmalın çapı 20 Å (2 nm) dur.

42 DNA nın Özellikleri Negatif yüklüdür. Suda çözünebilir. Yüksek asidik veya bazik ortamda bileşenlerine parçalanır. Sıcaklıkla denatüre olur. Yüksek vizkositeye sahiptir. Saflığı; A260/A280=1,8

43 PLASMİD DNA Plasmid DNA; bakteride ve diğer bazı organizmalarda bulunan ve bağımsız olarak varlığını sürdürebilen, çift zincirli, küçük halkasal ekstrakromozomal DNA parçalarıdır.

44 Büyüklükleri 1kb ile 250 kb arasında değişmektedir. Birçok bakteri türünde bulunmaktadırlar. En az bir replikasyon orjini bulundurmaları sebebiyle bakteri kromozomundan bağımsız bir şekilde replike olur ve dölden döle geçerler.

45 Plasmid DNA Tipleri

46 1. Fertilite (F) Plasmidleri tra geni taşırlar ve plazmitlerin konjugual transferini sağlarlar. E.coli deki F Plasmidleri.

47 2. Resistance (R) Plasmidleri Bazı antibiyotiklere dayanıklılık geni taşırlar. Örneğin ampisilin, kanamisin vb. Klinik mikrobiyolojide çok önemlidirler. Ayrıca bu özellikleri deneylerde seçici markır olarak kullanılmalarını sağlar. Pseudomonas taki RP4p plazmiti gibi.

48 3. Bakteriyosin Plasmidleri Bakteriyosinler, bazı bakteriler tarafından sentezlenen dar spektrumlu ve letal etkili proteinlerdir. Bakteriyosinlerin bir kısmı kromozomal olmasına karşın, bazıları da plasmid orijinlidirler. Bakteriyosinler, ancak, kendini sentezleyen türden veya konakçısına çok yakın olan mikroorganizmalara etkilidirler. Örn., E. coli tarafından sentezlenen (col plasmidi sayesinde) colicin (kolisin, bakteriyosin), bunu sentezleyemeyen E. coli'ler ile S. sonnei için letaldir.

49 4. Metabolik Plasmidler Konak bakterinin toluen, salisiklik asit gibi bazı molekülleri metabolize etmesini sağlar. Pseudomonas putida daki Tol plazmitleri gibi

50 5. Virulans Plasmidler Konak bakteriye patojenlik özelliği verir. Dikotiledon bitkilerde tümör oluşturan Agrobacterium tumefaciens bakterisindeki Ti plazmiti gibi

51 DNA İzolasyonu Organizmaların hücre yapılarında bulunan hücre duvarı, hücre zarı gibi yapıların bazı kimyasal maddeler ve enzimler yardımıyla yıkılıp hücre içerisindeki diğer moleküllerin uzaklaştırılmasıyla DNA nın elde edilmesine DNA izolasyonu denilmektedir.

52 DNA izolasyon yöntemleri temelde iki aşamadan oluşmaktadır: 1. Hücre içeriğinin açığa çıkması (lizis) ve DNA nın çözülmesi 2. Enzimatik ya da kimyasal yöntemlerle proteinlerin, RNA ve makromoleküllerin uzaklaştırılması.

53 DNA izolasyonunun temel aşamaları

54 1. Hücresel organellerin açığa çıkması için hücre duvarının kırılması Dondurup çözme (sıvı azot) Bazı kimyasallar (Tris-HCl)

55 2. Hücre zarının parçalanması CTAB veya SDS gibi deterjan özelliğindeki kimyasallar kullanılarak hücre zarı parçalanır ve DNA serbest kalmış olur.

56 3. DNA nın nükleazlardan korunması ve proteinlerden uzaklaştırılması Bu aşamada EDTA maddesi nükleazların kofaktörü olan Mg iyonlarına bağlanır ve bu sayede nükleazlar inaktif hale gelmesiyle DNA korunmuş olur. Proteinlerin uzaklaştırılması için fenolkloroform, amonyum sülfat, sodyum sülfat gibi bazı kimyasallar kullanılmaktadır.

57 4. DNA nın diğer moleküllerden ayrılması Kimyasal yöntem Fiziksel yöntem Etanol Santrifüjleme İsopropanol

58 5. DNA nın tekrar çözülmesi İzole edilen DNA saf su veya Tris-EDTA (TE) tamponu gibi çözücülerde çözülerek saklanabilir.

59 Kaynatma Yöntemi İle Bakterilerden Plasmid Dna İzolasyonu

60 Bakteriler 24 saat 37 C de inkübe edilir. İnkübasyondan sonra bakteri kültürü 1,5 ml lik ependorf tüplerinde santrifüj edilir.

61 Süpernatant kısmı dökülür ve bakteri pelleti üzerine içinde 10 µl lizozim bulunan 200 µl STET çözeltisi (%8 sükroz, %0,5 Triton X-100, 0,05 M EDTA, 0,05 M Tris- HCl, ph 8) eklenir

62 100 C de saniye kaynatılır ve soğutulur.

63 5 dakika santrifüjlenir, süpernatant ayrı bir tüpe alınıp üzerine 480 µl IS karışımı (400 µl isopropanol, 80 µl 5 M amonyum asetat) eklenir.

64 Oda sıcaklığında dakika inkübe edilir. 5 dakika santrifüjlenir, DNA pelleti iki kez %70 lik soğuk etanol ile yıkanır.

65 Etanol uçurulur ve pellet 20 µl Tris- EDTA (TE) tamponu veya steril distile su ile çözülerek +4 C de saklanır.

66 Yöntemde Kullanılan Kimyasalların Kullanım Amaçları Lizozim: Bakteri hücrelerini parçalamak için kullanılır. Sükroz: Osmotik basıncı artırarak hücrelerin daha kolay parçalanmasını sağlar. Tris-HCl: Bakteri hücre duvarını parçalamak için kullanılır.

67 EDTA: Mg iyonlarına bağlanarak nükleazları inaktif hale getirir ve DNA nın parçalanmasını engeller. Triton X-100: Hücre zarının parçalanması için kullanılır. İsopropanol: DNA nın çöktürülmesinde kullanılır.

68 Amonyum asetat: Proteinlerin parçalanması için kullanılır. Etanol: DNA nın çöktürülmesinde kullanılır. Tris-EDTA (TE) tamponu: İzole edilen DNA nın çözünmesinde kullanılır.

69