BCR-ABL M-bcr Real-TM Quant

Transkript

1 Real Time Kit BCR-ABL M-bcr Real-TM Quant REF TR-O1 VER RUO Liste Numarası Kullanılan Semboller Sadece Araştırma çalışması için kullanın 2-8 C de saklayın Dikkat! Lot Numarası Son Kullanma Tarihi VER Versiyon Kullanım Bilgileri Negatif Kontrol Reaktif İçerir Pozitif Kontrol Üretici İSİM BCR-ABL M-bcr Real-TM Quant KULLANIM AMACI BCR-ABL M-bcr Real-TM Quant Real Time PCR ile klinik materyallerde mrna gene abl ve mrna chimeric gen bcr-abl (M-bcr) in kantifikasyonu ve tespiti için bir Real-Time testidir. BCR-ABL M-bcr Real-TM Quant kit M-bcr-abl in kromozomal translokasyonu ile ilişkili CML (kronik miyeloid lösemi) taraması için, CML teşhisini onaylamak için, minimal rezidüel hastalık (MRD) izlenmesi için ve tedavinin etkinliği için kullanılabilir. Bu kit kantitatif tespit için (örnek için 2 tekrarlama) 50 test veya kalitatif tespit (tarama) için 100 test (120 ekstraksiyon, 120 ters transkripsiyonları ve 360 PCR) reaktif içerir. BCR-ABL M-bcr Real-TM Quant kiti toplam RNA ın izolasyonu, cdna da RNA ın ters transkripsiyonu ve real time amplifikasyonu için tüm reaktifleri içerir. Bu kit RotorGene 2000/3000/6000 (Corbett Research), SmartCycler (Cepheid), iq icycler ve iq5 (Biorad), MX3000P ve MX3005P (Stratagene), Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR Systems (Applera) ile kullanılmak için optimize edilmiştir. TEST PRENSİBİ BCR-ABL M-bcr Real-TM Quant üç temel aşamaya dayanır: 1. örneklerden toplam RNA izolasyonu: izolasyon prosedürü Chomczynski tarafından geliştirilen RNA izolasyon yöntemine dayanır. 2. RNA ın ters transkripsiyonu; 3. Oligonükleotidlerin iki karışımlı real time PCR: chimeric gene M-bcr-abl (p210) in mrna amplifikasyonu, füzyon abl ve bcr genlerin (b2a2 ve b3a2) bölgesine ve endojen bir iç kontrol ve gen-normalizer olarak abl genin ("Europe Against Cancer", EAC çalışma grubu tarafından önerilen) yapıştırma bölgesinin bir mrna parçasına karşılık gelir. Amplifikasyon sonucu floresan Yellow /JOE/HEX kanalı üzerinde tespit edilmiştir. Hem endojen ABL kontrolü hem de BCR-ABL m-bcr füzyon cdna'nın bilinen konsantrasyonu ile standart eğri her bir örnekte endojen ABL sinyaline karşı BCR-ABL m-bcr füzyon transkript sinyal oranı ile hesaplanır. Endojen iç kontrolin kullanımı klinik malzeme (normalleştirme) kalitesi ve miktarı hesaba katılarak kimerik mrna bcr-abl gen sayısını saymayı ve analizin tüm aşamalarını izlemeyi sağlar (örnekleme, taşıma, depolama, RNA ekstraksiyon, RNA ın ters transkripsiyonu ve cdna amplifikasyonu ).

2 KİT İÇERİĞİ Part N 1 Ribo-Zol-D : klinik örneklerden RNA izolasyonu; Part N 2 Controls Part N 3 Reverta-L : Part N 4 BCR-ABL M-bcr quant : Real Time kit; Part N 1 Ribo-Zol-D : Solution A, 48 ml; Solution B, 2 x 10,0 ml; Solution C, 48,0 ml; Solution D, 48,0 ml; Solution E, 4 x 1,5 ml; Washing Solution 3, 100 ml; RNA-eluent bcr-abl, 10 x 0,4 ml. 120 ekstraksiyon için gerekli reaktifler içerir. Part N 2 Controls Negatif Kontrol, 2 x 1,2 ml; trna 1 mg/l, 5 x 0,06 ml; Pozitif Kontroller: Pos1 bcr-abl, 0,03 ml; Pos2 bcr-abl, 5 x 0,03 ml Pos1 bcr-abl ve Pos2 bcr-abl bakteriyofaj içeren RNA ın bir membranı tarafından korunan bilinen konsantrasyonlu bcr-abl mrna parçalarıdır. Bu kontroller testin tüm adımlarının kalitesini değerlendirmeyi sağlar. Değerlendirme deney sırasında elde edilen sonuçlar ile, reaktiflerin her lotu için belirtilen Data Sheet, verilen kontrol konsantrasyonların karşılaştırılması ile gerçekleştirilir. Pozitif kontrol 2 her zaman örnek işlem gerçekleştirildiğinde kullanılmalıdır. Reaktiflerin yeni lotu için pozitif kontrol 1 konulmalıdır. Part N 3 Reverta-L : RT-G-mix-1, 10 x 0,01 ml; RT-mix, 10 x 0,125 ml; Revertase (M-MLV), 0,06 ml; TE-buffer, 2 x 1,2 ml. 120 test için reaktifler içerir. Part N 4 BCR-ABL M-bcr quant : PCR-mix-1 M-bcr-abl, 10 x 0,13 ml PCR-mix-1 N-abl, 10 x 0,13 ml PCR-buffer, 10 x 0,3 ml. TaqF Polymerase, 10 x 0,02 ml DNA-buffer (Negatif Kontrol), 2 x 1,2 ml. Standartlar o QS1 bcr-abl/n-abl, 5 x 0,045 ml; o QS2 bcr-abl/n-abl, 5 x 0,045 ml; o QS3 bcr-abl/n-abl, 5 x 0,045 ml; o QS4 bcr-abl/n-abl, 5 x 0,045 ml; o QS5 bcr-abl/n-abl, 5 x 0,045 ml; Standartlar kimerik bcr-abl gen ve abl gen normalizer in cdna içeren plazmid tabanlı örnekleridir. Reaktifler 360 reaksiyon için yeterli reaktif (her PCR-mix-1 ile 180) içerir. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Zone 1: örnek hazırlama: Biyolojik kabin eppendorf tipi tüpler için masa mikrosantrifüj (RCF max. 16,000 x g); Eppendorf 5415D ya da benzeri Kuru ısı bloğu Vorteks mikser Pipetörler Filtre uçları 1,5 ml polipropilen steril tüpler Tek kullanımlık eldiven, pudrasız

3 Atık kabı Buzdolabı, Dondurucu Zone 2: RT ve amplifikasyon: Real Time Thermal cycler Reaksiyon tüpleri Workstation Pipetörler Filtre uçları Tüp rakları UYARILAR VE ÖNLEMLER 1. Solüsyon D, guanidine tiyosiyanat içerir. Guanidine tiyosiyanat solunursa, deri ile temas ederse ya da yutulursa zararlıdır. Asitler ile teması toksik gaz oluşumuna neden olur (Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39). 2. Örnekler ve reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldivenler, laboratuar giysisi ve göz koruyucu kullanın Çalışmalardan sonra ellerinizi yıkayın. 4. Laboratuar çalışma alanında yemek yemeyin, bir şey içmeyin, kozmetik uygulamayın ya da kontak lenslerini ellemeyin. Ağızla pipetleme yapmayın. 5. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın. 6. Farklı kitlerden alınan reaktifleri karıştırmayın. 7. Tüm örnekleri ve kullanılmayan reaktifleri yasal düzenlemelere göre yok edin. 8. Örnekler ve kontrol bir laminer flow içinde hazırlanmalıdır. 9. Heparin inhibe reaksiyonu gösterir. Heparize olan örneklerin kullanımı önerilmez. 10. Reaktiflerin tekrarlanan donma ve çözündürülmesinden kaçının, bu durum testin duyarlılığını düşürebilir. 11. Reaktifler çözündürüldüğünde, tüpleri kısa süre santirifüj edin ve vorteksleyin. 12. Reaksiyon karışımını hızlıca hazırlayın. 13. Örnekler bulaşıcı olabilir. Testi yaparken Evrensel Önlemleri kullanın. 14. Örneklerin veya kontrollerin çapraz kontaminyonunu önlemek için İyi Laboratuar Uygulamaları göre kontroller ve örnekler içeren tüm materyaller yapılmalıdır. 15. Dökülen tüm örnekler ya da reaktifleri 0,5% sodyum hipoklorit ya da uygun diğer dezenfektanlar ile temizleyin. 16. Örnekler ve reaktiflerin deri, gözler ve mukoz membranlar ile temasından kaçının. Eğer bu solüsyonlar ile temas ederse bol su ile yıkayın ve doktorunuza başvurun. 17. Material Safety Data Sheets (MSDS) istenildiğinde verilebilir. 18. Bu kiti ancak DNA amplifikasyon tekniği bilgisi olan kişiler kullanmalıdır. 19. Laboratuardaki iş akışı Ekstraksiyon alanından başlayıp Amplifikasyon ve Belirleme alanlarına doğru tek bir kişinin yönetiminde olmalıdır. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri bir önceki çalışma alanına geri götürmeyin SAKLAMA KOŞULLARI Part N 1,2- Ribo-Zol-D ve Controls +2-8 C de saklanabilir. Solution D, RNA-eluent bcr-abl ve trna -20 C de saklayın. Part N 3,4 - Reverta-L ve BCR-ABL M-bcr quant -20 C de saklanabilir. BCR-ABL M-bcr Real-TM Quant kit 2-8 C de taşınır ama 2-8 C ve -20 C de saklanmalıdır. KARARLILIK BCR-ABL M-bcr Real-TM Quant Test kit etiketi üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabil kalır. ÖRNEK SAKLAMA, TOPLAMA VE TRANSPORT BCR-ABL M-bcr Real-TM Quant aşağıdaki materyallerden Ribo-Sorb-48 (Ribo Virus) ile ekstre edilmiş RNA lar ile analiz edilebilir: Tam kan EDTA tüplerde toplanır. Kullanım öncesi maksimum 48 saat +2-8 C de saklayın g de 20 dakika tüpü santrifüj edin ve yeni tüpe 200 µl buffy coat aktarın. 800 µl Solution D ekleyin. Ters düz ederek karıştırın. Bu numune 1 ay - 20 C de veya 1 yıl -70 C de saklanmalıdır. Tam kan RNA sabitleyici ile tüplerde toplanır (PAXgene (PreAnalytiX). Oda sıcaklığında (18ºC ile 25ºC) en az 2 saat dik şekilde PAXgene Kan RNA Tüpü ve buzdolabına (2ºC ile 8ºC) ya da dondurucuya (-20 º C) koymadan ve ya kullanmadan önce maksimum 72 saat saklayın. PAXgene Kan RNA Tüpü yaklaşık 2 saat boyunca ortam sıcaklığında (18ºC 25ºC) çözün.

4 Kemik iliği aspirasyon 800 µl Solution D ile 200 µl kemik iliği eklenerek hemen kullanılmalıdır. Ters düz ederek karıştırın ve 5000 g de 5 dakika santrifüj edin. Bu numune 1 ay - 20 C de veya 1 yıl -70 C de saklanmalıdır. Kemik iliği RNA sabitleyici ile tüplerde toplandı (PAXgene Kemik İliği RNA Tüpler (PreAnalytiX). PAXgeneBone Marrow RNA tüpler C de 3 gün, 2 8 C de 5 gün veya -20 C de 1 yıl saklanmalıdır. Klinik örneklerin transportu, etiyolojik ajanların transportu için ülkesel, federal, lokal ve yasal düzenlemelere göre yapılmalıdır. ÖNERİLEN ÖRNEK FORMATLARI Reaktiflerin kullanımı optimize etmek için aynı deneyde en az 5 numune test edilmelidir. Aşağıdaki tabloda bir (iki) set reaktif için numune miktarının bir örneğini gösterir. Kantitatif test Tarama (kalitatif) testi Format Bir reaktif seti (34 PCR reaksiyon) İki reaktif seti (68 PCR reaksiyon) Bir reaktif seti (28 PCR reaksiyon) Numune 5 numune 11 numune 10 numune 22 numune 12 ekstraksiyon 24 ekstraksiyon 12 ekstraksiyon (2 tekrarda 5 örnek, (2 tekrarda 11 örnek, (10 örnek, Pos2 bcr-abl RNA Pos2 bcr-abl kontrol Pos2 bcr-abl kontrol kontrol ve Negatif Ekstraksiyon ve Negatif Kontrol) ve Negatif Kontrol) Kontrol) İki reaktif seti (52 PCR reaksiyon) 24 ekstraksiyon (22 örnek, Pos2 bcr-abl kontrol ve Negatif Kontrol) Reverse Transkripsiyon Real Time Amplifikasyon 12 reaksiyon 24 reaksiyon 12 reaksiyon 24 reaksiyon PCR-mix-1 bcr-abl için 18 reaksiyon PCR-mix-1 N-abl için 16 reaksiyon (12 ekstre esilen örnek, her bir miks içinde 1 DNA-buffer, PCRmix-1 bcr-abl için 5 standart ve PCR-mix-1 N-abl için 3 standart) PCR-mix-1 bcr-abl için 36reaksiyon PCR-mix-1 N-abl için 32 reaksiyon (24 ekstre esilen örnek, her bir miks içinde 2 DNA-buffer, PCRmix-1 bcr-abl için 5 standart PCR-mix-1 N- abl için 3 standart) PCR-mix-1 bcr-abl için 14 reaksiyon PCR-mix-1 N-abl için 14 reaksiyon (12 ekstre esilen örnek, her bir miks içinde DNAbuffer, PCR-mix-1 bcrabl için QS5 ve PCRmix-1 N-abl için QS3 ) PCR-mix-1 bcr-abl için 26 reaksiyon PCR-mix-1 N-ab liçin 26 reaksiyon (24 ekstre esilen örnek, her bir miks içinde DNAbuffer, PCR-mix-1 bcrabl için QS5 ve PCRmix-1 N-abl için QS3 ) Tablo 2. Deney için numuneler Bir reaktif seti Part N 3 Reverta-R (RT-mix and DTT) ve Part N 4 BCR-ABL M-bcr quant (PCR-mix-1 M-bcr-abl, PCR-mix-1 N-abl, PCR-buffer, TaqF Polymerase) içerir. ÖRNEK VE REAKTİF HAZIRLAMA Lizis 1. Tam kan EDTA tüplerinde toplanır: Gerekli miktarda 1,5 ml polipropilen tüp hazırlayın. Her bir tüpe 800 µl Solution D ekleyin. 200 µl buffy coat (toplama sonrası 48 saatten daha uzun olmamalı) pipetleyin ve 8-10 kez yavaşça ters düz edin. 2 steril 1,5 ml tüp içine işlenmiş kandan µl ekleyin. 2. Tam kan ve kemik iliği RNA sabitleyici ile tüplerde toplandı (PAXgene (PreAnalytiX): İki 5,0 ml tüp içine 4,5 ml örnek ekleyin. Centrifuge the tubes for 10 min at 5000g de 10 dakika tüpleri santrifüj edin ve dikkatlice alın ve pellete dokunmadan her bir tüpten süpernatantı alın. Her bir tüpe 400 µl Solution D ekleyin. Yeni 1,5 ml etiketli tüplerin içine solüsyonu ekleyin. RNA Ekstraksiyon Her bir örnek için 2 tüpte kantitatif analiz ekstraksiyonu yapın. 1. Aşağıdaki gibi Kontrolleri hazırlayın:

5 C neg ve C pos(1 or 2) işaretli tüplere 400 µl Solution D ve50 µl Negative Control ekleyin. Cpos işaretli tüpüne 10 µl Pos2 bcr-abl (veya Pos1 bcr-abl) ekleyin. 2. Solution D örnekli tüm lizise 40 µl Solution E ekleyin. Vorteksleyin ve 5-7 saniye santrifüj edin. 3. Tüm tüplere 400 µl of Solution A ekleyin. Vorteksleyin ve 5-7 saniye santrifüj edin. 4. Tüm tüplere 130 µl Solution B ekleyin. 1-2 dakika vorteksleyin. 5. Tüm tüpleri -20 C da 10 dakika inkübe edin g de 10 dakika tüm tüpleri santrifüj edin. 7. Her bir örnek için yeni 1,5 ml tüpler hazırlayın ve tüm tüplere 400 µl Solution C ekleyin. 8. Cneg ve Cpos için tüplere 10 µl of trna ekleyin. 9. Solution C li uygun tüplere örnek santrifüj edildikten sonra elde edilen süpernatanttan yaklaşık 400 µl aktarın. Vorteksleyin ve 5-7 saniye santrifüj edin. 10. Tüm tüpleri -20 C da 20 dakika inkübe edin. 11. Tüm tüpleri g de 10 dakika santrifüj edin ve aerosol bariyerli mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 12. Her bir tüpe 400 μl Yıkama Solusyonu 3 ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve g de 10 dakika santrifüjleyin ve tıpalı bir aerosol bariyerli uçlu mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin C de 10 dakika açık kapakla bütün tüpleri 6-7 dakika inkübe edin. 14. Pelleti 30 µl RNA-eluent bcr-abl* içinde yeniden suspense edin. 56 C de 2-3 dakika inkübe edin. 15. Vorteksleyin ve maksimum hızda ( g) 1 dakika boyunca tüpleri santrifüjleyin. Supernatant amplifikasyon için hazır RNA içerir. RNA -70 C de bir yıl saklanabilir. * Eğer diğer RNA ekstraksiyon kiti kullanılacaksa, Ribo-Zol-D kit ile birlikte RNA-eluent bcr-abl ile RNA elüat edin! Reverse Transkripsiyon Protokolü: Reverse Transkripsiyon: 1) Reaktif Miks hazırlayın: 12 reaksiyon için, RT-mix içeren tüplere 5,0 μl RT-G-mix-1 ekleyin ve en az 5-10 saniye vorteksleyin, kısa süre santrifüjleyin. Bu karışım -20 C de 1 ay boyunca stabildir. Reaksiyon Miks olan tüplere 6 μl M-MLV ekleyin, pipetle karıştırın,3 saniye vorteksleyin, 5-7 saniye santrifüj edin (hazırlandıktan sonra hemen kullanılmalıdır). (Eğer 12 örnekten daha az test gerekirse, steril bir tüp içine RT-mix ile 10*N μl RT-G-mix-1 ve 0,5*N μl M-MLV her bir numune için ekleyin) 2)Her bir örnek tüpüne 10 μl Reaksiyon Mix ekleyin. 3) Uygun tüplere 15 μl RNA örneği ekleyin. Pipet kullanarak dikkatlice karıştırın. 4) Tüpleri termocycler içine yerleştirin aşağıdaki sıcaklık profiline ayarlayın: Adım Sıcaklık Zaman 1 50 С 15 dk 2 95 С 3 dk Tablo 3. Reverse Transkripsiyon cdna örnekleri -20 o С de 1 hafta ya da -70 o С de bir yıl saklanabilir. Real Time PCR 1. Reaktifin bir setini çözün, vorteksleyin ve tüpleri santriüj edin. 2. Gerekli miktarda PCR tüpleri (N) hazırlayın: Kantitatif analizler: N = numune cdna* Tarama (kalitatif) analizi: N = numune cdna* Her bir reaktif seti için PCR-buffer 20 µl TaqF Polymerase içeren tüplere ekleyin. Pipetleyerek vorteksleyin. Bu karışım -20 C de 1 ay stabildir. 4. PCR-mix-1 M-bcr-abl tüp içine 145 µl Mix (PCR-buffer ve TaqF Polymerase) ve PCR-mix-1 N-abl tüp içine145 µl Mix pipetleyin. 5. Eğer recommended sample format tablosunda rapor edilenden başka miktarlarda örneğin test edilmesi gerekirse, aşağıdaki hesaplamayı kullanın:

6 Kantitatif test Tarama (kalitatif) testi M-bcr-abl tespit için mix N-abl tespit için mix M-bcr-abl tespit için mix N-abl tespit için mix (N+7)* 7,0 µl PCR-mix-1 M- (N+5)* 7,0 µl PCR-mix-1 (N+3)* 7,0 µl PCR-mix-1 M- (N+3)* 7,0 µl PCR-mix-1 N- bcr-abl (N+7)* 7,5 µl PCR-buffer (N+7)* 0,5 µl TaqF Polymerase N-abl (N+5)* 7,5 µl PCR-buffer (N+5)* 0,5 µl TaqF Polymerase bcr-abl (N+3)* 7,5 µl PCR-buffer (N+3)* 0,5 µl TaqF Polymerase abl (N+3)* 7,5 µl PCR-buffer (N+3)* 0,5 µl TaqF Polymerase 7 = 5 Standards + 1 Neg. Kontrol + 1 margin 5 = 3 Standards + 1 Neg. Kontrol + 1 margin Tablo 4. N örnekleri için reaktif miktarı pipet şeması 3 = 1 Standard + 1 Neg. Kontrol + 1 margin 3 = 1 Standard + 1 Neg. Kontrol + 1 margin 6. M-bcr-abl tespit için 15 µl hazırlanan reaksiyon miks her bir örnek tüpüne ve N-abl tespit için 15 µl hazırlanan reaksiyon miks N-abl her bir örnek tüpüne ekleyin. cdna örnek Standartlar Şema 1. 5 örneğin kantifikasyonu için pipetlenecek reaktif örneği 7. M-bcr-abl mix içeren uygun tüpe 10 µl cdna örnek pipetleyin ve N-abl mix içeren uygun tüpe 10 µl cdna pipetleyin. 8. Her bir kantitatif için çalışma: M-bcr-abl mix 5 standart (QS1, QS2, QS3, QS4, QS5) ve 1 Negative Control (DNA-buffer) için uygun tüplere bu reaktiflerden 10 µl ekleyerek hazırlayın; N-abl mix 3 standards (QS1, QS2, QS3) ve 1 Negative Control (DNA-buffer) için uygun tüplere bu reaktiflerden 10 µl ekleyerek hazırlayın; Her bir kalitatif için çalışma: M-bcr-abl mix 1 standards (QS5) ve 1 Negative Control (DNA-buffer) için uygun tüplere bu reaktiflerden 10 µl ekleyerek hazırlayın; N-abl mix 1 standards (QS3) ve 1 Negative Control (DNA-buffer) için uygun tüplere bu reaktiflerden 10 µl ekleyerek hazırlayın; 9. Tüpleri kapatın ve Real Time PCR cihazına aktarın. Rotor-Gene 2000/3000/6000 in programlanması Sıcaklık Profili: Denature: 95 C 15 dk Döngü 95 C 15 sn 60 C 45 sn Döngü tekrarı 45 kez Floresans 60 C'de JOE (Sarı) kanalı üzerinde ölçülür. New Run Wizard penceresinde Calibrate (Gain Optimization Rotor-Gene 6000 için) butonunu aktive edin. Channel Setting yeni penceresinde Joe (Yellow) kanalını seçin. Min Reading 3, Max Reading 5 görünür ve Perform calibration (Optimization) before 1 st Acquisition fonksiyonunu seçin. iq icycler ve iq5 (Biorad), MX3000P ve MX3005P (Stratagene), Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR system (Applera), SmartCycler (Cepheid)* Programlanması Adım Sıcaklık Zaman Floresans tespit Tekrar min sec sec Joe/HEX 47 *SmartCycler cihazı için PCR-mix-1 M-bcr-abl ile QS3 ve Neg PCR deneyinden elimine edilmelidir ve 2 blok kullanılmalıdır. İlk blokta PCR-mix-1 M-bcr-abl ile tüm testler yapılır ve ikinci blokta PCR-mix-1 N-abl ile tüm testler yapılır.

7 Data Analizleri Sonuçlar, eşik çizgisi ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada Real Time PCR cihazın software ile yorumlanır. cdna M-bcr-abl, PCR- mix-1 M-bcr-abl içeren tüplerde tespit edilir ve cdna gen-normalizer/ internal kontrol (IC) abl PCR-mix-1 N-abl içeren tüplerde tespit edilir. Tarama(kalitatif) formatı PCR-mix-1M-bcr-abl içeren tüplerde eşik çizgisinde bulunan floresan sinyal eğrisi varlığı örnekteki bcr-abl mrna transkript in varlığını gösterir-sonuç pozitiftir. Mix N-abl li gen-normalizer sinyalinin geçerli değerine sahip PCR mix-1 M-bcr-abl de pozitif bir sinyal yokluğu negatif bir sonuç gösterir. Eğer PCR-mixt-1 N-abl içinde eşik döngüsü (Ct) değeri pozitif kontrolün (QS3 bcr-abl/n-abl) Ct değerinden daha az ise, gen-normalizerin sinyali geçerli kabul edilmektedir. Kantitatif format Klinik ve kontrol örneklerinde RNA M-bcr-abl normalleştirilmiş konsantrasyonunun hesaplanması için aşağıdaki formülü kullanın: Konsantrasyon = cdna M-bcr-abl Kopya sayısı / cdna N-abl kopya sayısıl 1. Tüm örnekler için hesap oranı 2. Örneğin iki tekrarı için M-bcr-abl/abl konsantrasyonlarının ortalama değerini hesaplama Sorun Giderme 1. Konsantrasyon abl (gen-normalizer ) değeri kopya/reaksiyon dan daha azdır: örnek geçerli değildir. Analizin ilk aşamasından başlayarak bu örneğin testi tekrar edilmelidir. Tekrarlanan sonuçlarda materyal yeniden örneklenmelidir. 2. Bir örneğin iki tekrarı için M-bcr-abl/N-abl konsantrasyon oranlarının farkı dört kat daha fazladır. (repetition-1 M-bcr-abl/N-abl)/ (repetition-2 M-bcr-abl/N-abl)> 4 yada <0.25 * numuneler dışında M-bcr-abl kopyasını hesaplanan sayısı en az 25 dir. 3. Korelasyon katsayısı R 2 0,98 den daha azdır: tüm örneklerin yeniden test edilmesi gereklidir. 4. Pos1 bcr-abl ve/ veya Pos2 bcr-abl ın hesaplanan konsantrasyonları verilen kontrol konsantrasyonlardan farklıdır, Data Sheet bildirilmiştir:tüm örneklerin yeniden test edilmesi gereklidir. 5. Negatif kontrol için sonuç tablosunda herhangi bir Ct değeri gösterimi reaktifler veya örneklerin kontaminasyonunu gösterir. Tüm örneklerin sonuçları geçersiz sayılır. Tüm örneklerin analizini tekrarlamak ve kontaminasyon kaynağını elimine etmek ve tespit etmek için ölçmek gereklidir. ANALİTİK ÖZELLİKLERİ Analitik duyarlılığı Kit BCR-ABL M-bcr Real-TM Quant duyarlılık değerlendirmesi bilinen konsantrasyonlarda b3a2 (13 ve 14 exon bcr ve 2 exon abl içerir) ve b2a2 (13 exon bcr ve 2 exon abl içerir) faj içeren kontrol RNA kullanılarak yapılır. Bu kontroller DNA-tamponda seri şekilde dilüsyon gerçekleştirir. Bu deneylerlin sonuçları aşağıdaki tabloda özetlenmiştir. mrna in versiyonu Duyarlılık, mrna kopya/extraction Duyarlılık, mrna kopya/ml b2a2 24 (19,5 28,5) 237 ( ) b3a2 48 (37,5 52,5) 474 ( ) Analitik özgüllük Analitik özgüllüğünü 240 örnekte sağlıklı donörlerden alınan kanda değerlendirildi. Tüm örneklerde bcr-abl in sinyali saptanmadığı için iç kontrolün geçerli bir sinyali (gen-normalizer abl) ortaya çıkmadı. Tekrarlanabilirlik ve Çoğaltılabilirlik Konsantrasyon, Ortalama Ct n Ortalama Ct kopya/ml dev. CV% 8.91 * ,51 0,15 0,73 RNA 8.91 * ,27 0,17 0, * ,72 0,24 0,87 DNA 1.82 * ,40 0,10 0,83

8 7.94 * ,58 0,05 0, * ,93 0,15 0, * ,26 0,18 0, * ,93 0,33 1,14 *icycler and iq5 are trademarks of Bio-Rad Laboratories * Rotor-Gene Technology is a registered trademark of Corbett Research *MX3000P and MX3005P are trademarks of Stratagene *Applied Biosystems is trademarks of Applera Corporation * SmartCycler is a registered trademark of Cepheid Sacace Biotechnologies Srl 18 San Carlo str., Caserta, Italy *PCR: The Polymerase Chain Reaction (PCR) process is covered by patents owned by Hoffmann-La Roche and applicable in certain countries. Sacace does not encourage or support the unauthorized or unlicensed use of the PCR process. Use of this kit is recommended for persons that either have a license to perform PCR or are not required to obtain a license