Mikrobiyolojide Moleküler Tanı Yöntemleri. Dr.Tuncer ÖZEKİNCİ Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji A.D

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "Mikrobiyolojide Moleküler Tanı Yöntemleri. Dr.Tuncer ÖZEKİNCİ Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji A.D"

Can Akalın
8 yıl önce
İzleme sayısı:

1 Mikrobiyolojide Moleküler Tanı Yöntemleri Dr.Tuncer ÖZEKİNCİ Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji A.D 1

2 Enfeksiyonun Özgül Laboratuvar Tanısı Mikroorganizmanın üretilmesi Mikroorganizmaya ait antijenik yapıların gösterilmesi Mikroorganizmaya özgü genetik materyalin gösterilmesi Mikroorganizmaya karşı konağın oluşturduğu özgül immun yanıtın gösterilmesi 2

3 Mikroorganizmanın üretilmesi Mikroorganizmaya ait antijenik yapıların gösterilmesi Mikroorganizmaya özgü genetik materyalin gösterilmesi Mikroorganizmaya karşı konağın oluşturduğu özgül immun yanıtın gösterilmesi 3

özgü genetik materyalin gösterilmesi Mikroorganizmaya

4 Nükleik asit tanı testlerinin kullanımı Güç ve yavaş üreyen bakteriler Mycobacterium tuberculosis Legionella pneumophilia Kültürü yapılması riskli bazı bakteriler Francisella tularensis Brucella Canlı olmayan mikrooorganizmalar Kültürün doğrulanması 4

Kültürü yapılması riskli bazı bakteriler Francisella

5 Nükleik asit tanı testlerinin kullanımı Kültürü yapılamayan viruslar Human papilloma virus Hepatitis B virus Örneklerde düşük düzeyde bulunan viruslar Antikor negatif hastalarda HIV Transplant yapılan hastalarda CMV Viral yük tayini : Prognozun değerlendirilmesi Antiviral tedavinin izlenmesi Viral bulaşma riski 5

Antikor negatif hastalarda HIV Transplant yapılan hastalarda CMV Viral yük

6 Nükleik asit tanı testlerinin kullanımı Genotip tayini İnsan kanserleri ile ilişkili spesifik virus genotiplerini tespiti (HPV16) Antiviral ilaç ve antibiyotiklere dirençli suşların tanısı HIV infeksiyonlarında terapiye karar verme Moleküler epidemiyoloji Hastane ve toplumda çıkan salgınların ana kaynaklarının tespiti 6

antibiyotiklere dirençli suşların tanısı HIV infeksiyonlarında terapiye karar

7 Deoksi-ribo-nükleik asit (DNA) C /// G (üç H bağı) A // T (iki H bağı) 7

8 RNA (Ribonükleik Asit) Şeker: Riboz Timidin yerine Urasil 8

9 Nükleik asit tanı teknikleri Hibridizasyon teknikleri Amplifikasyon metodları kadar sensitif değildir. Amplifikasyon teknikleri Sensitivite artırmıştır. Hedef amplifikasyon Polimeraz zincir reaksiyonu; Polymerase chain reaction(pcr) Prob amplifikasyon Sinyal amplifikasyon Bu tekniklerin kombinasyonları 9

Amplifikasyon teknikleri Sensitivite artırmıştır.

10 Nükleik asit tanı teknikleri Hedef amplikasyon PCR - çeşitli mikroorganizmalar NASBA - CMV, HIV-RNA TMA - M.tuberculosis, HCV SDA - C. Trachomatis Prob amplifikasyon LCR Chlamydia Sinyal amplifikasyon bdna - HBV, HCV, HIV 10

11 HİBRİDİZASYON Hibrit = Melez Hibridizasyon: Biribirine karşılık gelen (komplementer) iki n.a. sarmalının (ipçiğinin) birleşmesi İki sarmal yüksek ısıda ve alkali ortamda ayrılır (denatürasyon) 11

12 Nükleik asit Hibridizasyon Testleri Birbirinin karşılığı olan iki nükleik asit dizisinin özgül olarak birleşme özelliğinden yararlanılarak belirli n.a. dizilerinin araştırılması. Klinik örnekte araştırılan mikroorganizmaya ait DNA/RNA = Hedef Araştırılan DNA/RNA ya karşılık gelen (komplementer) DNA / RNA = Prob (işaretli) 12

Klinik örnekte araştırılan mikroorganizmaya ait DNA/RNA = Hedef Araştırılan

13 Klinik örnekten nükleik asit izolasyonu (ekstraksiyon) Serum / plazma Doku örneği (biyopsi) Vücut sıvıları (BOS) Hücreler (lökosit / lenfosit) Sürüntü örnekleri İdrar, dışkı vb. Kültür materyalleri 13

14 Klinik örnekten nükleik asit izolasyonu (ekstraksiyon) Hücre duvarının parçalanması Proteinlerin parçalanması Sıvıda serbest hale geçen nükleik asitlerin saf olarak eldesi Aranan mikroorganizmaya ait nükleik asitlerin araştırılması 14

Sıvıda serbest hale geçen nükleik asitlerin saf olarak

15 İzole edilen n.a.lerin elektroforezi Özgül prob ile hibridizasyon 15

16 Nükleik asit çoğaltma (Amplifikasyon) Yöntemleri Testin duyarlılığını arttırmak amacıyla: Hedef nükleik asitlerin çoğaltılması (polimeraz zincir reaksiyonu: PCR) Sinyal çoğaltma bdna (dallı DNA; branched DNA) 16

nükleik asitlerin çoğaltılması (polimeraz zincir

17 Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR tekniği ilk kez Dr.Kary B.Mullis, tarafından 1983 yılında bulundu. Kimya Dalında Nobel ödülü, 1993 Bilim adamı, yazar, sörfcü 17

18 DNA Polimeraz enzimi ile DNA parçalarının çoğaltılması Amplifikasyon 18

19 Klinik örneklerde PCR Önce nükleik asit çoğaltılması Sonra saptanması Duyarlılık yüksek Klinik örneklerden örn. serumdan nükleik asit izolasyonu PCR (DNA çoğaltılması) Özgül problarla saptama = hibridizasyon 19

20 DNA ipliklerini (sarmallarını) Nasıl birbirinden ayırıp, düzleştireceğiz? DENATÜRASYON YÜKSEK ISI (> C) 20

21 Isıt (95 C) DENATÜRASYON 21

22 Primerleri Nasıl Bağlayacağız? = ANEAL Isıyı Düşür 55 C 65 C 22

23 Oligonükleotidler = Primerler =Öncüller 55 C 65 C primerlerin bağlanması 23

24 DNA ipliklerini Nasıl Uzatacağız? DNA polimeraz enzimi ile (Taq polimeraz; ısıya dayanıklı) Enzim hangi ısıda çalışır? C de 24

25 Taq polimeraz 72 C DNA ipliklerinin uzaması 25

26 PCR Basamakları: Segmentler 1. DNA ipliklerinin ayrılması (95 C) 2. Primerlerin bağlanması (55 65 C) 3. DNA ipliklerinin uzaması (72 C) DÖNGÜ DNA KOPYA SAYISI x 2 26

27 Polymerase chain reaction (PCR) Denaturasyon (95 C ) ve bağlanma (55 C) primer elongasyon: DNA sentezi (72 C) Birinci siklus İkinci siklus Üçüncü siklus 2 molekül 4 molekül 8 molekül EKSPONANSİYEL AMPLİFİKASYON 27

28 Eksponansiyel çoğalma: 2 n n = siklus sayısı Log2 10 siklus = siklus = siklus = döngüde 68 milyar DNA kopyası Teorik olarak ; ideal koşullarda Hayatta hiçbir şey mükemmel değildir!! Plato Siklus sayısı 28

29 PCR aleti: Thermal cycler 29

30 RNA ile PCR yapabilir miyiz? RNA revers transkriptaz enzimi komplementer DNA (cdna) PCR amplifikasyon 30

31 Ürünleri nasıl saptarız? Jel elektroforezi PCR ürünlerinin (cdna) büyüklüğünü biliyoruz. Spesifik problarla (işaretli) hibridizasyon SAPTAMA ( DETECTION ) 31

32 PCR ürünlerinin tespiti Jel elektroforezis Jele konan Ethidium Bromide (5µg/µl) DNA ya bağlanarak DNA bandlarını UV ışığı altında görünür hale getirir. 32

33 PCR ürünlerinin jel elektroforezde tespiti DNA nın yüklendiği kuyular 1000 bp 700 bp 600 bp 500 bp Spesifik DNA sıralarının varlığı için PCR ürünlerinin analizi DNA molekül ağırlık markırları PCR ürünü DNA molekül ağırlık markırları 33

34 KLASİK PCR PCR sonundaki ürünler (amplikonlar) saptanır; analiz edilir. REAL TIME PCR (GERÇEK ZAMANLI PCR) PCR devam ederken ortaya çıkan ürünler saptanmaya başladığı anda değerlendirmeğe alınır. 34

35 sinyal kopya kopya kopya 1000 kopya 100 kopya Ct Döngü sayısı 35

36 Nükleik asit testleri için örneklerin özel koşullarda alınması ve laboratuvara gönderilmesi gerekir. Nükleik asit testlerini uygulayan laboratuvarların özelleşmiş olması gerekir. 36

Benzer belgeler

VİRUS HASTALIKLARINDA TANI YÖNTEMLERİ

VİRUS HASTALIKLARINDA TANI YÖNTEMLERİ Doç. Dr. Koray Ergünay MD PhD Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Viroloji Ünitesi Viral Enfeksiyonlar... Klinik