ELEKTROFOREZ UYGULAMALARI VE KLĐNĐK LABORATUVAR

Transkript

1 ELEKTROFOREZ UYGULAMALARI VE KLĐNĐK LABORATUVAR Vildan 2010

2 Elektroforez, yüklü partiküllerin bir elektrik akımının etkisiyle birbirinden ayrılması işlemidir. Elektroforezin çalışma ilkesi; molekül ağırlığı ve molekülde bulunan elektrik enerjisinin jel içinden bir yükten diğerine giderken katettiği mesafe farklılıklarını ele almaktır.

3 Elektroforezde katedilen mesafe, net yük ile doğru ; molekül büyüklüğü ve elektroforetik ortamın viskozitesi ile ters orantılıdır.

4 Elektroforez için dört şeye ihtiyaç vardır: -iyonların hareket edebileceği uygun bir ortam (destek ortamı) -uygun ph da bir tampon çözelti -elektriksel alanı oluşturmak için doğru akım sağlayacak güç kaynağı -birbirinden ayrılan bantları kantitatif olarak değerlendirebilen dansitometre.

5 Elektroforetik destek ortam, elektrot bölmeleri arasına yerleştirilir.destek ortam, tamponla doğrudan veya fitiller aracılığı ile ilişkilendirilir.her iki tampon tankında elektrot yer alır ve bu elektrotlar güç kaynağına bağlanmak sureti ile devre tamamlanır. Elektroforetik desteğe uygulanan numune, akım uygulandığında göç edecektir. Elektroforez tamamlandıktan sonra, destek ortam boya ile muamele edilerek ayrılmış fraksiyonların identifikasyonu sağlanır. Boyanmış destek ortam dansitometride okunur.

6 Dansitometri absorbans ölçümüdür ve destek ortamdaki boyanın absorbansını ölçer. Dansitometrenin temel bileşenlerini; ışık kaynağı, monokromatör, tüm plağın taranması için hareketli bir taşıyıcı, optik sistem ve fotodetektör oluşturur. Fotodetektörle saptanan sinyaller, numunenin konsantrasyonuyla orantılı olan, destek ortamdaki boyanın absorbansıyla ilişkilidir. Destek ortam sabit bir hızla ışık demetinden geçirilir ve farklı noktalardan alınan çoklu dansite okumalarının sunduğu bir grafik oluşur.

7 ELEKTROFOREZ YÖNTEMLERĐ Poliakrilamid Jel Elektroforezi Agaroz Jel Elektroforezi Değişken Alanlı (Pulsed Field ) Jel Elektroforezi Đzoelektrik Odaklanma Đki Boyutlu Elektroforez Kılcal (Kapiller) Elektroforez Đmmünoelektroforez Đmmünfiksasyon Elektroforezi

8 Poliakrilamid Jel Elektroforezi En yaygın kullanım alanı olan elektroforez tipidir. PAGE; serum proteinlerinin, proteinlerin genetik varyasyonlarının ve izoezimlerin analizinde en iyi sonuç veren elektroforez tipidir. Poliakrilamid jellerle yapılan elektroforez, örnekteki bileşenlerin daha iyi ayrışmasına yol açar. Çünkü ayırım hem moleküler elekleme, hemde elektroforetik harekete dayanır. Jelin ayrıştırma gücü ve molekül boyutu aralığı akrilamid ve bis akrilamid konsantrasyonuna bağlıdır.đki maddenin polimerizasyonu ile jelde porlar oluşur. Düşük konsantrasyonda daha büyük porlar oluşur ve yüksek molekül ağırlıklı moleküllerin analizi yapılabilir.yüksek konsantrasyonlarda ise küçük porlar oluşur ve düşük molekül ağırlıklı moleküllerin analizi yapılır PAGE, tüp veya düzlemsel(slab) jellerde gerçekleştirilir. Düzlemsel(slab) jeller, aynı anda çok sayıda örneğin destek ortamında analiz edilebilmesine imkan verdiği için tüp jellere göre daha geniş çapta kullanılırlar.

9 Poliakrilamid jel elektroforezi: ND PAGE ( non denature edici PAGE ) Proteinlerin doğal (intakt) yapılarını bozucu ajanlar kullanmadan yapılan PAGE yöntemidir. SDS PAGE ( denatüre edici PAGE ) SDS-PAGE ile proteinler, net yük ve şekillerine göre değil, sadece molekül büyüklüklerine göre, birbirinden ayrılırlar. SDS in ( Sodyum dodesil sülfat) bağlanmasıyla, doğal yapısını kaybeden proteinler, aynı şekil ve yük/kütle oranına sahip olurlar. Böylece elektriksel alan içinde proteinlerin hareketi sadece molekül ağırlıklarına bağlıdır. Daha küçük olanlar, daha hızlı sürüklenir. SDS PAGE proteinlerin saflığının kontrolü, molekül ağırlıklarının saptanması ve konsantrasyon çeşitliliğinin belirlenmesi amacıyla kullanılmaktadır.

10 Poliakrilamid jel birbirinden belli uzaklıkta (0,5-2,0 mm)tutulan iki cam tabaka arasında ve genelde 8-10 cm ya da cm boyutunda hazırlanır.dna çalışmalarında daha çok cm boyutunda hazırlanır. Polimerizasyon sırasında jelin üst kısmına yerleştirilen plastik bir tarak jelde küçük kuyucukların oluşumunu sağlar. Polimerizasyondan sonra tarak çıkarılır. Kuyucuklar, tuzları ve polimerize olmamış akrilamidi yok etmek üzere, tamponla yıkanır.jel kaseti iki tampon arasına yerleştirilir;kuyucuklara örnekler konulur ve akım geçirilir. Elektroforez bitiminde görüntüleme için jel uygun boya ile boyanır.

11 Agaroz Jel Elektroforezi Moleküllerin büyüklüklerine göre ayrılabilme özellikleri, jel elektroforezinin pek çok amaç için kullanımına olanak sağlamıştır. Serum proteinleri, hemoglobin varyantları, LDH izoenzimleri, lipoprotein fraksiyonları ve diğer maddelerin analizi için başarıyla uygulanmaktadır. Agaroz jel elektroforez tekniği, moleküler genetik alanında da önemli bir deneysel sistem oluşturmaktadır.

12 Destek ortam olarak kullanılan agaroz, kırmızı bir alg türü olan Agar agar dan izole edilen doğrusal bir polisakkarittir. Agaroz sıcak suda çözünür, soğutulduğu zaman, karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu ile jel yapısı oluşur. Bu oluşum geri dönüşümlüdür. Ticari olarak satılan agaroz tamamen saf olmayıp, diğer polisakkaritler, tuzlar ve proteinlerle birlikte bulunabilir. Bu kirliliklerin oranı, hem DNA'nın jeldeki hareketini etkiler, hemde elektroforezin yanlış sonuçlanmasına neden olur.

13 DNA'NIN AGAROZ JEL ELEKTROFOREZĐ Agaroz Jelin Hazırlanması: Tanklarını doldurmak ve jel hazırlamak için TBE tamponu kullanılmaktadır. Tampon içindeki agaroz eriyene kadar su banyosunda ya da mikrodalga fırında tutulur. Agaroz taneciklerinin mümkün olan en kısa sürede erimesi sağlanmalıdır. Çözelti 60 O C'ye kadar soğutulur. DNA'nın uygulanacağı kuyucukları oluşturmak için cam plakanın yüzeyinden yaklaşık olarak mm yukarıya tarak yerleştirilmelidir. Ilık agaroz çözeltisi kalıbın içine dökülür. Jelin kalınlığı 3-5 mm arasında olmalıdır Jel oda sıcaklığında yaklaşık dakikada donar. Jel donduktan sonra tarak dikkatle çıkarılır ve Jel, elektroforez tankına yerleştirilir.

14 Örneklerin Yüklenmesi ve Yürütülmesi DNA örnekleri, istenen bir jel yükleme tamponuyla (Bromfenol mavisi ya da sükroz), toplam hacim 5-20 ml olacak şekilde karıştırılır. Bu karışım yaklaşık 1 mm derinliğindeki tampon içinde gömülü halde bulunan jelin kuyucuklarına yavaşça yüklenir. Jel yükleme tamponları üç amaç için kullanılırlar; 1-Örneğin yoğunluğunu arttırarak DNA'nın kuyucuğa düzgün olarak damlamasını sağlarlar. 2-Örneği renklendirip, yükleme işlemini basitleştirirler. 3-Elektriksel alanda anoda hızla hareket ederler. Jelin sağ ve solundaki ilk kuyucuklara bilinen büyüklükteki marker DNA'lar yüklenir. Tankın kapağı kapatılır ve elektrik bağlantıları yapılır. DNA, anoda doğru hareket eder. Birkaç dakika içinde bromfenol mavisi kuyucuktan jele geçer. Jeldeki yürütme işlemi bromfenol mavisi uygun uzaklığa ilerleyene kadar sürdürülür. Elektrik akımı kesilir, tel bağlantıları ve kapak çıkarılır

15 Ethidium Bromide requires an ultraviolet light source to visualize Agaroz Jeldeki DNA'nın Boyanması Agaroz jel içindeki DNA'yı, görünür hale getirmenin en uygun yolu, floresan özellikteki Etidium bromür boyasını kullanmaktır. Bu boya DNA ya bağlanır ve UV ışığı altında floresan verir. Böylece jeldeki DNA bandı görünür hale gelir. Etidium bromür kuvvetli bir mutajen ve oldukça toksiktir. Boyama işleminden sonra jel yüzeyi çok koyu boyanmışsa, bantları net görebilmek için jel suya daldırılır ve fazla boyadan arındırılır. Fotograf Çekilmesi Jellerin fotoğrafını çekmek için jeli alttan ya da üstten aydınlatan ultraviyole ışık kaynağı kullanılabilir.

16 Visualizing the DNA (ethidium bromide) wells DNA ladder DNA ladder PCR Product Primer dimers 5,000 bp 2,000 1,650 1, Samples # 1, 4, 6 & 7 were positive for DNA

17 Değişken Alanlı (Pulsed Field ) Jel Elektroforezi 1970 lerin başında, büyük DNA parçaları elektroforez ile yürütülmeye çalışıldı, o güne kadar bilinen metotlar başarılı olmadı. Standart elektroforezde >20 kb DNA, aynı yöndeki sabit akımla yürütülerek, ayrıştırılamadı. Büyük DNA lar için düşük yoğunluklu agaroz jelleri ve düşük voltaj gradienti denendi. Bu şartlarda bile ayrıştırma olmadı.1984 Dr. Schwartzn, peryodik aralıklarla yön değiştiren elektrik alanını, jelde denedi. Sonuçta yüzlerce kb ağırlığında mantar kromozom parçaları ayrıştırıldı. PFGE nin en belirgin farklı, uygulanan elektrik alanının sabit olmaması, ayırma sırasında yönün ve şiddetin tekrarlanan biçimde değiştirilmesidir. Bu teknikte, belli aralıklarla, akım yönü değiştirilir. Büyük DNA parçaları, elektrik akımının farklı açılardan tesiriyle (>90 ), harekete geçip, molekül ağırlıklarına göre ayrışırlar.horizontal elektroforez kullanılarak, çok üyük DNA parçaları (10,000 kb a kadar) jelde yürütülür

18 Đzoelektrik Odaklanma Klasik elektroforezden farklı olarak izoelektrik odaklama, proteinlerin bir ph gradientinde izoelektrik noktalarına göre ayrılması prensibine dayanır. Bu yöntemde; ph gradienti, düşük molekül ağırlıklı amfoterik maddelerin (amfolitler) yardımıyla oluşturulur. Elektroforezde kullanılan tampon sistemi yerine, anotta kuvvetli bir asit, katotta da kuvvetli bir baz kullanılır. Aradaki jel ortamına da gerektiği kadar amfolit solusyonu katılır.sisteme akım verilir ve amfolitler izoelektrik noktalarına göre jelde düzenlenirler. En asidik olan anoda, en bazik olanda katoda doğru ilerler. Bunun sonucu jel içinde anottan katoda doğru azalan bir ph gradienti oluşur Daha sonra örnek proteinler jele uygulanır ve yüklerine göre anoda ve katoda doğru hareket ederler. Proteinler, jel üzerinde net yüklerinin sıfır olduğu ph değerine ( pi ) kadar göç ederler ve bu noktada hareketsiz kalarak dururlar. En son aşamada, protein bantlarının gözlenmesi için boyama yapılır. Fakat boyamanın iyi olması için önce jelden amfolitlerin uzaklaştırılması gerekir. Çünkü amfolitler, jelin tamamen boyanmasına neden olur.

19 Đki Boyutlu Elektroforez 2 boyutlu elektroforez sonuçları, saptanması olası yüzlerce protein piklerinden, önemli tanısal bilginin elde edilmesini olası kılar. Molekülleri, farklı özelliklerine göre birbirinden ayırmayı sağlayan elektroforez yöntemidir. Bu yöntemde; 1. boyutta yüke bağlı IEF kullanılır. Agaroz, poliakrilamid jel gibi büyük porlu bir ortamda gerçekleştirilir ve ph gradyenti elde etmek için amfolitler eklenir. 2. boyutta MA a bağlı SDS-PAGE kullanılır. 2. boyut için lineer veya gradyent şekilli bir poliakrilamid sıklıkla kullanılır. O Farrell in 2 boyutlu elektroforez metodu; 1. boyut için 130 X 2.5 mm lik tüplerde PAGE-IEF kullanır ve 3-10 birimlik ph taki amfolitleri içerir. Elektroforez işleminden sonra jel tüpten çıkarılarak sodyum dodesil sülfat (SDS) içeren ince bir poliakrilamid gradyent jel plağıyla temas haline getirilir. O Farrell metodunda 1. boyut için β-merkaptoetanol, 2. boyut için ise SDS kullanılır. Diğer yazarlar her iki boyut için de SDS kullanmaktadır. Đşlemin sonunda moleküller birçok farklı metottan birisiyle saptanır. Saptama metotları; Amido Black 10B den 3 kez daha sensitif olan Coomassie boyaları, Coomassie boyasından 100 kez daha sensitif olan gümüş boyama, radyografi (izotopik olarak işaretli polipeptidlerin emisyonunun fotoğraf filmlerinde gösterimi) ve florografik analizi (Sintilatör varlığında trityum işaretli olipeptidlerin röntgen filminde gösterilmesi) içerir. Radyografik ve florografik analiz, Coomassie boyasından kez daha sensitiftir.

20 Proteomik için esas metoddur. Bu yöntemde boyamadan sonra jel üzerinde çok sayıda proteinin varlığını gösteren noktalar belirir. Bu noktaların yorumlanabilmesi veya diğer noktalarla karşılaştırılabilmesi için bilgisayar desteğine ihtiyaç duyulur.

21 Kılcal (Kapiller) Elektroforez Fiziki temelleri diğer elektroforezlerle aynı olmasına karşın, teknik ve gerektirdiği ekipman çok farklıdır. Duyarlılığı, test maliyetinin düşüklüğü, otomasyona uygunluğu, test çeşitliliği gibi avantajlarıyla kapiller elektroforez, küçük çaplı (25-75 µm), 100 cm. uzunluğunda fused silika kapiller boru kullanılarak gerçekleştirilen bir yöntemdir. Tipik bir sistem, ince silika kapiller bir boru, iki elektrolit tampon haznesi, bir yüksek voltaj güç kaynağı ve bir veri değerlendirme birimiyle ilişkili detektörden oluşmaktadır. Dar çaplı tüplerde çalışmanın avantajı, diğer elektroforetik yöntemlerde oluşan ısının ortadan kaldırılmış olmasıdır. Normal jeller için kullanılan max voltaj V/cm iken, kapiler elektroforezde 800 V/cm gibi yüksek bir akım uygulanabilir. Böylece DNA yı jelde yürütme süresi saatlerden dakikalara düşer ve oldukça önemli bir zaman kazancı sağlanır.

22 Separasyon işlemi, kapiller boru gerçekleşir ve kapiller aynı zamanda enjeksiyon ve dedeksiyonun da meydana geldigi yerdir. Kapiller, fused ilica kuvartztan yapılmış olup UV ışınlarına geçirgendir. Kırılgan olan bu kapillerin, kırılmasını önlemek için üzeri polimid tabaka ile kaplanmıştır. Poliimid tabakanın, detektör önüne gelen kısmı ya soyularak yada yakılarak bir pencere açılır. Bu pencere, spektrofotometre küveti görevi görür. Elektroforezle ayrılan moleküller bu pencereden geçerken ışığı absorbe ederler. Absorbe edilen ışık detektör tarafından saptanır. Bilgisayar sistemi aracılığı ile absorbsiyon pikleri ekrana verilir. Kapiler Elektroforez ile uyuşturucu maddeler, ilaç etken maddeleri, patlayıcı maddeler, mürekkepler, inorganik anyon ve katyonlar vb. maddeler, adli amaçlarla mükemmel bir şekilde ayrıntılı olarak incelenebilmektedir. Örneğin, mürekkeplerin boyar madde bileşenleri bu teknik ile tek tek ayrılarak, tükenmez kalem mürekkepleri mukayese edilebilir ve her bir boya tanımlanabilir.

23 Đmmünelektroforez Đmmünelektroforez ile hem protein konsantrasyon değişiklikleri, hem de yapı anormallikleri gösterilebilir. Đmmunelektroforez için agaroz jel kullanılır. Đmmünelektroforez analizinde uygulanan ardışık iki işlem vardır. 1- Karışımdaki proteinlerin agaroz jel elektroforeziyle ayrılması 2- Ayrılan proteine karşı antiserum ekleyerek antijenantikor presipitatlarının gösterilmesi. Vücut sıvılarına önce elektroforez uygulanır, sonra göç yönüne paralel olarak antiserum eklenir. Jele diffüze olması sağlanır. Simültane diffüzyon sonrası antijen-antikor presipitasyon bantları oluşur. Presipitasyon bantlarının yapısı ve pozisyonu her bir protein için karakteristiktir. Kontrol serumları ile karşılaştırılır.

24 Immunofiksasyon Elektroforezi (IFE) ĐFE tıbbi araştırmalarda, genetik çalışmalarda ve klinik laboratuvar uygulamalarında tercih edilen bir yöntemdir. Klinik laboratuvar çalışmalarında, hayat bulduğu alan daha çok monoklonal immunglobulinlerin varlığının araştırılmasına yöneliktir. Đmmünfiksasyon elektroforezi iki kademeli bir prosedürdür. 1.Kademe:Agaroz Jelde proteinlerin ayrıştırılması ( Protein Elektroforezi), 2.Kademe: Đmmünopresipitasyon işlemidir. Örnek olarak; serum, idrar, BOS, yada diğer vücut sıvıları kullanılabilir.

25 Đmmünofiksasyon, monoklonal immünglobulinlerin tanımlanması, ayrıca tiplendirilmesi için de kullanılabildiğinden, birçok laboratuvarda alışılagelen Đmmünelektroforezi(ĐEP)nin yerini almıştır. ĐFE in, ĐEP ye göre yaygın kullanılıyor olmasının nedeni işlem aşamasında sağladığı pek çok üstünlükle ilgilidir. -Test sonuçları hızlı bir zaman sürecinde gerçekleşir. Bu süre IFE için ½-2 saat iken, ĐEP için bir gecelik inkübasyondur. - ĐFE oldukça duyarlı bir sistemdir. Monoklonal proteinlerin ayırımını yapar ve tanımlar. ĐFE mg/dl gibi düşük düzeyde olan monoklonal proteinleri kolayca karakterize ederken, ĐEP ancak miktar olarak 1 gr/dl (1000 mg/dl) üzerinde olan proteinleri karakterize edebilir. -ĐFE sonuçlarının değerlendirilmesi, presipitasyon paterninin incelenmesine bağlı olduğundan, ĐEP nin sonuçlarını değerlendirmekten daha kolaydır.

26 ELEKTOFOREZ KULLANIM ALANLARI Saflaştırma Saflık kontrolu Molekül ağırlığı saptama Kalıtsal veya kalıtsal olmayan hastalık saptama Enzim izoezimlerinin saptanması (tanısal amaçlı, populasyon çalışması için,adli tıpta) Đmmünolojik ve moleküler biyoloji

27 Elektroforez, patolojik durumların tanımlanmasında ve takibinde sıklıkla kullanılır. Serumda, dokuda, hemoglobinde ve idrarda, patolojik durumlar sonucunda ortaya çıkan normal olmayan proteinlerin varlığını, normal proteinlerin yokluğunu veya tedavi sırasında hastalığın seyrini izlemek amacıyla kullanılır. Son yıllarda proteomiks teknolojisinin, en önemli yöntemlerinden biri haline gelmiştir. Bu yöntem ile protein miktarlarındaki çok küçük değişikliklerin dahi analizi yapılabilmektedir. Böylece, patolojik durumlarda ortaya çıkan yeni proteinler kolaylıkla tanımlanabilmektedir. Otomatize edilmiş olması nedeniyle, başta kimya, biyokimya,farmakoloji, toksikoloji, adli tıp bilimlerini kapsayan çeşitli bilimsel alanlarda pratik ve yaygın bir biçimde kullanılmaktadır. Yasadışı ilaç kullanımı analizi için de kullanılmaktadır. KE nin, laboratuarlar arası yeterlilik testlerinde yasadışı eroin ve kokain testlerinde son derece güvenilir olduğu kanıtlanmıstır. Saç analizi de adli tıp toksikolojisinde önemli bir uygulamadır ve özellikle yasadısı ilaçlara (uyusturuculara) önceden kronik baglılıgı aydınlatmaktadır. Kapiler analiz; el yapımı patlayıcıların değerlendirilmesi açısından da, patlamadan arta kalan anyon ve katyonların incelenmesini kolaylaştırarak, kullanılan patlayıcı karışımı tipini ve kaynağını saptamaya yardım etmektedir.

28 Serum Protein Elektroforezi Protein elektroforezi, serum proteinlerinin elektriksel ortamda taşıdıkları farklı yüklere göre migrasyonlarıdır. Normal pattern Albumin 47-71% ( g/dl) Alpha-1 globumin % ( g/dl) Alpha-2 globulin % ( g/dl) Beta- globulin % ( g/dl) Gamma globulin % ( g/dl)

29 Serum protein elektroforez fraksiyonları ve bu fraksiyonları oluşturan başlıca proteinler; 1. pre-albumin 2. Albumin 3. alpha 1-Antitrrypsin 4. alpha 1-Acid-Glycoprotein 5. Haptoglobin 6. alpha2 macroglobulin 7. Hemopexin 8. Transferrin 9. Complement 10. Ig

30 Albumin Referans aralık g/dl Hiperalbuminemi dehidrasyon Hipoalbuminemi Azalmış alım, sentez Artmış kayıp: böbrek; nefrotik sendrom, yara, yanık GI sistem; protein-kayıplı enteropati Artmış katabolizma Protein-kayıplı enteropati Azalmış albumin Azalmış gamma globulin Artmış a2-makroglobulin

31 α1-globulin (α1-antitripsin,α1-asit-glikoprotein) Artmış alfa1- globulin, artmış alfa 1- antitripsine bağlı: Đnflamatuar / akut faz reaktanı Azalmış alfa1 globulin, alfa1- antitrypsin eksikliğine bağlı: Alfa-1- antitripsin eksikliği konjenital ya da edinilmiş olabilir. Konjenital alfa-1-anti-tripsin eksikliği amfizem, pankreatik yetmezlik yada siroz ile ilişkilidir. Alfa-1-antitripsin eksikliği

32 α2-globulin (Haptoglobin, alpha2- makroglobulin) Artmış alfa 2-globulin, alfa 2 makroglobuline bağlı: nefrotik sendrom, membranöz glomerulonefrit, hiperlipidemi Azalmış alfa 2-globulin haptoglobine bağlı: hemolitik anemi Akut inflamatuar paternde Azalmış albumin, gama globulin akut faz reaktanlarının artmasıyla ilişkili olarak, artmış alfa-1, alfa-2- globulin. Subakut infeksiyonlarda, maligniteler ve akut kollejen doku hastalıkları C3 düzeyinde artışa bağlı beta artmış. Nefrotik Sendrom Azalmış albumin Artmış α 2 -makroglobulin Azalmış gamma globulin

33 β-globulin (Transferrin, Komplement,IgA) Artmış beta globulin, artmış transferrine bağlı: demir eksikliği anemisi; gebeliğin 3. trimesteri Artmış beta-gamma köprüsü: (IgA ve IgG düzeyindeki artışa bağlı) Sirotik paternde,beta ve gama globulin arasındaki ayrım kaybolmuş. Hepatic cirrhosis Azalmış albumin (sentez) Artmış gamma globulin Beta-gamma köprüsü 46 Yaşında erkek, kronik alkol alımına bağlı son evre karaciğer hastası. Hasta bu örnek alındıktan 5 ay sonra ölmüş.

34 Poliklonal Gammapati Gamma-globulin (IgG, IgM, IgE) Monoclonal Gamapati Poliklonal gammapati genellikle sekonder olarak görülür. Bu hastada (39 yaşında, sarkoizdoz lu erkek) Globulin fraksiyonunda, "sarcoid stepping" olarak adlandırılan ardışık artış görülüyor. Hastanın IFE de M protein, IgG kappa. Tanı multiple myeloma konmuş.

35 Biklonal Gamapati Kilo kaybı ve yorgunluk şikayeti olan 62 yaşında erkek. Multiple myeloma tanısı konmuş. Bu hastalıkta, biklonal gamopati nadirdir, hastaların yaklaşık %1.7 sinde görülür. IFE de 2 M protein, IgG-k ve IgAlamda mevcut.

36 Đdrar Elektroforezi Elektroforez için en az 10 ml idrara ihtiyaç vardır. Bu minimum miktardan, optimal konsantrasyon elde etmek için, idrar örneği konsantre edilir. Đdrar protein elektroforezi proteinürinin değerlendirilmesinde kullanılır. Multiple myeloma şüphesi olan hastalarda, Bence Jones proteinlerinin tesbit edilmesi için tercih edilen bir metotdur. Đdrar elektroforezi, daima serumla birlikte yapılır, böylece sonuçlar direkt olarak karşılaştırılabilir. Normal Range Urine Total Protein ( < 140 mg/24hr ) Urine Albumin ( < 30 mg/24hr

37 24-Hour Urine Protein Electrophoresis Interpretation Chart Normal mild PatternDescription Selective glomerular proteinuria severe Nonselective glomerular proteinuria1 Tubular proteinuria Mixed glomerular and tubular proteinuria Albuminuria >150 Overflow proteinuria from acute phase response Overflow proteinuria with monoclonal spike 1Lookslike serum protein electrophoretogram. + = mildly elevated ++ = moderately elevated +++ = markedly elevated +/- = may or may not bepresent Total Prote in (mg/d) <150 <1500 >1500 >3000 <1500 Albumin Trace to Trace or present Electrophoretic Zones Alpha Trac e /- +/- Alpha Beta +/ Trace (spike) or ++ Gamma ++ Trace of light chain + Trace (spike) or ++

38 Hemoglobin Elektroforezi (ph 8.5) Rutin analizlerde sellüloz asetat membranı,agaroz jel kullanılarak ph 8.5 de uygulanan Hb elektroforezi, oldukça kolay, duyarlı ve hızlı bir yöntemdir. Alkali ph' da, hemoglobin molekülü negatif yüklüdür ve elektriksel ortamda anoda(+) doğru göç eder. Hb'ler molekül başına düşen yük nedeniyle, Hb A ya göre Hb S 2x, Hb C 4x daha fazla yük taşır. Böylece anoda doğru Hb S ve Hb C, Hb A'dan çok daha yavaş hareket eder. Buna ters olarak ; Hb A'dan daha hızlı anoda doğru hareket eden Hb H, I ve J.

39 Hb A (α2β2). Normal erişkin hemoglobini (%94-98) Hb F (α2γ2). Fetüs ve yenidoğanın majör hemoglobini. 2 yıl bittikten sonra, normal çocuklarda % 2 nin altına inmelidir. Hb A2 (α2δ2). Normal erişkin hemoglobinin % Hb elektroforezi, hemoglobin varyantların tanımlanması ve kantifikasyonu için tercih edilen bir metottur. Hemoglobin sentezindeki yapısal anormallikler = Anormal Hb Hb yapısında bulunan, globin zincirlerinin yapısındaki aminoasit değişikliği ile anormal Hb ler veya Hb varyantları oluşur. Hb polipeptid zincirlerinin azalmış sentezine veya yapısal olarak anormal Hb varyantlarına bağlı gelişir. Anormal hemoglobinlerden en sık rastlanılanları: Hb S, Hb C, Hb D, Hb E

40 Pattern of hemoglobin electrophoresis from several different individuals. Lanes 1 and 5 are hemoglobin standards. Lane 2 is a normal adult. Lane 3 is a normal neonate. Lane 4 is a homozygous HbS individual. Lanes 6 and 8 are heterozygous sickle individuals. Lane 7 is a SC disease individual.

41 - C A 2 S F A Barts H + Hb varyantları - A 2 S A + Sickle Cell Anemi - taşıyıcı - A 2 S F A + Sickle Cell Anemi - A 2 A + Normal - A 2 A + Anemi - A Barts + α-talassemi - A 2 F A + β-talassemi

42 HPLC: Normal Adult Hemoglobin HPLC: Sickle cell trait HPLC: Sickle cell anemia (Hgb SS A 0 A1C

43 Hgb SC disease