T.C FIRAT ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ BĠYOLOJĠ BÖLÜMÜ NÜKLEĠK ASĠTLERĠN PCR VE DĠĞER METODLARLA ÇOĞALTILMASI

Transkript

1 T.C FIRAT ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ BĠYOLOJĠ BÖLÜMÜ NÜKLEĠK ASĠTLERĠN PCR VE DĠĞER METODLARLA ÇOĞALTILMASI Hazırlayan: Ekrem AKBULUT Danışman: Yrd.Doç.Dr. Dilek Turgut-BALIK Yüksek Lisans Semineri Biyoloji Anabilim Dalı

2 NÜKLEĠK ASĠTLERĠN POLĠMERAZ ZĠNCĠR REAKSĠYONU VE DĠĞER METODLARLA AMPLĠFĠKASYONU 1-Prob hibridizasyon yöntemleri 2- Nükleik asit amplifikasyon yöntemleri 3- Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) 4- PCR ın temel bileşenleri 5- PCR tipleri 6- Amplifikasyon ürünlerinin tespit edilmesi 7- Moleküler biyolojide PCR uygulamaları

3 Nükleik Asit Çoğaltma Yöntemleri - Nükleik asitlerin in-vitro çoğaltılması ve tespit yöntemleri genel anlamda iki farklı prensip üzerine oturtulmuştur. 1- Prob Hibridizasyon Yöntemleri 2- Nükleik Asit Amplifikasyon Yöntemleri

4 1- Prob Hibridizasyon Yöntemleri * Yavaş üreyen veya üretilemeyen patojenlerin tanısı amacı ile geliştirildi * Problar, oligonükleotitden oluşmuş ve hedef diziye komplementer, dedektör molekülle işaretli tek zincirli DNA veya RNA dizileridir. * Son derece karmaşık ökaryot genomundaki istenen bir gen dizisinin analizine imkan verir. * Mikroorganizmaların DNA larındaki hedef genler, RE ile fragmentasyon ve jel elektroforezi seperasyonu ile tanımlanabilirler. * Direkt materyal çalışmalarında duyarlılık düşük, kültürden tanımlamada oldukça hızlı,

5 Prob Hibridizasyon Yöntemleri * Hedef dizilerin sınırlı sayıda ve bazen de tek olmaları nedeni ile düşük duyarlılık gösterirler. Avantajları ve Dezavantajları * Mycobakteriler gibi kültürü ve identifikasyonu güç olan mikroorganizmaların genom analizi ve tanımlanması kolayca yapılabilir. * Dezavantajları ise bir defa da sınırlı sayıda patojenin işlenebilmesi, yaygın olamayan patojenlerin ön kültürlerinin ve duyarlılık testlerinin yapılması gereği bunu sonucu olarak da işlem süresinin uzun olması. Uygulamaları Mycobacterium avium-intracellulare, Histoplasma capsulatum Cryptococcus neoformas, Streptococcus pneumoniae, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, Chlamydia trachomatis.

6 2- Nükleik Asit Amplifikasyon Yöntemleri - Prob hibridizasyonu ile amplifikasyon - Sinyal amplifikasyona dayalı yöntemler - Hedef amplifikasyon yöntemleri * Transkripsiyon bazlı yöntemler - 3SR (Self-Sustained Sequence Replication) - TMA(Transkripsiyonla Amplifikasyon) - SDA(Strand Displacement Amplification) * PCR (Polymerase Chain Reaction)

7 - Prob Hibridizasyon Bazlı NAA Yöntemleri LCR (Ligase Chain Reaction- Ligaz Zincir Reaksiyonu) * Termostabil ligaz enzimi yardımı ile prob moleküllerinin çoğaltılması esasına dayanır. * Primerlerden amplikonlar üretmek yerine probların amplifikasyonu sağlanır. * LCR da sadece iki primer boyu kadar uzunlukta amplikonlar (ürünler) elde edilebilir. * Teşhis amaçlı çalışmalar açısından PCR dan daha uygundur. * En büyük avantajı yüksek özgüllüğüdür. * Dezavantajı ise kontaminasyon kontrol sisteminin olmayışıdır. * Neisseria gonorrhoeae ve N. meningitidis türü mikroorganizmaların tanımlanmasında oldukça güçlü bir yöntemdir.

8 - Sinyal Amplifikasyona Dayalı Yöntemler * Hedef dizilerin amplifikasyonu yerine üretilen sinyalin güçlendirilmesi esasına dayanır. * Prensip olarak iki prob kullanılır. * Prob hibridizason yöntemlerinden daha duyarlı olsa da NAA yöntemleri kadar duyarlı değildir. * hedef molekül varlığında pozitif sonuç verebilir. Ġki tip modifikasyonu vardır; a) bdna b) Hybrid Capture System

9 - Hedef Amplifikasyon Yöntemleri Transkripsiyon Bazlı Amplifikasyon Sistemleri * DNA bazlı NAA sistemlerinin uygulama ve sonuçların yorumlanması aşamasında ki problemler nedeni ile çok kolay parçalandıkları için kross kontaminasyon riski daha az olan RNA ya yönelik amplifikasyon çalışmaları yapılmıştır. * Sistemlerin ortak prensibi; mrna dan RNA polimeraz yardımı ile başlatıcı özelliği olan primerler varlığında cdna sentezini sağlamak daha sonra cdna ya karşıt gelecek zincirin sentezini yine primerler kullanarak sağlamaktır. Bu işlemler çeşitli şekillerde sağlanabilir. Bunlar; - Transkripsiyonla Amplifikasyon (TAS/TMA) - Self-Sustained Sequence Replication - Strand Displacement Amplification Polimeraz Zincir Reaksiyonu

10 3- PCR (Polymerase Chain Reaction-Polimeraz Zincir Reaksiyonu ) * Hedef nükleik asit dizisinin, başlatıcı özelliği olan iki oligonükleotit primer kullanılarak enzimatik olarak çoğaltılması esasına dayanır. * Ġlk olarak 1985 te Kary Mullis tarafından bulunmuştur. * 1993 te Kary Mullis NOBEL ödülünü kazanmıştır.

11

12 - PCR 3 temel işlem basamağında gerçekleşir; * Denatürasyon: C de 3-5 dakika * Bağlanma (Annealing): C de, 3-5 dakika * Uzama (Extension- Elongation): C de, 2 dakika*

13 Verimli bir PCR için ; - Denatürasyon, - Primerlerin bağlanması, - Primerlerin uzaması, - Döngü sayısı, - Thermal cycler ın iniş-çıkış sürelerinin, optimizasyonu ve standardizasyonu yapılmalıdır.

14 4- PCR ın temel bileşenleri; - Kalıp DNA - dntp ler - Tamponlar - MgCl 2 - Primerler - PCR Enzimleri

15 - Kalıp DNA Tarihsel, patolojik, histolojik materyaller ve küçük DNA fragmenteleri kalıp olarak kulanılabilir.

16 - dntp ler Optimal dntp konsantrasyonu; * MgCl 2 konsantrasyonuna, * Reaksiyon koşullarına, * Primer konsantrasyonuna, * Çoğaltılmış ürünlerin (amplikonların) boyuna, * PCR döngü sayısına,

17 - Mg +2 * Mg +2 iyonları dntp ler ile çözünebilir kompleksler oluşturarak, polimeraz aktivitesini stimüle ederler ve çift iplikçikli DNA nın Tm değerini arttırırlar. * Düşük Mg +2 konsantrasyonu ürün oluşumunda azalmaya neden olurken yüksek Mg +2 konsantrasyonu ise spesifik olmayan ürünlerin birikimine neden olur. * Primer/kalıp etkileşimini sağlarlar. * Optimum konsantrasyon 1,0-1,5 mm * Genelde final Mg +2 konsantrasyonu 2,5 mm olmalı

18 - Primerler nükleotid uzunluğunda hedef diziye komplementer spesifik dizilerdir. Ġdeal primer yapısında; * %50 G+C bulunması * Polipürin, polipirimidin ve tekrar bölgelerinin olmaması * Sadece bir bölgeye spesifik olmaları * Erime ısısı çok düşük olmamalıdır. Tm(Temperature melting: Erime sıcaklığı) değerini hesaplamada; [(A+T lerin sayısı)x2 C + (G+C lerin sayısı)x4 C]

19 Dejenere Primerler * Amino asit sekanslarından primer sekanslarının tahmin edilmesinde, * Bilinen bir gen ailesinin yeni üyelerinin araştırılmasında, * Türler arasındaki homolog genlerin araştırılmasında, kullanılmaktadır. * Düşük kodon dejenerasyonlu amino asitler tercih edilmeli, Nested Primerler * Orijinal olmayan ürünlerin daha ileri düzeyde amplifikasyonunu en düşük seviyeye indirgemek için nested primerler kullanılabilir.

20 PCR Enzimleri - E. coli DNA polimeraz I in Klenow Fragmenti, - Thermus aquaticus, Taq DNA polimeraz (110 kda) - Taq polimerazın 95 C deki yarı ömrü yaklaşık olarak 40 dakika, - 61 kda luk Stoffel fragmenti daha yüksek ısıya dayanıklı, - Stoffel fragmenti geniş Mg +2 iyon konsantrasyonunda aktivite gösterebilmektedir.

21 Yaygın olarak kullanılan PCR enzimleri;

22 Saflaştırılan ve tanımlanan diğer polimerazlar;

23 5- PCR Tipleri; - Multipleks PCR - Hot-Start PCR - Nested ve Semi-Nested PCR - RNA nın Amplifikasyonu (RT-PCR) - Touchdown PCR - In-Situ PCR - Real-Time PCR - Broad-Range veya Consensus PCR - Invers (Tersine dönmüş) PCR - Asimetrik PCR - Homopolimerli PCR

24 - Multipleks PCR * Aynı amplifikasyon reaksiyonunda farklı hedef DNA sekanslarına spesifik multiple primer çiftlerinin kullanılması ile gerçekleştirilir. Multipleks PCR da hedef sekansın koamplifikasyonu ile; * DNA sekansları, yapılarında bulunması muhtemel alterasyonlar (değişimler) yönünden incelenebilir. * Hedef DNA nın, farklı segmentleri araştırılabilir. * Sekansların amplifiye olabilirliklerinin internal (iç-dahili) kontrolleri yapılabilir. * Bir örnekte bulunan değişik ajanlara ait DNA lar aynı tüpte amplifiye edilebilir.

25

26 - Hot-Start PCR * Reaksiyon başlamadan önce primerlerin oda sıcaklığında polimeraz enziminin etkisi ile bazı non-spesifik sekanslar ile özgül olmayan bağlanmalar meydana gelebilir, * Bazı durumlarda da primer oligomerizasyonu, primer kaybı, non-spesifik amplifikasyonlar gibi olumsuz durumları gidermek amacı ile,bazı PCR bileşenlerinin ilk denatürasyon işleminden sonra konulması prensibine dayanır.

27 - Nested ve Semi-nested PCR * Her iki yöntemde iki aşamalı amplifikasyondur. * Tek bir hedef molekül bulunsa dahi, iki aşamalı olarak yapılan amplifikasyonlarda çok sayıda amplikon elde etmek mümkündür. * Pozitif sonuç alma ihtimali arttığı için testin duyarlılığı da artmaktadır. * Önemli bir dezavantajı ise birinci amplifikasyon tüpünden ikincisine örnekler aktarılırken çok az da olsa çevreye örnek saçılması, daha sonraki çalışmalarda hava yolu ile kontaminasyona neden olabilir. * Bu nedenle iki tüp yerine tek tüp fakat iki farklı reaksiyon ısısı kullanılmaktadır.

28 - Touchdown PCR * Optimal primer bağlanma sıcaklığını saptamak amacı ile geliştirilen bu yöntemde, bağlanma sıcaklığı, sikluslar arasında 1-2 C düşürülerek uygun derece belirlenmekte ve bu sıcaklıkta amplifikasyon yapılmakta, * Ġlk siklusta hesaplanan Tm derecesinin 15 C üzeri bağlanma derecesi olarak kullanılmakta, * Takip eden sikluslarda ısı 1-2 C düşürülerek Tm derecesini takriben 5 C üzerine kadar gelinmektedir. * Sonuç olarak hedef bölgeye özgü amplikonlar elde edilmektedir.

29 - RT-PCR (RNA nın Amplifikasyonu) * Ġlk aşama olarak reaksiyon tüpüne dntp ler, anti-sense (downstream) primerler, RNaz inhibitörü, MgCl 2, tampon, su, örnek konularak RT enzimi ile cdna sentezi gerçekleştirilir. * Daha sonra Taq polimeraz, upstream (sense) primerler,pcr tamponu, uygun yoğunlukta MgCl 2 ve su konularak amplifikasyon gerçekleştirilir * RNA viruslerinin ( Hepatitis C, Influenzae virusu, Picorna virusu) PCR ile tespitinde son yıllarda transkriptaz ve polimeraz aktivitelerini birlikte gösteren Tth polimeraz enzimi kullanılmaktadır.

30 - In-situ PCR *Lam üzerine tespit edilmiş patolojik örneklerin amplifikasyonu amacı ile geliştirilmiş bir yöntemdir.

31 6- Amplifikasyon Ürünlerinin Tespit Edilmesi Amplikonların tespiti için uygun metodun seçilmesi; * Hedef veya prob amplifikasyonuna, * Nükleik asidin DNA veya RNA olmasına, * Baz dizisinin heterojenliğine, * Amplifiye ürünlerdeki nadir baz dizisi varyantlarının saptanmasına, * Primer veya problardaki doğal dizilimler dışında yeni baz dizililerinin oluşumuna,

32 Amplifikasyon ürünlerini tespit yöntemleri; Jel Elektroforezi Hibridizasyon Kolorimetrik Mikrotitre Plak Sistemleri Kemilüminesans işaretleme Oligomer Ligation Assay Amplikonların baz dizisi analizi ile tespiti Matriks Hibridizasyon ve DNA Chip Teknolojisi

33 Matriks Hibridizasyon ve DNA Chip Teknolojisi

34 7- Moleküler Biyolojide PCR Uygulamaları - Bakteriyolojide PCR uygulamaları, - Virolojide PCR uygulamaları, - Mikolojide PCR uygulamaları, - Genetik hastalıkların tanısında PCR kullanımı, - Moleküler parazitolojide PCR uygulamaları.

35 - Bakteriyoloji de PCR uygulamaları; Bakteriyoloji de ki tespit yöntemlerinin oluşturduğu problemler; * Bir çok önemli patojen bakteri kültür ortamında üretilememekte veya zor üremektedir. * Bazı patojen mikroorganizmaların kültüre dayalı tanısı uzun zaman almakta ve tedavinin gecikmesine neden olmaktadır. * Bir organizmaya ait bazı fenotipik karakterler laboratuvar koşullarında değişime uğrayabilmektedir. Örn: Meningokoklar ilk izolasyonlarında maltoz negatif iken pasajlarında maltoz pozitif olabilmektedirler. * Belirli bir fenotipik karakter birçok değişken gen tarafından oluşturulabilir. Bu durumda genetik olarak farklı organizmalar tek bir organizma gibi davranır.

36 PCR ın bakteriyoloji de yaygın olarak kullanıldığı alanlar; * Tanıda süreyi kısaltmak ve kültürü yapılamayan bakterilerin oluşturduğu infeksiyonları tanımlamak. * Antibiyotik almış hastalarda veya stoklanmış örneklerde tanı koyma. * Bakterilerin toksikojenik suşlarının ayırt edilmesi. * Ġnvaziv olmayan metodlar kullanarak erken tanı koyma. * Antimikrobiyal direncin saptanması. * PCR ın tiplendirmede kullanılması.

37 - Viroloji de PCR Uygulamaları * Hedef ve sinyal amplifikasyonuna dayalı testler kullanılır. * Hedef amplifikasyonu testlerinde viral ajanın genetik materyali,pcr, RT-PCR, hot-start PCR, arbitarily primed PCR, Real Time PCR, Multipleks PCR, Multipleks RT-PCR, nested ve semi-nested PCR, TMA, nükleik asit dizilim temelli amplifikasyon (NASBA) ve LCR gibi yöntemlerle çoğaltılır. * Özellikle, HIV, Hepatitis B ve C, Herpes simplex virus (HSV), Parvovirus B 19 enfeksiyonlarının tanısında, * Papilloma virus lerin ve Influenza virus A,B,C nin tiplendirilmesi ve tanısında, * Rotavirus, Adenovirus, Enterovirus, Cytomegalovirus, Rubella, Parainfluenza, Norwalk virus gibi bir çok virusun oluşturduğu enfeksiyonların tanısında PCR yaygın olarak kullanılmaktadır.

38 - Mikoloji de PCR Uygulamaları Cryptococcus neoformas, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatidis, Pneumocystis carini, Candida albicans, Coccoides immitis

39 Genetik Hastalıkların Teşhisinde PCR Uygulamaları - Orak hücre anemisinin tanısında - Hemofilia - Cystic fibrozis - Muscular dystrophy -Genetik hastalıkları doğum öncesi tespitinde - RFLP (Restriciton Fragment Lenght Polymorphizm) ve PCR uygulamaları birlikte genetik hastalıkları teşhisinde başarılı sonuçlar vermiştir.

40 - Parazitoloji de PCR Uygulamaları * Parazitoloji ve alt dallarında; tanı tedavinin takibi ve epidemiyolojik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. * Protozoonlardan Leishmania lar, Trypanasoma lar, Toxoplasma, Entemoeba, Giardia cinsleri ile Trematodlar, Cestodlar ve Nematodların teşhis ve tür ayırımının yapılmasında.

41

42 Malaria konusunda başlıca iki önemli açığı kapatmıştır: - P. falciparum un mutasyon nedeni ile gösterdiği ilaç dirençlerinin belirlenmesi - P. vivax a karşı yapılan aşı çalışmalarında büyük öneme sahip circumsporozoite proteininin farklı olduğu bazı varyant formların saptanmasıdır. Plasmodium ların küçük alt ünite rrna ları hem cinse hem de türe özgü sekanslar içermektedir.

43 Plasmodium falciparum un şu anda var olan antimalariallara karşı olan direnci yeni ilaçların geliştirilmesini gerekli kılmıştır. Bu amaçla P. falciparum un laktat dehidrogenaz enzimi (PfLDH) yeni antimalarialların bulunması için hedef enzim olarak seçilmiştir. Parazit, bu enzim sayesinde glikolizin son ürünü olan pürivik asidi dönüşümlü bir reaksiyonla laktik aside çevirmektedir. Plasmodial LDH in elektroforetik, kinetik ve yapısal olarak konukçu enziminden farklı olduğu gösterilmiştir. LDH geni P. falciparum soyları olan K1 ve PF FCBR dan klonlanmış, protein üretilmiş ve enzimin üç boyutlu yapısı belirlenmiştir.parazit LDH inde bulunan fakat insan LDH inde bulunmayan ilave 5 aminoasidi varlığı tespit edilmiş olup, bu 5 rezidü ilavesinin enzimin yüzeyinde bir halka oluşturduğu ve bölgenin de enzimin aktivitesini engelleyecek bir inhibitörün yapıya katılması için ideal bir bölge olduğu tespit edilmiştir.

44

45 Glaxo Wellcome ın işbirliği ile yeni bir antimalarial bulma denemeleri sürdürülmektedir. P. falciparum ve P. vivax aynı genusa ait türler oldukları için bu türlerin LDH enzimleri arasındaki benzerliğin yüksek olması beklenmekte, dolayısıyla aynı yaklaşımın P. vivax a uygulanmasının başarılı sonuçlar vereceği beklenmektedir.

46 TC FIRAT ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ BĠYOLOJĠ BÖLÜMÜ NÜKLEĠK AĠTLERĠN PCR VE DĠĞER METODLARLA ÇOĞALTILMASI Hazırlayan: Ekrem AKBULUT Danışman: Yrd. Doç. Dr. Dilek TURGUT BALIK Yüksek Lisans Semineri Biyoloji Anabilim Dalı

47

48 bdna

49 TMA (Transkripsiyonla Amplifikasyon)

50 Transkripsiyon ile Amplifikasyon - Hedef DNA ya T7 promotor sekansı taşıyan oligonukleotid primerler (primer 1) bağlanır. - RT enzimi ile RNA ya komplementer cdna sentezlenir. - Oluşan DNA/RNA heterodupleksi denatürasyon ile birbirinden ayrılır. - Ortama primer 2 ilavesi ile ssdna üzerindeki hedef bölgeye bağlanan primer T7 RNA polimeraz başlatıcı bölgesi olan ds DNA oluşur. - T7 RNA polimeraz ds DNA üzerindeki promotor bölgeye bağlanarak DNA dan çok sayıda RNA molekülünün amplifikasyonu sağlanır. HIV-1 RNA sının amplifiye edilmesinde kullanılmıştır.

51 Self-Sustained Sequence Replication - TAS ın bir modifikasyonudur. - Denatürasyon, ısı ile değil de, E. coli RNaz H enzimi ile sağlanır. - Oluşan RNA/cDNA heterodupleksindeki RNA, RNaz H ile parçalanarak cdna elde edilir. - cdna promotor bölgesine bağlanan primer 2,RNA polimeraz ile uzatılarak ds cdna oluşur. - HIV in tespitinde kullanılmış ve duyarlılığı PCR a yakın olarak saptanmıştır (3SR %93, PCR %95).

52 G C U G C C G C A G C G Alanin N Phe Arg Arg Alanin

53 C U U C U C C U A C U G Leu U U A U U G

54 In-Situ PCR - Morfolojikolarak sağlam doku ve hücrelerin DNA sını amplifikasyonu esasına dayanır. - Lam üzerine tespit edilen örnek; 1- Kurutulur, 105 C de 30 saniye bekletilir. 2- Paraformaldehitli fosfat tamponlu tuzlu su (%2 lik) ile bir saat işleme alınır. 3-3x0,1 M PBS ile bir defa, 1x0,1 M PBS ile üç defa yıkanır. 4- Proteinaz K enzimi (5 g/ml) ile 55 C de iki saat bekletilir. 5- Daha sonra 96 C de iki dakika tutularak proteinaz K inaktive edilir 6- Lam su ile yıkanır, havada kurutulur. 7- Lam üzerine amplifikasyon solüsyonu eklenir, plastik kapakla kapatılır, etrafı alüminyum kağıt ile çevrilir. 8- Amplifikasyon sonrası absolute etil alkol içerisinde 3-5 dakika tutulur. 92 C de 30 saniye denatürasyon sağlanır. 9-2xSSC (Sodyum klorür+sodyum sitrat) tamponu ile yıkanır.

55

56

57 Dot-blot hibridizasyon

58 Kolorimetrik mikrotitre plak sistemlerinin geleneksel yöntemlere göre üç önemli avantajı vardır; 1- PCR ürünlerini tespit duyarlılığı, agaroz jel boyamasına göre kat daha fazladır. 2- Kullanılan capture prob PCR ürününe spesifik olduğu için testin duyarlılığı artmıştır. 3- MTP sistemi, 96 kuyucuklu Thermocycler ile kombine edilerek kullanıldığında aynı zamanda bir çok örneğin kısa sürede incelenmesine imkan verir.

59

60 3- Hedef Amplifikasyon Yöntemleri *Transkripsiyon Bazlı Amplifikasyon Sistemleri - Transkripsiyonla Amplifikasyon (TMA/TAS) - Self-Sustained Sequence Replication (SSSR-3SR) - Strand Displacement Amplification (SDA) * PCR (Polymerase Chain Reaction)

61 Real-Time PCR

62 RT-PCR