Tümör Nekrozis Faktör İle İlişkili Apoptozis İndükleyici Ligand (TRAIL) ve Epoxomicin in Osteosarkom Hücrelerinde Apoptozis Üzerine Etkileri

Transkript

1 Tümör Nekrozis Faktör İle İlişkili Apoptozis İndükleyici Ligand (TRAIL) ve Epoxomicin in Osteosarkom Hücrelerinde Apoptozis Üzerine Etkileri Effects of TNF-related Apoptosis Inducing Ligand (TRAIL) and Epoxomicin on Apoptosis in Different Types of Osteosarcoma Cells Prof. Dr. Tomris ÖZBEN Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı Antalya Turkey

2 Osteosarkom Osteosarkom mezankimden kaynaklanan ve en sık görülen primer malign bir kemik tümörüdür. İnsidansı milyon kişide 4-5 olup en yüksek pik insidansını 18 yaşında göstermektedir. Hastaların yaklaşık %60 ı 25 yaşın altındadır.

3 Osteosarkom Osteosarkomun etiyolojisi tam olarak aydınlatılamamıştır. Ancak risk faktörleri olarak aşağıdakiler öne sürülmektedir: Hızlı kemik büyümesi Radyasyon Paget hastalığı gibi anormal kemik gelişmesi Kronik osteomiyelit, metal protez varlığı

4 Osteosarkom Tedavisi Günümüzde osteosarkom tedavisindeki tedavi protokolü kemoterapi ve uzuv koruyucu cerrahidir. Kemoterapideki son gelişmelere rağmen kemoterapötik ilaçlara karşı varolan veya sonradan kazanılan direnç tedavinin başarısızlığına yol açmaktadır. Kemoterapötiklerin normal doku ve organlara sitotoksik etkileri de çok önemi bir dezevantajdır. Doxorubicin (kardiotoksisite) Cisplatin (nefrotoksisite) Vincristine (periferal nöropati) Methotrexate (megaloblastik anemi, pansitopeni) Dactinomycin (miyelosupresan) en sık kullanılan kemoterapötik ilaçlar ve majör yan etkileri

5 Yeni Tedavi Yöntemleri Metastazı olmayan ve cerrahi olarak tüm lezyonu çıkartılmış kemoterapi alan hastalarda 5 yıllık yaşam yüzdesi %60-70 e yükselmiştir Cerrahi ve kemoterapiye rağmen hastalığın nüksü ve metaztaz nadir değildir. Kemoterapiye dirençli osteosarkom hastaları için yeni, daha güvenli, yan etkileri daha az ve daha efektif antikanser tedavilerinin geliştirilmesine ihtiyaç vardır.

6 Apoptozis, çok hücreli organizmalarda organizmanın yararı için belirli hücrelerin ölümü ve uzaklaştırılma işlemidir. Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H. And Currie, A.R Br. J. Cancer 26:239. programlı hücre ölümünü tanımlamak için kullanılmıştır. apo =ayrı, ptosis =düşmek kelimelerinin birleşmesiyle oluşmuştur Apoptozis kelimesi ilk kez Homeros tarafından sonbaharda yaprak dökümünü tanımlamak için kullanılmış bir sözcüktür.

7 Apoptozis Apoptozis, yaşlanmış, hasarlı ya da gereksiz hücrelerin organizmadan uzaklaştırılmasına olanak sağlayan ve genetik olarak kontrol edilen programlı hücre ölümüdür. Apoptozis, hücre değişimi, doku yenilenmesi ve hasarlı hücrelerin uzaklaştırılması için gerekli normal bir fizyolojik mekanizmadır.

8 Apoptozis ve Malignite Malignite, protoonkogenlerde, tümör supresör genlerde, apoptozisi düzenleyen genlerde ve DNA onarım genlerinde meydana gelen mutasyonlar sonucu ortaya çıkar. Bu mutasyonlar sonucunda büyüme sinyallerinin kendiliğinden üretilmesi, büyüme baskılayıcı sinyallerin inhibisyonu, hücrenin apoptozise girememesi ve apoptozis mekanizmasının bozulması sonucu hücrenin sonsuz replikasyon yeteneği kazanması malignite oluşumunun temel mekanizmalarını oluşturur.

9 Apoptozis Figure 1-12, Page 15, Basic Pathology By Kumar, Cotran & Robbins, 6 th Ed.

10 Apoptozisin Ölüm Reseptör (Ekstrinsik) ve Mitokondrial (İntrinsik) Yolakları TNFa Fas L Cell stress: oxidants TNFR1 Fas/CD95 Death domains Caspase-8 Effector caspases (e.g. caspase-3) Mitochondrion Cyt c MPT Bax/BcL2 Apaf-1 Cyt c Procaspase-9 Apoptosome Caspase-9 APOPTOSIS

11

12 Ölüm reseptörleri, ekstraselüler ölüm sinyallerininin varlığını algılarlar ve saatler içinde hücrede apoptozise yol açacak kaspazları aktive ederler. İntrinsik yolakta, mitokondriden sitokrom c salınımı apoptozisi indükler ve bu yolak hücre yüzey reseptörleri ile ilişkili değildir. Sitoplazmada kaspaz-3 tarafından inhibitöründen ayrılan, kaspaz bağımlı endonükleaz, nükleusa girer ve DNA yı oligonükleozomal fragmanlara (180bp) parçalar.

13 Tümör Nekrozis Faktör (TNF) İle İlişkili Apoptozis İndükleyici Ligand (TRAIL) Tümör Nekrozis Faktör (TNF) ailesinin bir üyesidir. İlk kez 1995 yılında tanımlanan 281 amino asidden oluşan bir proteindir. TRAIL in 5 reseptörü vardır: iki ölüm reseptörü, üç tuzak, yalancı (decoy) reseptörü. Ölüm reseptörleri (DR): ölüm reseptör-4 (DR4; TRAIL- R1) ve ölüm reseptor-5 (DR-5 ;TRAIL-R2). Üç tuzak, yalancı (decoy) reseptör ise TRAIL-R4, TRAIL- R5 and osteoprotegerin.

14 Tümör Nekrozis Faktör (TNF) İle İlişkili Apoptozis İndükleyici Ligand (TRAIL) TRAIL in ölüm reseptörlerine bağlanması ekstrinsik yolağı aktive ederek hücre ölümünü başlatır. TRAIL in TRAILR1/DR4 or TRAIL-R2/DR5 reseptörlerine bağlanışını, reseptor trimerizasyonu ve intraselüler Fasassociated death domain (FADD) aktivasyonu takip eder. Reseptör aktivasyonu en sonunda kaspaz aktivasyonlarına ve apoptozise yol açar.

15 TRAIL Reseptörleri (TRAIL-R1-DR4; TRAIL-R2-DR5) ve Eksternal Apoptozis Yolağı Ligand - Apo2L TRAIL receptor (DR5) Death domain, DD Adaptor Initiator Caspase Effector caspases Apoptosis

16 Kanser tedavisinde klinik araştırmalarda kullanılan kemoterapötik ajan güçlü anti-tümoral aktivite normal hücre ve dokulara minimum toksisite Rekombinant insan TRAİL (rhtrail) ve agonistik monoklonal DR4, DR5 antikorları ile Faz I ve Faz II çalışmaları yürütülmektedir.

17 İleri solid kanserlerde uygulanantrail tedavisinin iyi tolere edildiği ve 15 mg/kg TRAİL dozuna kadar doz sınırlayıcı toksisite görülmediği bildirilmiştir (Bellail et al., 2009). TRAİL agonisti monoklonal antikorların (Mab) güvenilirliği, farmakokinetik ve terapötik etkinliklerinin araştırıldığı Faz I ve Faz II çalışmaları devam etmektedir.

18 Son çalışmalar TRAİL in kanser hücrelerinin öldürülmesinde çok önemli bir pro-apoptotik ajan olduğunu ve kanser metastazlarının tedavisinde de etkin olduğunu göstermiştir. TRAİL kullanımının yaygınlaşmasını kısıtlayan en önemli faktör bazı kanser tiplerinin TRAİL e dirençli olmalarıdır. Bu direnci yenmek için TRAİL in diğer kemoterapötik ajanlarla ve proteozom inhibitörleri ile birlikte kullanıldığı araştırmalar yapılmaktadır.

19 Ubikitin-Proteazom Ubikitin-proteazom, intraselüler protein yıkılımının ana yolağıdır. Ubikitin-proteazom, multi-katalitik bir proteinaz kompleksi olup, yıkılamadıkları takdirde apoptozise yol açacak olan okside olmuş ve hasara uğramış proteinlerin intraselüler degradasyonundan sorumludur.

20 Ubikitin, 76 aminoasit içeren bir protein olup hedef substratlara ubikitin aktifleştirici enzim (E1), ubikitin konjuge edici enzim (E2) ve ubikitin ligaz (E3) denen 3 enzimin sırasıyla etkinleşmesi ile bağlanan ve onları proteoliz için proteazom kompleksine yönlendiren küçük bir hücresel proteindir. Substrat proteinin 26S proteazomal yıkıma yönlendirilebilmesi için en az dört ubiquitin molekülünden oluşan bir poliubiquitin zinciri ile bağlanmış olması gereklidir. Proteazom kompleksi (26S), hücre siklüsünün regülasyonunda ve ubikitin tarafından işaretlenen proteinlerin yıkımında önemli rol alan bir proteaz kompleksidir ve okside olmuş, yapısı bozulmuş hücresel proteinleri aminoasit bileşenlerine kadar parçalayarak protein turnoverini sağlar. J.CellCommun.Signal.(2011)5: DOI /s

21 Kanser Tedavisinde Proteazom inhibitörleri Ubikitin-proteazom yolağını proteazom üzerinden inhibe eden proteazom inhibitörleri anti-kanser tedavisinde güçlü bir strateji olarak ortaya çıkmışlardır. In vitro araştırmalar proteazom inhibitörlerinin anti-kanser ajanları olarak potansiyelini ortaya koymakla beraber, araştırmalar bu ajanların çoğunun etkilerinin laboratuvar çalışmaları ile sınırlı olduğunu, yeteri kadar güçlü, spesifik ve stabil olmadıklarını göstermiştir. Bunun sonucunda daha güçlü ve spesifik aktiviteye sahip yeni proteazom inhibitörleri geliştirilmiştir.

22 Epoxomicin Bortezomib/PS (Velcade), Amerikan Food and Drug Administration (FDA) tarafından Multiple Myeloma hastalarında kullanılmak üzere 2003 yılında onaylanmıştır C 28 H 50 N 4 O 7 Epoxomicin (carfilzomib) ise 2012 yılında onaylanan proteazom inhibitörüdür.

23 Epoxomicin ve TRAİL Literatürde proteazom inhibitörlerinin birçok kanser tipinde TRAİL hassasiyetini arttırdığını bildiren çalışmalar vardır. MG-63 and Saos-2 gibi birçok osteosarkom kanser hücrelerinin TRAİL ın apoptozisi indükleyici etkisine karşı dirençli olduğu tespit edilmiştir. Literatürde Epoxomicin in osteosarkom hücrelerindeki etkilerini ve TRAİL hassasiyeti üzerindeki etkisini araştıran bir çalışmaya rastlamadık. Bu nedenle Epoxomicin in TRAİL e dirençli MG-63 ve Saos-2 osteosarkom hücre dizilerinde apoptozis ve hücre sitotoksisitesi üzerindeki etkilerini ve Epoxomicin in TRAİL hassasiyetini arttırıp arttırmadığını araştırdık.

24 Farklı dozlardaki TRAIL ile 24, 48 ve 72 saat inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücrelerinin % canlılığı. Saos-2 ve MG-63 hücreleri farklı konsantrasyonlardaki ( ng/ml) TRAİL ile 24, 48, ve 72 saat inkübe edildi. Hücre canlılığı kolorimetrik MTT (3-(4,5) dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide) deneyi ile belirlendi.

25 Farklı dozlardaki TRAIL ile 24, 48 ve 72 saat inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücrelerinin % canlılığı. TRAIL ile inkübe edilmeyen Saos-2 ve MG-63 kontrol hücrelerinin hücre canlılığı %100 olarak kabul edildi. Değişik dozlarda TRAIL ile inkübe edilen hücrelerin canlılığı kontrol hücreleri ile karşılaştırılarak belirlendi. Saos-2 hücreleri MG-63 hücrelerine göre TRAİL e daha dirençli idi. En yüksek TRAİL dozu olan (1000 ng/ml) ile 72 saat inkübe edilen Saos-2 hücrelerinin canlılığını ± 7.57% (ortalama±sd) olarak bulduk. 100 ng/ml TRAİL ile 24 saat inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücreleriniin hücre canlılığında kontrol hücrelerine göre %10-15% oranında belirgin azaldı (P<0.01).

26 Farklı dozlardaki Epoxomicin ile 24, 48 ve 72 saat inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücrelerinin % canlılığı. Saos-2 ve MG-63 hücreleri farklı konsantrasyonlardaki Epoxomicin ( nm) ile 24, 48, ve 72 saat inkübe edildi. Hücre canlılığı kolorimetrik MTT (3-(4,5) dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) deneyi ile belirlendi. Epoxomicin ile inkübe edilmeyen Saos-2 ve MG-63 kontrol hücrelerinin hücre canlılığı %100 olarak kabul edildi. Değişik dozlarda Epoxomicin ile inkübe edilen hücrelerin canlılığı kontrol hücreleri ile karşılaştırılarak belirlendi.

27 % Cell Viability MG h 48 h 72 h Epoxomicin (nm) Epoxomicin in MG-63 hücre canlılığı üzerindeki LD 50 (kanser hücrelerinin %50 sini öldüren doz) dozunu, 24, 48, and 72 saatlik inkübasyonları takiben sırasıyla 272 nm (%95% confidence interval (CI); ), 124 nm (CI; ) ve 12 nm (CI; 3-44) olarak bulduk.

28 % Cell Viability Saos-2 24 h 48 h 72 h Epoxomicin (nm) Epoxomicin in Saos-2 hücre canlılığı üzerindeki LD50 (kanser hücrelerinin %50 sini öldüren doz) dozunu, 24, 48, ve 72 saatlik inkübasyonları takiben sırasıyla 355 nm (CI; ), 255 nm (CI; ) and 7 nm (CI; 2-30) olarak bulduk.

29 TRAIL ve Epoxomicinin tek ve Kombine Dozlarının Sitotoksisitesi Saos-2 ve MG-63 OS hücrelerini, TRAIL ( ng/ml) ve Epoxomicin in ( nm) farklı doz ve kombinasyonlarında 24 saat inkübe ettik ve bu inkübasyon süreleri sonunda hücre canlılıklarını MTT canlılık testi ile belirledik.

30 Her iki osteosarkom hücresinde de TRAIL ve epoxomicinin tüm kombinasyonları, bu dozların tek uygulanmalarına oranla belirgin olarak hücre ölümünü artırdı. (p<0.05). Saos-2 hücrelerinin 100 nm epoxomicin ng/ml TRAIL (E100-T100) kombinasyonunda 24 saatlik inkübasyon sonrası hücre canlılığı (%50.3±6.4) sadece 100 ng/ml TRAIL (T100) uygulanan grubun hücre canlılığı (%88.8±5.2) yada sadece 100 nm epoxomicin (E100) uygulanan grubun hücre canlılığı (%79.7±2.5) ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı düzeyde düşük bulundu (**p<0.0005).

31 MG-63 hücrelerinin, 100 nm epoxomicin ng/ml TRAIL (E100- T100) kombinasyonunda 24 saatlik inkübasyon sonrası hücre canlılığı oldukça azaldı (%24.1±3.5). E100- T100 kombinasyonu, sadece 100 ng/ml TRAIL (T100) uygulanan grubun hücre canlılığı (%85±1.6) yada sadece 100 nm epoxomicin (E100) uygulanan grubun hücre canlılığı (%70.8±4) ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı düzeyde düşük bulundu (**p<0.0005).

32 TRAIL ve/veya Epoxomicin ile inkübe edilen OS hücrelerinde Kaspaz-3, Kaspaz-8 ve Kaspaz-9 aktiviteleri MG-63 ve Saos-2 hücrelerinin kontrol, 100 ng/ml TRAIL, 100 nm Epoxomicin ve kombine doz (100 ng/ml TRAIL+100 nm Epoxomicin) deney gruplarında 24 saat inkübasyon sonrası kaspaz-3, kaspaz-8 ve kaspaz-9 aktiviteleri ticari bir kit (BioSource International, Inc.) ile tayin edildi. Her petride ortalama 3x10 6 gruptan 6 petri çalışıldı. hücre olacak şekilde ekim yapıldı ve her Çeşitli ajanlarla inkübe edilen hücrelerin absorbansları, apoptozis uyarımının yapılmadığı hiçbir madde ile inkübe edilmeyen kontrol hücrelerinin absorbansları ile karşılaştırılarak aktiviteler belirlendi.

33 100 ng/ml TRAIL+100 nm Epoxomicin ile inkübe edilen her iki hücre grubunda kaspaz-3, kaspaz-8 ve kaspaz-9 aktiviteleri, sadece 100 ng/ml TRAIL veya 100 nm Epoxomicin ile inkübe edilen hücrelere göre anlamlı artış gösterdi (p<0.01). TRAIL ve Epoxomicin in beraber inkübasyonunun Saos-2 ve MG-63 hücrelerinin TRAIL e hassasiyetini arttırdığını gözlemledik. * p>0.05, Epoxomicin ile inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücrelerinde kontrol grubuna karşı Kaspaz-8 aktivitesi. + p<0.01, Sadece TRAIL ile inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücrelerinde kontrol grubuna karşı Kaspaz-3,-8,-9 aktiviteleri ve sadece Epoxomicin ile inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücrelerinde kontrol grubuna karşı Kaspaz--3, -9 aktiviteleri. # p<0.01, T+E ile inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücrelerinde, sadece TRAIL veya Epoxomicin ile inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücrelerine karşı Kaspaz-3,-8,-9 aktiviteleri.

34 TRAIL ve Epoxomicin in beraber inkübasyonu Saos-2 ve MG-63 hücrelerinde Kaspaz-3,-8,-9 aktivitelerini anlamlı olarak arttırdı. Buna zıt olarak, sadece Epoxomicin ile inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücrelerinde kontrol grubuna karşı Kaspaz-8 aktivitesi anlamlı değişmedi (*p>0.05). * p>0.05, Epoxomicin ile inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücrelerinde kontrol grubuna karşı Kaspaz-8 aktivitesi. + p<0.01, Sadece TRAIL ile inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücrelerinde kontrol grubuna karşı Kaspaz-3,-8,-9 aktiviteleri ve sadece Epoxomicin ile inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücrelerinde kontrol grubuna karşı Kaspaz--3, -9 aktiviteleri. # p<0.01, T+E ile inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücrelerinde, sadece TRAIL veya Epoxomicin ile inkübe edilen

35 TUNEL DENEYİ MG-63 ve Saos-2 OS hücreleri, 24 saat 100 ng/ml TRAIL+100 nm Epoxomicin (T+E) veya sadece TRAIL (100 ng/ml) veya sadece Epoxomicin (100 nm) ile inkübe edildi. 24 saat inkübasyonu takiben MG-63 ve Saos-2 hücrelerinde apoptozis, Terminal deoxynucleotidyl Transferase [(TdT)-mediated dutp nick end labeling (TUNEL)] prensibine dayanan bir ticari kit (Calbiochem. Cat.No. QIA33) ile belirlendi.

36 TUNEL DENEYİ Prensip: Bu kit, lam üzerine fikse edilmiş hücrelerde apoptotik nükleusların DNA sının tanımlanmasına imkan vermektedir. Bu deneyde TdT (Terminal Deoksinükleotidil Transferaz), apoptotik sinyallere cevaben oluşan DNA fragmanlarının 3 -OH ucuna biotin ile işaretlenmiş deoksinükleotidlerin eklenmesini katalizler. Streptavidin e bağlanmış haldeki horseradish peroksidaz (HRP) biotinlenmiş nükleotidlere bağlanır. Diaminobenzidin, DNA fragmantasyon bölgelerinde işaretlenmiş örnekler ile reaksiyona girerek çözünmeyen renkli bir substrat oluşturur. Apoptotik hücrelerde metilen yeşili (Metil green), koyu kahverengine dönüşür

37 Apoptozis İndeks (AI) Apoptozis İndeks (AI), her grup için lam üzerinde rastgele seçilen iyi boyanmış beş bölgede sayım yapıldı (x40 magnification) ve aşağıdaki formüle göre her grubun Apoptotik İndeksi yüzde (%) olarak hesaplandı; A AI (%) = (TUNEL-pozitif boyanan hücre sayısı / Total hücre sayısı) x 100 * p<0.001, T+E ile inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücrelerinin sadece TRAIL ile inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücreleri ile karşılaştırılması.+ p<0.01,t+e ile inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücrelerinin sadece Epoxomicin ile inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücreleri ile karşılaştırılması.

38 Apoptoz İndeksi (AI) Saos-2 ve MG-63 hücrelerinin TRAIL ve Epoxomicin ile beraber inkübasyonu Apoptoz indeksini (AI) Saos-2 ve MG-63 hücrelerinde sırasıyla %46±4.9, ve %75.2±4.3 arttırdı. Bu artışlar, kazpaz aktivitelerindeki artışlar ve hücre canlılığındaki azalışlar ile korrelasyon gösterdi. Saos-2 ve MG-63 hücrelerinin TRAIL ve Epoxomicin ile beraber inkübasyonu, sadece TRAIL (P<0.001 ) veya Epoxomicin (P<0.01) ile inkübe edilen hücrelere göre, her iki hücrede de apoptozisin indüksiyonu üzerinde sinerjistik etki oluşturdu. * p<0.001, T+E ile inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücrelerinin sadece TRAIL ile inkübe edilen Saos- 2 ve MG-63 hücreleri ile karşılaştırılması + p<0.01,t+e ile inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücrelerinin sadece Epoxomicin ile inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücreleri ile karşılaştırılması

39 Bax protein Kontrol, sadece TRAIL (100 ng/ml), sadece Epoxomicin (100 nm) veya TRAIL+Epoxomicin (100 ng/ml TRAIL+100 nm epoxomicin) ile inkübe edilen MG-63 ve Saos-2 hücre gruplarında 24 saatlik inkübasyon sonrasında Bax proteini düzeyleri ticari bir kit (katalog no Assay Designs) ile ölçüldü. Sadece TRAIL ile inkübe edilen her iki OS hücrelerinin Bax protein düzeyleri, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında anlamlı farklılık yoktu (p>0.05). Sadece Epoxomicin veya TRAIL+Epoxomicin ile inkübe edilen MG-63 ve Saos-2 hücrelerinde, Bax protein düzeyleri, kontrol grubuna ve sadece TRAIL uygulanan hücrelere göre anlamlı olarak arttı (p<0.001). TRAIL+Epoxomicin ile inkübe edilen MG-63 ve Saos-2 hücrelerinde, Bax protein düzeyleri, sadece Epoxomicin uygulanan hücreler ile karşılaştırıldığında anlamlı olarak arttı (p<0.01). ** p<0.001, Kontrola karşı sadece Epoximicin ile inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücreleri. * p<0.01, Epoximicine karşı T+E ile inkübe edilen Saos-2 ve MG-63 hücreleri. + p>0.05, Kontrola karşı sadece TRAIL ile inkübe edilen Saos-2 ve MG- 63 hücreleri.

40 Sonuçlar Saos-2 hücrelerini MG-63 hücrelerine göre TRAIL ın etkisine daha dirençli bulduk. Epoxomicin in osteosarkom hücrelerindeki zaman-doz bağımlı olarak sitotoksik etkisini belirledik ve lethal dozlarını (LD50) saptadık. Epoxomisin in güçlü, proapoptotik bir anti-kanser ajanı olduğunu gözlemledik. Epoxomicin in TRAIL ile kombine inkübasyonu, her iki OS hücresinde Bax, kaspaz- 3,-8,-9 aktivitelerini belirgin olarak arttırarak, TRAIL e hassasiyeti arttırdı. Epoxomicin in TRAIL ile kombine inkübasyonu sonucunda, intrinsik ve extrinsik apoptozis yolakları aktive edilerek TRAIL e karşı oluşan apoptotik direnç yenilerek sinerjistik etki oluştu. Yaptığımız çalışma Epoxomicinin osteosarkom hücrelerinde etki mekanizmasının anlaşılmasına katkı sağlamıştır. TRAIL a dirençlilikleri farklı olan osteosarkom hücrelerinde, Epoxomicinin, TRAIL ile sinerjistik etki göstermesi, TRAIL ve epoxomicin in beraber uygulanmasının TRAIL ın daha düşük dozlarda uygulanmasını sağlaması yönünden de önemlidir.

41 Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 2015, 15, TEŞEKKÜRLER