Transkript

1 ZOONOT K BALIK PATOJEN Streptococcus iniae nın POL MERAZ Z NC R REAKS YONU (PCR) LE DENT F KASYONU FATMAGÜN SARIHAN 1, A. ARGUN ÖZAK 2, BRAH M CENG ZLER 2 1 Mustafa Kemal Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi Tayfur Sökmen Kampüsü, Serinyol/Hatay 2 Çukurova Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi Hastalıklar Anabilim Dalı, Adana faydin@cu.edu.tr ÖZET: Streptococus iniae, insanlarda ve balıklarda hastalı a neden olan önemli bir bakteri türüdür. Bu ara tırmada, Streptococcus iniae ile deneysel olarak hastalandırılan ortalama a ırlıkları 89,69±0,48 g ve ortalama boyları 18,13±0,05 cm olan Nil tilapia (Oreochromis niloticus)'sı kullanılmı tır. Deneme gruplarına 1x10 5 cfu/ml, 1x10 4 cfu/ml,1x10 3 cfu/ml, 1x10 2 cfu/ml, 1x10 1 cfu/ml yo unlukta 0,2 ml S. iniae intraperitonel olarak verilmi tir. Balıklara bakteri uygulamasının ardından, 48 saat sonra % 50 sini öldüren doz (LD50) hesaplanmı tır. Enfekte olan balıklarda renk koyula ması, tek veya iki gözde eksoftalmus ve korneal opasite, yüzgeçlerde ve vücut yüzeyinde hiperemik alanlar, abdominal i kinlik, hareketlerde yava lama, durgunluk, tankın kö elerinde hareketsiz durma, dönerek hareket etme, yüzme bozuklu u, ani sıçrama hareketleri gibi klinik bulgular tespit edilmi tir. Yapılan otopsi sonucu ise, vücut bo lu unda kanlı sıvı birikimi, iç organlarda özellikle beyinde hemoraji, karaci er ve dalakta büyüme, hava kesesinde hiperemi, ba ırsaklarda sarı seröz sıvı birikimi gibi internal bulgulara rastlanmı tır. Deneysel enfeksiyon sonucu balıklardan izole edilen etkenin, Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) tekni i ile identifikasyonu yapılmı tır. Enfekte olan balıklardan re-izole edilen bakteri DNA larının, PCR ile amplifikasyonundan sonra % 2 lik agaroz jel de elektroforez uygulanması sonucunda S. iniae a özgü spesifik bantlar elde edilmi tir. Anahtar Sözcükler: Streptococcus iniae, Tilapia, Deneysel enfeksiyon, Polimeraz Zincir Reaksiyonu PCR IDENTIFICATION OF ZOONOTIC FISH PATHOGEN Streptococcus iniae ABSTRACT S. iniae is an important bacterial pathogen that causes diseases in fish and human. In this research, Nile tilapia (Oreochromis niloticus) with avarage body weight and length respectively 89,69±0,48 g, 18,13±0,05 cm were used. The fish were injected intraperitoneally Streptococcus iniae 0.2 ml containing 1x10 5 cfu/ml, 1x10 4 cfu/ml,1x10 3 cfu/ml, 1x10 2 cfu/ml, 1x10 1 cfu/ml. After injected bacteria, mortalities were monitored for 48 h and LD50 calculated. In infected fish were exhibited clinical signs, darkening, uni-or bileteral exophthalmia and corneal opacity (whitish eyes),hyperemic zones on gills and surface of the body, abdominal distention, slowly movements, erratic swimming (such as spiraling or spinning), suddenly flash jumping. Bloody fluid accumulation in body cavity, haemorryhage on internal organs especially brain, enlargment of liver and spleen, swim bladder hyperemia, yellow serous fluid accumulation with gut were exhibited internal signs. PCR identification of pathogen were completed after isolation from experimentally infected fish. Reisolated bacteria DNA were amplificated with PCR and specific bands were obtained after application 2 % agorose gel electrophoresis. Key words: Streptoccocus iniae, Tilapia, experimental infection, Polymerase Chain Reaction G R Tilapia, günümüzde dünyada yeti tiricili i yapılan en önemli balık türlerinden biridir. Bazı kaynaklara göre dünyada ikinci sırada oldu u bildirilmektedir. Bugün, tilapia, Amerika nın en fazla ithal etti i, deniz ürünlerinden karides ve Atlantik Salmon dan sonra üçüncü sırada gelmektedir (Bhujel ve Suresh, 2000; Alceste ve Darryl, 2001). De i ik çevre ko ullarına hızlı uyumu, hastalıklara kar ı dirençli olu u ve etinin sevilerek tüketilmesi bu artı ta rol oynayan önemli özellikleridir yılından beri bölgemizde de yeti tiricili i yapılan tilapia türlerinde zaman zaman sa lık sorunları görülmekte, bunların ba ında da paraziter ve bakteriyel hastalıklar gelmektedir. Tilapia da görülen bakteriyel enfeksiyonlara neden olan etkenler, Aeromonas hydrophila, A. sobria, Pseudomonas fluorescens, Plesiomonas shigelloide, Vibrio parahaemolyticus, Flexibacter columnaris, Edwarsiella tarda, mycobacterium sp. ve Streptococcus iniae dır (Plumb, 1999). Bu etkenler arasında bulunan streptokokkal enfeksiyonlar, tilapia ba ta olmak üzere yeti tiricili i yapılan pek çok tatlısu balı ı ve deniz balıkları arasında artan önemli bir problem olarak günümüze kadar gelmi tir (Bragg ve ark. 1989; Al-Harbi 1994; Perera ve ark. 1994; Eldar ve ark. 1995; Perera ve ark.,1997; Austin ve Austin 1999; Shoemaker ve ark. 2001; Huchzermeyer 2003). Aynı zamanda zoonoz bir bakteri türü olan Streptococcus iniae, ilk kez Amazon Nehri nde yakalanan tatlısu yunusu (Inia geoffrensis) nun deri altı apsesinden izole edilmi ve tanımlanmı tır (Pier ve Madin, 1976). Bu bakteri türünün, 428

2 insanlarda da çe itli enfeksiyonlara yol açtı ı tespit edilmi tir. nsanlarda, balık (tilapia ve levrek) temizlerken bıçak darbesi veya balı ın yüzgeç dikenleri ile derinin delinmesi sonucu, elde olu an perkutan yaraları takiben bakteriyemiyle birlikte S. iniae nın neden oldu u enfeksiyonlar belirlenmi tir. Enfekte olan hastalarda, ellerde selülit (yaralanmalardan sonra saat içerisinde geli en), yaralı bölgelerden kaynaklanan ate, lenfanjitis, menenjit, endokarditis, artiritis ve spinal enfeksiyona rastlandı ı belirtmi lerdir. (MMWR, 1996; Weinstein ve ark., 1997; George, 1998; Liu ve ark., 1998; Lau ve ark. 2003; Koh ve ark., 2004). Diler ve ark. (2002), ülkemizde streptokokkal enfeksiyonlardan biri olan Lactococcus garvieae nın kültürü yapılan gökku a ı alabalı ında yakla ık % 80 ölümlere neden oldu unu ilk olarak belirlemi ledir. Bunun dı ında, balıklarda ve balıklardan kaynaklanan, insanlarda streptococcus vakası henüz bildirilmemi olmasına ra men Streptococcus iniae nın, potansiyel bir tehlike oldu u dü ünülmelidir. Balık hastalılarında mikrobiyal etkenlerin tanısında hızlı ve do ru sonuç elde etmek amacıyla moleküler tekniklerin kullanımı son yıllarda ola anüstü artmı tır. Bu tekniklerde bir tanesi de Polimeraz Zincir Reaksiyon (PCR) tekni idir. Bu ara tırmada deneysel olarak hastalandırılan tilapia (Oreochromis niloticus) da Streptococcus iniae nin tanımlanmasında PCR tekni inin kullanılması amaçlanmı tır. MATERYAL VE YÖNTEM Ara tırma,çukurova Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi Yeti tiricilik Ünitesinde 1,5x0,35x0,40 m ebatlarında, 210 L hacminde fiberglas tanklarda yürütülmü tür. Denemede, 2 tekrarlı kontrol grubu dahil 5 grup halinde ortalama a ırlıkları 89,69±0,48 g ve ortalama boyları 18,13±0,05 cm olan 72 adet Nil tilapiası (Oreochromis niloticus)'sı kullanılmı tır. Çukurova Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi Ara tırma ve Üretim istasyonundan temin edilen balıklar yeti tiricilik ünitesine getirilerek bir ay süreyle uyumları sa lanmı tır. Ara tırma süresince en az 24 saat dinlendirilmi ve havalandırılmı ehir suyu kullanılmı tır. Su de i imi, tank hacminin % 70 i oranında günde bir kez sifonla, organik maddelerin uzakla tırılması için yapılmı tır. Havalandırma kuru hava motoru ile bir merkezden tanklara da ıtılmı tır. Balıklara uygulanan karanlık aydınlık periyodu 12 saat aydınlık 12 saat karanlık olacak ekilde düzenlenmi tir. Balıkların stres vb. etkiler nedeniyle dı arı atlamalarını önlemek amacıyla tankların üstü 1 cm göz açıklı ındaki a la kapatılmı tır. Denemede boyunca kullanılan suyun ph, çözünmü oksijen ve sıcaklık de erleri alınmı tır. Ara tırma boyunca, ph 7.63±0.2, oksijen 5.34±0.1 mg/l ve sıcaklık 26,14±0,1 o C de erlerinde olan su kullanılmı tır. Denemelerde kullanılan Streptococcus iniae su u (Dan-1), srail de bulunan Hebrew Üniversitesi, Klinik Mikrobiyoloji Bölümü nden Dr.Avi Eldar tarafından sa lanmı tır. Bu su un ço altılması amacıyla, Todd Hewitt Broth ve arkasından Brain Heart Infusion Agar (BHIA) a ekimleri yapılıp 30 C de 24 saat inkübasyona bırakılmı tır. Kültürün korunması amacıyla bu i lemler ayda bir kez tekrarlanmı tır. Buzdolabında + 4 o C de muhafaza edilen S. iniae stok kültüründen alınan bakteri izolatları Brain Heart Infusion agara ve hazır olarak temin edilmi olan % 5 koyun kanlı besiyerine aseptik ko ullarda ekilerek 30 o C de 24 saat inkübasyonu ile gençle tirilmi tir. Gençle tirilmi S. iniae su u, 10 ml Todd-Hewitt Broth içeren tüpe ekilerek 24 saat sonra üreyen bakterilerden alt kültür elde edilmi tir. nkübasyondan sonra, yüzeye yayma yöntemi ile bir mililitredeki canlı bakteri sayısı tespit edilmi tir (Atlas ve ark., 1995; Temiz, 1994). Bir mililitredeki canlı bakteri sayısı 1x10 9 cfu/ml olarak belirlenmi tir. 6 balık, 2 tekrarlı olacak ekilde bir grup için 12 balı a, 1x10 1,1x10 2, 1x10 3,1x10 4 ve 1x10 5 cfu/ml olacak ekilde 200 µl bakteri ve kontrol grubunu da aynı miktarda Todd-Hewitt Broth karın bölgesi alkol ile silinerek 1ml lik enjektör ile intraperitonal olarak, toplam 72 balı a enjekte edilmi tir. Balıklar vücut a ırlıklarının % 1 i oranında, günde bir kez pelet yem ile beslenmi lerdir. Bakteri enjeksiyonundan 24 saat önce yemleme kesilmi tir. Enjeksiyonu takiben 28 gün boyunca balıklar takip edilmi tir. Ölen balıklar hemen incelemeye alınmı tır. Balıklara bakteri uygulamasının ardından, 48 saat sonra % 50 sini öldüren doz (LD50) hesaplanmı tır. (Reed and Muench, 1938). Enfekte edilen balıklardaki de i iklikler gözlenerek yeni ölen balıkların otopsileri yapılmı tır. ç organlardan (beyin, ön böbrek, karaci er, dalak, solungaçlar ve yüzme kesesi) alınan örneklerden ayrı ayrı aseptik ko ullarda ekim yapılmı tır. PCR yöntemi ile bakterilerin identifikasyonu Çukurova Üniversitesi Tropikal Hastalıklar Ara tırma ve Uygulama Merkezi laboratuarında yapılmı tır. PCR için kullanılan yöntem, Zlotkin ve ark. (1998) nın çalı malarından modifiye edilerek uygulanmı tır. Enfekte edilen balıklardan yapılan ekimler sonucu elde edilen her örnekten birkaç bakteri kolonisi alınarak 0,5 ml distile su içerisinde süspanse edilmi tir. Bu süspansiyondan 100 l alınarak üzerine 300 l lizis tamponu (13,3 mmol/l Tris-HCl [ph 8,0], 6,7 mmol/l ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), % 0,67 sodium dodecyl sulfate, 133 g/ml proteinase-k) ilave edilerek 56 C de en az 4 saat inkübe edilmi tir. Bu karı ım üzerine 800 L fenol/kloroform ilave edilerek alt üst edilip ve 4 C de 20 dk inkübe edilmi tir. Karı ım xg de 15 dk santrifüj edilerek süpernatant yeni bir tüpe aktarılmı tır. Bu i lem iki defa tekrarlanmı tır. Son santrifügasyondan sonra süpernatant üzerine hacmin iki katı kadar kloroform ilave edilerek aynı i lem tekrarlanmı tır. Süpernatant yeni bir tüpe aktarıldıktan sonra üzerine 1 ml so uk etanol ilave edilerek 20 C de bir gece bekletilmi tir. DNA ı presipite etmek için xg de 15 dakika santrifüj yapılmı tır. PCR da örnek olarak kullanmak için DNA, etanol tamamen döküldükten sonra havada 3 dk kurutulmu, 20 l Dnase-free steril distile suda çözülmü tür. Ayrıca reaksiyonda, Sin- 429

3 1:5 -CTAGAGTA CACATGTACTAGCTAAG-3 ve Sin- 2:5 -GGATTTTCCACTCCCATTA-3 primerleri kullanılmı tır. Amplifikasyon, 95 C de iki dakika ön ısıtma, 30 döngü; 94 C de bir dakika denatürasyon, 55 C de bir dakika birle me (annealing), 72 C de bir dakika (elongasyon) sentez basamaklarından geçirilmi tir. PCR amplifikasyonundan sonra ürünler, etidyum bromid ile boyalı %2 lik agaroz jel de elektroforeze tabi tutularak analiz edilmi tir. BULGULAR S. iniae balıklara enjekte edildikten sonra, 24 saat içerisinde bazı balıkların renginde koyula ma, durgunluk, hareketlerinde yava lama, tankın kö elerinde hareketsiz durma ve ölmeden hemen önce ise ani hareketler yaparak yüzme bozuklu u gösterdikleri, daha sonraki günlerde de ölmek üzere olan balıklarda aynı belirtilerin olu tu u gözlenmi tir. 24 saat sonra bu belirtileri gösteren balıkların bir kısmında görülen ölümler, bakteri miktarına göre de erlendirildi inde; 1x10 5 cfu/ml bakteri verilen grupta iki birey, 1x10 4 cfu/ml, 1x10 3 cfu/ml ve 1x10 2 cfu/ml bakteri verilen grupta ise bir bireyin öldü ü görülmü tür. 48 saat sonra ise, 1x10 5 cfu/ml de sekiz birey, 1x10 4 cfu/ml de 5 birey, 1x10 3 cfu/ml ve 1x10 2 cfu/ml de üç birey ve1x10 1 cfu/ml bakteri verilen grupta 2 bireyin öldü ü görülmü tür. Kontrol grubunda ise hastalı ın tipik semptomları olan vücut yüzeyinde hiperemik alanlar, gözlerde tepkisizlik ve yüzme bozuklukları görülmedi i gibi, bu gruptaki balıklarda ölümde gerçekle memi tir. Enfekte olan balıklarda renk koyula ması, tek veya iki gözde eksoftalmus, yüzgeçlerde ve vücut yüzeyinde hiperemik alanlar, gözlerde korneal opasite, abdominal i kinlik, hareketlerde yava lama, durgunluk, tankın kö elerinde hareketsiz durma, dönerek hareket etme, yüzme bozuklu u, ani sıçrama hareketleri gibi klinik bulgular tespit edilmi tir ( ekil 1, 2, ve 3). Vücut bo lu unda kanlı sıvı birikimi, iç organlarda özellikle beyinde hemoraji, karaci er ve dalakta büyüme, hava kesesinde kanlanma, ba ırsaklarda sarı seröz sıvı birikimi gibi internal bulgulara rastlanmı tır ( ekil 4.). ekil 1. Deneysel enfeksiyon sonucu tilapianın vücut yüzeyinde görülen hiperemik alanlar Figure 1. Hyperemia being observed in the skin surface after experimentally infected ekil 2. Deneysel enfeksiyon sonucu tilapianın gözünde görülen korneal opasite Figure 2. Corneal opacity being observed in the eyes after experimentally infected 430

4 ekil 3. Deneysel enfeksiyon sonucu tilapiada görülen bilateral eksoftalmus Figure 3. Bileteral exophthalmia being observed in the eyes after experimentally infected ekil 4. Deneysel enfeksiyon sonucu tilapiada görülen ba ırsaklarda sarı seröz sıvı birikimi Figure 4. Yellow serous fluid accumulation being observed in the guts after experimentally infected gözlenen ölümler Deneme süresince balıklarda görülen ölümler Çizelde 1 de, Reed ve Muench yöntemi ile 48 saat sonra balıkların % 50 sini öldüren doz (LD50) ise Çizelge 2 de verilmi tir. Çizelge 1. S. iniae enjeksiyonundan sonra Table 1. Mortalities observed after injected with S. iniae Gün Doz 1.gün 2.gün 3.gün 4.gün 7.gün 14.gün 21.gün 28.gü n Ölü sayısı ölüm (%) Kontrol 0 * /12 0/12 0/12 0/12 0/12 0/12 0/12 0/12 0/12 0 1x10 1 0/12 2/12 2/12 4/12 6/12 6/12 6/12 6/12 6/ x10 2 1/12 3/12 4/12 5/12 7/12 7/12 7/12 7/12 7/ x10 3 1/12 3/12 5/12 7/12 10/12 10/12 10/12 10/12 10/ x10 4 1/12 5/12 7/12 8/12 11/12 11/12 11/12 11/12 11/ x10 5 2/12 8/12 9/12 10/12 11/12 11/12 11/12 11/12 11/12 92 Toplam 6/72 22/72 27/72 34/72 45/72 45/72 45/72 45/72 45/72 63 * Ölen balıkların sayısı Çizelge 2. Reed ve Muench yöntemi ile 48 saat sonra balıkların % 50 sini öldüren doz (LD50) Table 2. Calculation of LD50 values using Reed-Muench method Kümülatif THB*= Todd-Hewitt Broth de erler Balıkların sayısı Reed ve Muench yöntemi ile 48 saat sonra Dilüsyon cfu/m ölü canlı ölü canlı ölüm (%) balıkların % 50 sini öldüren doz 6,9 x10 3 cfu/ml l veya ~ 7 x10 3 cfu/ml olarak belirlenmi tir. (kontrol) THB * S.iniae enfekte edilen balıklardan re-izole edilen x bakteri DNA larının hepsinde, PCR ile 10 1 amplifikasyonundan sonra % 2 lik agaroz jel de x elektroforez uygulanması sonucunda S. iniae a 10 2 özgü spesifik bantlar elde edilmi tir ( ekil 6.) x x x

5 ekil 6. Etidyum bromid ile boyalı, % 2 lik agaroz jel elektroforezinde elde edilen PCR ürünleri (S.iniae). M: DNA Marker (100pb) 1: Dan-1 su u, 2-5: Enfekte edilen balıklardan re-izole edilen bakteri N= Negatif kontrol 300bp M N Figure 6. An ethidium bromide-stained 2 % Agarose gel electrophoresis of PCR products obtained with S.iniae. DNA M: DNA marker (100bp), 1: Dan-1 strain, 2-5: Re-isolated bacteria, N: Negative control TARTI MA VE SONUÇ Bu ara tırmada, S. iniae ile enfekte edilen balıklarda gözlenen klinik belirtiler (yüzme bozuklu u, renk koyula ması, eksoftalmiya ve gözde opasite gibi), çe itli ara tırıcıların (Post, 1987; Sindermann, 1990; Kitao, 1993; Perera ve ark., 1994; Bunch ve Bejerano, 1997; Kusuda ve Salati, 1999; Plumb, 1999; Evans ve ark., 2000; Shoemaker ve ark., 2000; Darwish ve ark., 2002; Dönmez, 2002) bildiri lerindeki semptomlarla uyumludur. Zlotkin ve ark (1998) nın, PCR yöntemi ile S. iniae yı belirledikleri çalı mada olu an bantlar (300bp), yapılan bu çalı mada da aynı bölgede bulunmu tur. Balık hastalıklarında, enfeksiyona neden olan etkenin identifikasyonunda uygulanan konvensiyonel yöntemler oldukça zaman alıcı i lemler olması nedeniyle, ekonomik kayıpları arttırmaktadır. Bu nedenle kısa sürede güvenilir sonuç veren teknikler tercih edilmektedir. Çünkü etkili kontrol stretejileri geli tirmenin ilk artı, ancak enfeksiyonun erken ve do ru te hisine ba lı olmaktadır. Bu tekniklerden bir tanesi de PCR tekni idir. S. iniae nın identifikasyonu, bugünkü ticari identifikasyon sistemleri (Bio-Mérieux Vitek, Hazelwood, Mo) ile yapılsa bile, bu sistemlerin veri tabanında S. iniae bulunmadı ı için, etken do ru olarak tanımlanmayabilir. Weinstein ve ark., (1997) S.iniae nın identifikasyonunda kullandıkları Bio-Mérieux identifikasyon kitleri ile inceledikleri izolatların tanımlanamayan veya S. uberis oldu unu belirlemi ler ve bu yöntem güvenilir olmadı ı için pulsed-field jel elektroferezi ile çalı tıkları izolatların özelliklerini belirlemi lerdir. Ara tırmamızda PCR teknigi ile Streptococcus iniae ile deneysel olarak hastalandırılan tilapia dan izole edilen etkenin tanımlaması yapılmı tır. Etkenin tanımlanmasında zaman ve güvenirlilik açısından yöntemin üstünlü ü teyit edilmi ve olası bir hastalık durumunda bu ara tırmanın konu ile ilgili yapılacak çalı malara da bir temel olu turaca ı dü ünülmektedir. KAYNAKLAR Al-Harbi, A.H., First isolation of Streptococcus sp. from hybrid tilapia (Oreochromis niloticus x O. aureus) in Saudi Arabia. Aquaculture, 128: Alceste, C.C., and Darryl, E.J., World Tilapia Farming. Seafood Business Magazine, Atlas, R.M., Brown, A.E., and Parks L.C., Laboratory Manual of Experimental Microbiology. Mosby-Year Book, Missouri. pp Austin, B., and Austin, D.A., Bacterial fish pathogens. Disease of farmed and wild fish. Springer/Praxis Publishing, Chichester, United Kingdom. 457p. Bhujel, R.C., And Suresh, A.V., Advances in tilapia broodstock management. Global Aquaculture Advocate, 3(5): Bragg, R.R., Oosthuızen, J.H., and Lordan, S.M., The leech Batracobdelloides tricarinata (Blanchard,1897) (Hirudinea: Glossiphoniidae) as a possible reservoir of the rainbow trout pathogenic Streptococcus species. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 56(3): Bunch, E.C., and Bejerano, I., The effect of environmental factors on the susceptibility of hybrid tilapia Oreochromis niloticus x Oreochromis aureus to Streptococcosis. Israeli Journal of Aquaculture- Bamidgeh, 49(2): Darwish, A.M., Rawles, S.D., and Griffin, B.R., Laboratory efficacy of oxytetracycline for the control of Streptococcus iniae infection in blue tilapia. Journal of Aquatic Animal Health, 14: Diler, Ö., Altun, S., Adilo lu A.K., Kubilay, A., ve Isıklı, B., First occurence of Streptococcosis affecting farmed rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in Turkey. Bulletin of the European Association of Fish Pathologists, 22: Dönmez, A.E., Tilapia larda deneysel Streptococcus iniae enfeksiyonunda olu an histopatolojik bulguların ve bazı kan parametrelerinin incelenmesi. Çukurova Üniv. Fen Bilimleri Enstitüsü Su Ürünleri Anabilim Dalı. (Yayınlanmamı doktora tezi), 72s. 432

6 Eldar, A., Bejerano, Y., Livoff, A., Horovitz, A., And Bercovier, H., Experimental streptococcal meningoencephalitis in cultured fish. Veterinary Microbiology, 43: Evans, J.J., Shoemaker, C.A., and Klesius, P.H., Experimental Streptococcus iniae infection of hybrid striped bass (Morone chrysops x Morone saxatilis) and tilapia (Oreochromis niloticus) by nares inoculation. Aquaculture, 189: George, T.T., Canadian doctors confirm the infection and effects of Streptococcus iniae in fish and humans. Bull. Aquaculture Assoc. Can. 98: Huchzermeyer, K.D., Clinical and pathological observations on Streptococcus sp. infection on South African trout farms with gas supersaturated water supplies. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, 70(2): Koh, T.H., Kurup, A., Chen, J., Streptococcus iniae discitis in Singapore. Emerging Infectious Diseases. 10: Kusuda, R. and Salati, F., Enterococcus seriolicida and Streptococcus iniae. (P.T.K., Woo and D.W., Bruno Eds.). Fish Diseases and Disorders, Vol. 3. Viral, Bacterial and Fungal Infections, CAB International, New York pp. Lau, SK., Woo, PC., Tse, H., Leung, K W., Wong, SS., Ynen, KY., Invasive Streptococcus iniae infections outside North America. J. Clin Microbiology. 41: Liu, E.T.H., D Cunha, C., Yaffe, B., Ostach, C., Urquhuarth, J., Gorman, K., Lee, W., Ying, J., Landry, L., Armstrong- Evans, M., The Fish Team, Low, D.E., McGerr, A., Understanding the epidemiology of Streptococcus iniae infections- Results of a survey of fish buying and handling in the Greater Toronto Area (GTA). Canadian Association for Clinical Microbiology and Infectious Diseases (CACMID), 66th Conjoint Meeting on Infectious Diseases, Toronto, ON, Canada, Nov 8-12, Morbidity and Mortality Weekly Report Invasive infection due to Streptococcus iniae Ontario, Morbid. Mortal. Weekly Rep. 45: Perera, R.P., Johnson, S.K., and Lewis, D.H., Epizootiological aspects of Streptococcus iniae affecting tilapia in Texas. Aquaculture, 152: Perera, R.P., Johnson, S.K., Collins, M.D., and Lewis, D.H., Streptococcus iniae associated with mortality of Tilapia nilotica and T. aurea hybrids. Journal of Aquatic Animal Health, 6: Pier, G.B., and Madin, S.H., Streptococcus iniae sp. Nov., a beta hemolytic streptococcus isolated from an Amazon freshwater dolphin, Inia geoffrensis. International Journal of Systematic Bacteriology, 26: Plumb, J.A., Health Maintenance and Principal Microbial Diseases of Cultured Fishes. Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA, Post, G., Textbook Of Fish Health T. F.H. Publications, Inc, Neptune City, 288p. Reed, L.J., and Muench, H., A simple method of estimating fifty per cent endpoints. The American Journal of Hygiene, 27: Shoemaker, C.A., Evans, J.J., And Klesius, P.H., Density and dose: factors affecting mortality of Streptococcus iniae infected tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture, 188: Shoemaker, C.A., Klesius, P.H., and Evans, J.J., Prevalence of Streptococcus iniae in tilapia, hybrid striped bass, and channel catfish on commercial fish farms in the United States. American Journal of Veterinary Research, 62: Sindermann, C.J., Principal diseases of marine fish and shellfish Vol.1. Diseases of Marine Fish. 2nd ed. Academic Press, San Diego, CA. 521p. Temiz, A., Genel Mikrobiyoloji Uygulama Teknikleri. Ankara. 274s. Weinstein, M.R., Litt, M., Kertesz, D.A., Wyper, P., Rose, D., Coulter, M., Mcgeer, A., Facklam, R., Ostach, C., Willey, B. M., Borczyk, A., and Low., D.E., Invasive infections due to a fish pathogen, Streptococcus iniae. S. iniae Study Group. New England Journal of Medicine, 337: Zlotkin, A., Hershko, H., And Eldar, A., Possible transmission of Streptococcus iniae from wild fish to cultured marine fish. Applied and Environmental Microbiology, 64: