Levrek (Dicentrarchus labrax L.1758) lerde Oksitetrasiklin Kullanımının Nötrofillerin Fagositik Aktivitesine Etkisinin İncelenmesi

Transkript

1 F. Ü. Fen ve Mühendislik Bilimleri Dergisi, 15(3), , 2003 Levrek (Dicentrarchus labrax L.1758) lerde Oksitetrasiklin Kullanımının Nötrofillerin Fagositik Aktivitesine Etkisinin İncelenmesi Özet Süleyman AKHAN, T. Tansel TANRIKUL *, Fikri BALTA ve Ramazan SEREZLİ Karadeniz Teknik Üniversitesi, Rize Su Ürünleri Fakültesi Yetiştiricilik Bölümü, RİZE * Ege Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi Yetiştiricilik Bölümü, İskele-Urla İZMİR Bu çalışmada, levreklerde (Dicentrarchus labrax L.1758) yeme katılarak verilen oksitetrasiklin HCl nin (OTC) non-spesifik savunma mekanizması üzerindeki etkisi, Nitroblue Tetrazolium (NBT) testi ve kan sayım teknikleri kullanılarak incelenmiştir. Yapılan araştırma sonucunda 75 mg/kg canlı ağırlık dozunda kullanılan oksiterasiklin HCl nin levreklerde kandaki nötrofillerinin fagositik aktivitesini ve kandaki lökosit sayısını azalttığı gözlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Nötrofil, nitroblue tetrazolium, lökosit, oksitetrasiklin, levrek. The Effect of Oxytetracyclıne on Phagocytic Activity of Neutrophils in Sea Bass (Dicentrarchus labrax L. 1758) Abstract In this study, effect of oxytetracycline HCL (OTC) application on non-specific defence mechanism of Sea bass (Dicentrarchus labrax L.1758) has been observed and presented by Nitroblue Tetrazolium (NBT) (+) test and some blood counting techniques. Results of studies have been showed that 75 mg/kg living weight dosage of oxytetracycline has a suppressive effect on phagocytic activity of neutrophils and number of leucocytes. Keywords: Neutrophil, nitroblue tetrazolium, leucocyte, oxytetracycline, sea bass. 1. Giriş Levrek (Dicentrarchus labrax L.) ekonomik değerinin yüksek oluşu nedeniyle kültür balıkçılığında önemli bir paya sahiptir. Kültürü yapılan balıklar içerisinde bu tür diğerlerine göre çevresel etkenlere karşı oldukça duyarlıdır. Olumsuz çevresel faktörler ve yanlış yetiştiricilik uygulamalarından dolayı balıklar sık sık strese girmektedir. Strese giren balıkların kanında kortikosteroidlerin ve kateşolaminlerin artması kan proteinlerinin metabolize edilerek immunoglobulin miktarının düşmesine neden olmaktadır [1]. Stres sonucu oluşan immunosupresyon balıkları enfeksiyöz hastalıklara karşı daha duyarlı hale getirmektedir. Bu nedenlerle kültürü yapılan levreklerde enfeksiyöz bakteriyel hastalıklar çok sık ortaya çıkmakta ve yüksek mortaliteye neden olmaktadır. Bu hastalıklarla mücadelede ise kemoterapötik ajanlar içersinde en yaygın olarak kullanılanı oksitetrasiklin HCl (OTC) dir. Su ürünleri işletmelerinde ortaya çıkan bakteriyel hastalıkların tedavisinde antibiyogram test sonuçları doğrultusunda OTC in uygun dozlarıyla yapılan tedavi sonucunda vakalar tedavi edilmesine rağmen bir kaç ay gibi kısa bir zaman sonra hastalıkların nüksettiği görülmektedir. Bu durumun hangi faktörlerden kaynaklandığı tam olarak bilinmemektedir.

2 S. Akhan, T. T. Tanrıkul, F. Balta ve R. Serezli OTC hasta balıkların tedavisinde uygun dozlarda kullanıldığında bile bazı yan etkiler ortaya çıkabilmektedir. Bu yan etkiler, gastro-intestinal bozukluklar, viruslarla süper enfeksiyonlar, bakteriyel direnç şekillenmesi, dalak, karaciğer, böbrek gibi organlarda tahribat ve en önemlisi bağışıklık sistemini baskılayabilmektedir [2]. Balıkların bağışıklık sistemi ile antibiyotikler arasındaki etkileşim üzerine yapılmış araştırma sayısı sınırlıdır. Mevcut araştırmaların sonuçları, çalışmalarda kullanılan canlı türüne göre farklılık göstermektedir. Hauser ve Remington fareler ve insanlar üzerinde yaptıkları bir araştırmada OTC nin lenfosit transformasyonunu engelleyerek antikor üretimini azalttığını bildirmişlerdir [3]. Rijkers ve diğ. [4] yaptıkları araştırmalarında OTC nin sazanlarda (C. carpio L.) humoral bağışıklık sistemini baskıladığını bildirmişlerdir. Yapılan diğer bir araştırmada oksitetrasiklinin sazanların bağışıklık sistemini baskıladığı bildirilmektedir [5]. Gökkuşağı alabalığı üzerinde yapılan diğer bir araştırmada, Yersinia ruckeri ye karşı aşılanan balıklarda antikor üretiminin azaldığı gözlenmiştir [6]. Lunden ve diğ. [7] alabalıklarda divalent furunkulosis ve vibriosis aşısı ile aşılandıktan sonra OTC nin oral olarak verilmesinin kandaki lenfositlerden antikor üretimini baskıladığını bildirmiştir. Yine başka bir araştırmada alabalıklara terapötik dozda oral olarak OTC verildiğinde, kan ve böbreklerin ön kısmındaki fagositik hücrelerin fagositoz aktivitelerinin azaldığı görülmüştür [8]. Diğer bir araştırmada OTC farklı dozlarda 12 gün boyunca oral yolla kalkan balığı (Scophthlamus maximus L.) na verilmiştir. Araştırmada OTC nin plazma bakterisidal aktiviteyi arttırdığı ancak makrofajların fagositik aktivitesini in vitro azalttığı görülmüştür [9]. Bu çalışmada OTC nin levreklerde, nötrofillerin oksidatif yakma mekanizması üzerine etkisi NBT testi yardımıyla incelenmiştir. Ayrıca levreklerde OTC kullanımının beyaz ve kırmızı kan hücreleri üzerindeki etkisi kan sayımı yapılarak belirlenmiştir. 2. Materyal ve Yöntem 2.1. Balıklar Araştırmada E.Ü. Su Ürünleri Fakültesi Kuluçkahanesinden temin edilen 90±5 gr ortalama ağırlığa sahip levrekler kullanıldı. Balıklar 250 litrelik iki adet tanka her birine 40 balık gelecek şekilde iki gruba ayrılarak stoklandı. Deneme süresince, balıkların stoklandığı tanklara 38 tuzluluğa ve 19±2 C sıcaklığa sahip deniz suyu 7-8 lt/dk debide verildi Deneme düzeneği İki haftalık adaptasyon süresince balıklar 2 mm ticari pelet yemle ( %45 ham protein, % 12 yağ ) günde iki defa beslendi. Deneme grubuna, 75 mg/kg canlı ağırlık dozunda bitkisel sıvı yağla OTC karıştırılmış yem, 10 gün boyunca günde iki defa verildi. Kontrol grubundan (K) ve OTC verilen deneme grubundan (D) 10. gün sonunda birer hafta aralıklarla 4 defa balıklar rast gele seçilerek örnekleme yapılmıştır (n=5). 456

3 Levrek (Dicentrarchus labrax L.1758) lerde Oksitetrasiklin Kullanımının Nötrofillerin Fagositik 2.3. Kanın alınması ve cama yapışan NBT (+) hücre testi Cama yapışan NBT (Nitroblue Tetrazolium-Sigma N-6876) (+) hücre testi için kan örnekleri heparinli plastik enjektörle direkt balık kalbine girilerek alınmıştır. Enjektörle alınan kan 15 dk. içerisinde lamel üzerine damlatılarak nemli petri kutusuna konulmuş ve nötrofillerin cama yapışmalarını sağlamak için oda sıcaklığında (22 ºC) 40 dk. inkübe edilmiştir. İnkübasyondan sonra, cama yapışan nötrofiller dışındaki kan hücreleri Phosphat buffered saline (PBS), (ph 7.2) ile yavaşça yıkanarak lamelden uzaklaştırılmıştır. PBS ile yıkanan lamel cama yapışan nötrofiller ve bazı monositler altta kalacak şekilde, üzerine 50µl NBT ( 8.5 NaCl de ve 2 lik) solusyonu damlatılmış lam üzerine kapatılarak oda sıcaklığında 40 dk. inkübe edilmiştir. İnkübasyondan sonra lamellerdeki NBT (+) hücreler mikroskop altında x400 büyütmede sayılmıştır [10,11]. Örneklenen her balık için 2 lamel hazırlanmış ve her lamel üzerinde tesadüfi 3 mikroskobik alan sayılarak aritmetik ortalamaları hesaplanmıştır Eritrosit ve lökosit sayımı Eritrosit ve lökosit sayımı için, 50 µl kan 2,45 ml Leibovitz-15 medium (Sigma L-4386) (steril ve antibiyotikli;50µg/ml gentamisin, 100 I.U. penisilin ve 2 ml/ 860 ml %17.5 luk NaCl) doku kültürü ortamı içerisine katılarak Roberts un belirttiği gibi 1:50 oranında dilüe edildi [12]. Hazırlanan dilüsyon en geç 3-4 saat içerisinde Thoma lamı kullanılarak Konuk un [13] belirttiği şekilde sayıldı İstatistiki analizler Sonuçlar, ortalama değer ve standart hata olarak verilmiş olup istatistiki analizler Microsoft Excel (Ver. 7.0) paket programı yardımıyla %95 güven aralığında student s t-testi kullanılarak yapıldı. 3. Bulgular 3.1. Cama yapışan NBT (+) nötrofil sayısı Deneme grubuna 10 gün boyunca OTC verildikten sonra 10. günde yapılan ilk örneklemede kontrol grubunda ortalama NBT (+) nötrofil sayısı 21,96±2,43 iken OTC verilen deneme grubunda 2,02±0,83 gibi oldukça düşük bulunmuştur. İkinci örneklemede (17. gün) kontrol grubunda 23,5±0,6, deneme grubunda 12,64±0,96, 3.örneklemede (24.gün), kontrol grubunda21,65±0,75 deneme grubunda 16,66±1,8 ve 4.örneklemede (31. gün) kontrol grubunda 22±0,6, deneme grubunda 17,38±0,88 adet olarak bulundu. Yapılan dört örneklemede elde edilen sonuçlara göre, deneme grubu ortalamalarının tamamı kontrol grubu ortalamalarından düşük olarak bulunmuştur (p <0,05). 457

4 S. Akhan, T. T. Tanrıkul, F. Balta ve R. Serezli Şekil 1. Deneme ve kontrol grubundan yapılan örneklemelerde belirlenen ortalama NBT (+) nötrofil sayısı (* p <0,05) Lökosit sayısı Deneme grubu ve kontrol grubundan 10.gün, 17. gün, 24. gün ve 31. günlerde yapılan örneklemelerde OTC verilen grupta lökosit sayısı kontrol grubuna kıyasla düşük olarak bulunmuştur. 10. günden itibaren birer hafta aralıklarla alınan numunelerde 1 mm³ kanda belirlenen lökosit sayısı, kontrol grubunda sırasıyla 7299 ± 357, 7010 ± 86, 6955 ± 124, 7145±105 olarak bulunmasına rağmen deneme grubundan yapılan örneklemelerde; ilk örneklemede (10. gün) 3912 ± 705, 2. örneklemede (17. gün) 3856 ± 875, 3.örneklemede (24. gün) 6131 ± 741 ve 4. örneklemede (31. gün ) 6081 ± 145 adet olarak bulunmuştur (Şekil 2). Kontrol grubu ortalamaları kendi aralarında istatistiki farklılık göstermemiş ancak tamamı deneme grubu ortalamalarından istatistiki olarak farklı ve önemli bulunmuştur (p<0,05). Şekil 2. Kontrol grubundan ve deneme grubundan yapılan örneklemelerde 1mm 3 kanında belirlenen lökosit sayısı (*p<0.005). levrek 3.3. Eritrosit sayısı İlacın kesilmesinden sonraki 10., 17., 24., 31. günlerde alınan numunelerde eritrosit sayısı kontrol grubundan yapılan örneklemelerde x10 6 ± , x10 6 ±32.000, 1.84 x10 6 ± , x10 6 ± ve deneme grubunda sırasıyla; x10 6 ± , x10 6 ± , x10 6 ± ve x10 6 ±35.460, olarak bulunmuştur (Şekil 3). 458

5 Levrek (Dicentrarchus labrax L.1758) lerde Oksitetrasiklin Kullanımının Nötrofillerin Fagositik Ortalamalar arasında yapılan t-testi sonucu 10. günde ve 17. günde kontrol grubu ortalamaları ile deneme grubu ortalamalarının istatistiki öneme sahip olduğu görülmüştür (p<0,05).x10 6 Şekil 3. Kontrol grubundan ve deneme grubundan yapılan örneklemelerde 1mm 3 kanında belirlenen eritrosit sayısı (*p<0.005). levrek 5. Tartışma ve Sonuç Her geçen gün, artan talebi karşılayabilmek için daha da yaygınlaşan balık yetiştiriciliğinde, bakteriyel balık hastalıklarının tedavisinde antibiyotiklerin kullanılması zorunlu bir gereksinim haline gelmiştir. Ancak, hasta balıkların tedavisinde kullanılacak antibiyotiğin bağışıklık sistemine etkisinin iyi bilinmesi gerekir. Kullanılan terapötik ajanın yan etkilerinin olmaması ve aynı zamanda mikroorganizmaya karşı etkili olması istenilmektedir [2]. Tetrasiklinler, insanlar ve farelerde spesifik savunma faktörlerini etkilemektedir. Örneğin tetrasiklin grubu antibiyotiklerin, in vitro phytohem-agglutinin (PHA), lenfosit transformasyonu (LT), üzerine olumsuz etkiye sahip olduğu bildirilmiştir. Farklı konsantrasyonlarda oksitetrasiklin verilmiş farelerde kırmızı koyun kan hücrelerine (SRBC) karşı gecikmiş tip aşırı duyarlılık (DTH; Delayed-type hypersensitivity) cevabın indirgendiği gözlenmiştir [3]. Ayrıca aynı araştırmacı tetrasiklinlerin, polimorf nükleer lökositlerin (PMNL) fonksiyonlarını (kemotaksis, fagositoz, oksidatif öldürme mekanizması ) da etkilediğini bildirmiştir. Tetrasiklinin 1.0 µg/ml konsantrasyonu normal insan polimorf nuklear lökositlerinin (PMNL) nitroblue tetrazolium (NBT) redüksiyonunu baskılamaktadır. Bu durum PMNL oksidatif metabolizmasını ters yönde etkilemektedir. OTC kullanımının balıkların bağışıklık sistemi üzerine etkisini inceleyen araştırmalar da bulunmaktadır. Ancak bu araştırma sonuçları türlere göre farklılık göstermektedir. Rijkers ve diğ. [4] Kreutzmann a (1977) atfen, oksitetrasiklin ve kloramfenikolün yılan balıkları (A. anguilla) nda eritrosit sayısını azalttığını bildirmiştir. Ayrıca sazanlarda oksitetrasikline bağlı olarak, bazı organlardaki lökositlerin T-hücre mitojenlerine karşı gelişen mitojenik cevabın in vitro olarak yapılan çalışmada azaldığı bildirilmiştir[2,14,]. Araştırma süresince sıcaklık farkından kaynaklanabilecek hataları azaltmak için balıkların stoklandığı tanklardaki su sıcaklığı sabit tutulmaya çalışılmıştır (19±2 C ). Çünkü 459

6 S. Akhan, T. T. Tanrıkul, F. Balta ve R. Serezli sıcaklık hem immun sistemi hem de oksitetrasiklinin emilimini ve atılımını etkilemektedir. Collazos ve diğ. [15] yeşil sazanda (Tinca tinca, L.) yaptıkları bir araştırmada granülositlerin 30 C de 22 C dekine göre daha az fagositik aktiviteye sahip olduklarını gözlemiştir. Rijkers ve diğ. [4] balıklarda sekonder antikor cevabın seviyesinin sıcaklığa bağlı olduğunu, 18 C de tutulan sazanlarda sekonder cevabın primer cevaptan daha kısa sürmesine karşın 20 C de primer cevap sekonder cevaptan 10 kat daha uzun sürdüğünü bildirmiştir. Yapılan araştırmada oksitetrasiklinin levreklerde NBT (+) nötrofil sayısının azaldığı gözlenmiştir. Normal yemle beslenen kontrol grubundan yapılan örneklemelerde NBT (+) nötrofil sayısının yaklaşık 22 adet olmasına karşın, 10 gün boyunca 75 mg/kg OTC verilen deneme grubundan 10. gün sonunda yapılan örneklemede x400 büyütmede her mikroskobik alanda belirlenen ortalama NBT (+) nötrofil sayısı 2 adet olarak bulunmuştur.takip eden örneklemelerde NBT (+) nötrofil sayısının, zamana bağlı olarak arttığı gözlenmiştir. Oksitetrasiklin kesildikten 21 gün sonra deneme grubunda belirlenen NBT (+) nötrofil sayısı kontrol grubunda belirlenen NBT (+) nötrofil sayısına yaklaştığı gözlenmiştir. Hauser ve Remington oksitetrasiklinin 1.0 µg/ml konsantrasyonu normal insan PMNL larının (Nötrofil, bazofil, eozinofil) NBT redüksiyonunu azalttığını bildirmiştir [3]. Araştırmadan elde edilen bulgular, ağız yoluyla verilen 75 mg/kg OTC levrekte NBT (+) nötrofil sayısını azalltığını göstermektedir. Araştırmada elde edilen bulgular oksitetrasiklinin, levrek kanındaki toplam lökosit sayısını azalttığını göstermektedir (Bkz. Şekil 2). Oksitetrasiklin kesildikten sonra deneme grubundan alınan balıklarda lökosit sayısının önce düştüğü daha sonra zamanla normal seviyesine doğru yükselişe geçtiği gözlenmiştir. Oksitetrasiklinin sazanlarda humoral ve hücresel bağışıklığa etkisini araştırırken elde ettiği bulguların bazıları levreklerde ortaya çıkan sonuçları desteklemektedir. Sazanlara enjeksiyonla yüksek dozda oksitetrasiklin verilmeye başlandıktan 37 gün sonra yapılan örneklemelerde, monosit ve lenfosit sayısının % 38 azaldığı gözlenmiştir. Ancak, yüksek dozlu oksitetrasiklin enjeksiyonu dalaktaki mevcut granülosit sayısını %20-30 arttırmıştır [4]. Araştırma sonucunda, oksitetrasiklin verilen deneme grubundaki balıkların eritrosit sayısında herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir. 10 gün süreyle oksitetrasiklin verildikten sonra yapılan ilk örneklemede deneme grubunda belirlenen eritrosit sayısı kontrol grubunda belirlenen sayıdan daha az bulunmuştur. Ancak yapılan 2. örneklemelerde deneme grubunda belirlenen eritrosit sayısı kontrol grubunda belirlenen sayıdan daha yüksek olduğu gözlenmiştir (Şekil 3.). Oysa Rijkers ve diğ. [4] sazanlara yüksek dozda oksitetrasiklin enjeksiyonunun eritrosit sayısını ve hematokrit değerini düşürdüğünü bildirmektedir. Sunulan bulgular OTC nin levreklerde cama yapışan NBT(+) nötrofil ve lökosit sayısını azalttığını göstermektedir. Ancak OTC nin levreklerde spesifik savunma mekanizmaları üzerine etkisi de araştırılmalıdır. Kaynaklar 1. M. M. Mazeaud, F. Mazeaud, Adrenergic responses to stress in fish, In: Stres and Fish. A. D. Pickering (eds.), Academic Press London,,

7 Levrek (Dicentrarchus labrax L.1758) lerde Oksitetrasiklin Kullanımının Nötrofillerin Fagositik 2. M. H. T. van Der Haidjen, W. B. van Muiswinkel, J. L. Grondel, J. H. Boon, Immunomodulating effects of antibiotics, In: Chemotherapy in Aquaculture: From Theory to Reality, Symposium, Paris, March E. W. Hauser, J. S. Remington, Effect of antimicrobial agents on immun response, In: Antimicrobial Therapy. A. M Ristuccia, B. A. Cunha, ( Eds.), Raven Press, New York, 519p G. T. Rijkers, A. G. Teunissen, R. van Oostrerom, W. B. van Muiswinkel, The immun system of cyprinid fish. The immunosuppressive effect of antibiotic oxytetracycline in carp (Cyprinus carpio L.). Aquaculture, 19, , M. Studnicka, A. K. Siwicki, M. Morand, A. Rymuzska, A. Bownik, E. Terech-Majewska, Modulation of nonspecific defence mechanism and specific immune responses after suppresssion by xenobiotics. Journal of Appl. Ichthyol., 16, 1-7, K. Swicki, D. P. Anderson, O. W. Dixon, Comparison of non-specific immunomodulation by oxolinic acid, oxytetracycline and levamisole in salmonids. Vet. Immunol. Immunopathol. 23, , T. Lunden, S. Miettinen, L. G. Lönnström, M. Lilius, G. Bylund, Influence of oxytetracycline and oxolonic acid on immune response of rainbow trout (O. mykiss). Fish and Shellfish Immunology, 8, , T. Lunden, M. Lilius, G. Bylund, Respiratory burst activity of rainbow trout (O. mykiss) phagocytes is modulated by antimicrobial drugs. Aquaculture, 207, , C. Tafalla, B. Novoa, J. M. Alverez, A. Figueras, In vivo and in vitro effect of oxytetracycline treatment on the immune response of turbot, Scophthalmus maximus. J. of Fish Diseases, 22, , D. P. Anderson, In vitro immunization of fish spleen section and NBT, phagocytic, PFC and antibody assays for monitoring the immun response, In: Techniques in Fish Immunology, Fict. 2, J. S. Stolen, T. C. Fletcher, D. P. Anderson, S. L. Kaattari, A. F. Rowley (Eds.), SOS Publications, Fair Haven, NJ 07704, 196p, D. P. Anderson, Immunological indicators: Effect of environmental stress on immune protection and disease outbreks. In: Biological Indicators of Stress in Fish, S. M. Adams (Eds.), American Fisheries Society Symposium,Bethesda, Maryland, 38-50, R. J. Roberts, Fish Pathology, Bailliére Tindall, London, 420p , T. Konuk, Pratik Fizyoloji. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Yayınları, No: 314, Ankara Üniversitesi Basımevi, Ankara, 250s, J. L. Grondel, J.F.M. Nouws, W. B. van Muiswinkel, The influence of antibiotics on the immune system: Immuno-pharmacokinetic investigations on the primary anti-srbc response in carp, Cyprinus carpio L.,after oxytetracycline injection. J. of Fish Diseases, 10, 35-43, M. E. Collazos, C. Barriga, E. Ortega, Effect of high summer temperatures upon granulocyte phagocytic function of the thenc (Tinca tinca, L.). Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis., 18, ,

8 S. Akhan, T. T. Tanrıkul, F. Balta ve R. Serezli 462