MİKOZİS FUNGOİDES TANISINDA HİSTOMORFOLOJİK, İMMÜNOFENOTİPİK (CD3, CD4, CD8) VE T HÜCRE RESEPTÖRÜ γ GEN YENİDEN DÜZENLENMESİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ

Transkript

1 T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ PATOLOJİ ANABİLİM DALI MİKOZİS FUNGOİDES TANISINDA HİSTOMORFOLOJİK, İMMÜNOFENOTİPİK (CD3, CD4, CD8) VE T HÜCRE RESEPTÖRÜ γ GEN YENİDEN DÜZENLENMESİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ Dr. ARBİL AÇIKALIN UZMANLIK TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. İLHAN TUNCER ADANA 2006

2 T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ PATOLOJİ ANABİLİM DALI MİKOZİS FUNGOİDES TANISINDA HİSTOMORFOLOJİK, İMMÜNOFENOTİPİK (CD3, CD4, CD8) VE T HÜCRE RESEPTÖRÜ γ GEN YENİDEN DÜZENLENMESİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ Dr. ARBİL AÇIKALIN UZMANLIK TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. İLHAN TUNCER ADANA 2006 Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Fonu Tarafından Desteklenmiştir. (TF2004LTP21)

3 TEŞEKKÜR Uzmanlık tezimin hazırlanmasında, her aşamada bilgi ve desteklerini esirgemeyen danışman hocalarım, sayın Prof. Dr. İlhan Tuncer e, Doç. Dr. Melek Ergin e, istatistik aşamasındaki emeği için Doç. Dr. Gülşah Şeydaoğlu ya, özverili çalışmaları için biyolog Demet Aras a ve teknisyen Gülafer Korkut a, destekleri için Biokimya Anabilim Dalı Moleküler laboratuarı çalışanlarına ve yetişmemde emeği geçen Patoloji Anabilim Dalı değerli öğretim üyesi hocalarıma teşekkür ederim.

4 İÇİNDEKİLER İÇİNDEKİLER.... i TABLO LİSTESİ ii ŞEKİL LİSTESİ iii KISALTMA LİSTESİ......iv ÖZET VE ANAHTAR SÖZCÜKLER.... v ABSTRACT KEYWORDS..vi 1. GİRİŞ GENEL BİLGİLER Deri dokusunun normal yapısı Deri lenfomaları Mikozis Fungoides Mikozis Fungoides benzeri klinik ve histomorolojiye sahip deri Lezyonları Parapsöriazis Likenoid dermatozlar Spongiotik dermatozlar T-lenfositler ve T-hücre antijen reseptörleri GEREÇ VE YÖNTEM Strept avidin-biotin boyama yöntemi Multiplex PCR Yöntemi le TCR-γ Gen Yeniden Düzenlenmesi Analizi Değerlendirme BULGULAR Histopatolojik Değerlendirme İmmünohistokimyasal Değerlendirme PCR Değerlendirilmesi TARTIŞMA SONUÇLAR KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ...51 i

5 TABLO LİSTESİ Tablo 1: Deri lenfomalarının sınıflandırılması (WHO-EORTC/2004)...4 Tablo 2: Mikozis fungoides in TNMB evrelemesi...8 Tablo 3: Likenoid dermatit çeşitleri..12 Tablo 4: Spongiotik dermatit çeşitleri...14 Tablo 5: Mikozis fungoides olgularının yaş, cinsiyet, lezyon lokalizasyonu, lezyonun dönemi ve klinik evrelerinin dağılımı.25 Tablo 6: MF şüphesi grubundaki olguların yaş, cinsiyet ve lokalizasyon dağılımı..25 Tablo 7: Kontrol grubu hastaların yaş, cinsiyet, lokalizasyon ve tanılarının dağılımı. 25 Tablo 8: Tüm olguların histopatolojik, immünohistokimyasal ve PCR sonuçları ve istatistiksel İlişkisi.35 Tablo 9: Grupların herbiri arasındaki istatistiksel ilişki 35 Tablo 10: Günümüze kadar yayınlanmış olan derinin T hücreli lenfoma (DTHL) ve kronik iltihabi dermatozlarda değişik amplifikasyon yöntemleri kullanılarak çalışılmış T hücre reseptör gen yeniden düzenlenmesi içeren çalışmaların özeti 41 ii

6 ŞEKİL LİSTESİ Şekil 1: Normal derinin şematik (a) ve ışık mikroskobik (b) görünümü...3 Şekil 2: Mikozis fungoides (MF) nin yama (a), plak (b), tümör (c) ve eritrodermi (d) dönemlerine ait klinik görüntüler.7 Şekil 3: T hücre reseptörü (TCR) kompleksi...16 Şekil 4: MF de yoğun lenfoid infiltrasyon,epidermotropizm. Olgu 2, HE, x Şekil 5: MF de Pautrier mikroabseleri. Olgu 3, HE, x Şekil 6: MF de T lenfositlerde yoğun CD3 pozitif boyanma. Olgu 2, İHK, x Şekil 7: MF de infiltre eden lenfositlerin CD4 ile yoğun pozitif boyanma. Olgu 2, İHK, x Şekil 8: MF de CD8 ile negatif boyanma.olgu2, İHK, x Şekil 9: MF de atipik lenfositlerin bazal tabakada lineer epidermotropizmi ve Pautrier mikroabsesi. Olgu 33, HE, x Şekil 10: MF de epidermiste, Langerhans hücreleri etrafında orta büyüklükte, düzensiz sınırlı çekirdeğe sahip atipik lenfositler. Olgu 3, HE, x Şekil 11: MF de T lenfositlerde CD3 ile yoğun pozitif boyanma. Olgu 33, İHK, x Şekil 12: MF de atipik lenfositlerde CD4 ile pozitif boyanma. Olgu 33, İHK, x Şekil 13: MF de CD8 ile atipik lenfositler arasındaki reaktif lenfositlerde pozitif boyanma. Olgu 33, İHK, x Şekil 14: Liken planusta epidermiste akantoz,, granüler tabakada artım, üst dermiste ve tek tek epidermise ilerleyen lenfoid infiltrasyon. Kontrol grubu olgu 10, HE, x Şekil 15: Liken planusta CD3 ile lenfositlerde diffüz pozitif boyanma. Kontrol grubu olgu 10, İHK, x Şekil 16: Liken planusta CD4 ile negatif boyanma. Kontrol grubu olgu 10, İHK, x Şekil 17: Liken planusta CD8 ile lenfositlerde pozitif boyanma. Kontrol grubu olgu 10, İHK, x Şekil 18: Parapsöriazis olgusunda epidermiste spongioz, lenfositlerin epidermise ilerlemesi. MF şüphesi grubu, Olgu 2, HE, x Şekil 19: Parapsöriazis olgusunda lenfositlerde CD3 ile yaygın pozitif boyanma. MF şüphesi grubu, İHK, x Şekil 20: Parapsöriazis olgusunda CD4 ile epidermise ilerleyen lenfositlerde pozitif boyanma. MF şüphesi grubu, olgu 2, İHK, x Şekil 21: Parapsöriazis olgusunda CD8 ile reaktif lenfositlerde pozitif boyanma. MF şüphesi grubu, olgu 2, İHK, x Şekil 22: PCR ile TCR γ gen yeniden düzenlenmesi. 1.kuyucuk; marker, 2. ve 3. kuyucuk multiplex 1 de klonalite pozitif olgular, 4.kuyucuk; poliklonalite, 5. kuyucuk: negatif..34 iii

7 KISALTMA LİSTESİ MF : Mikozis fungoides DTHL : Derinin T Hücreli Lenfoması WHO : World Health Organization EORTC : European Organization for Research and Treatment of Cancer TCR : T Cell Receptor (T Hücre Reseptörü) PCR : Polymerase Chain Reaction (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) LH : Langerhans Hücresi NK : Naturel Killer SS : Sezary Sendromu PUVA : Psoralen Plus Ultraviole A TNMB : Tumor Node Metastasis Blood PAS : Periodic Acid Schiff SD : Spongiotik Dermatit LD : Likenoid Dermatit LP : Liken Planus KOD : Kontakt Dermatit KD : Kronik Dermatit HE : Hematoksilen Eozin İHK : İmmünohistokimya iv

8 ÖZET Mikozis Fungoides Tanısında Histomorfolojik, İmmünofenotipik (CD3, CD4, CD8) ve T-Hücre Reseptörü γ Gen Yeniden Düzenlenmesinin Değerlendirilmesi Mikozis fungoides, baskın olarak CD4 pozitif T lenfositlerin deride neoplastik infiltrasyonu ile karakterizedir. Mikozis fungoidesin erken lezyonlarının tanısı, klinik ve histomorfolojik olarak zorluk arzeder. Mikozis fungoides tanısında yardımcı yöntemler; immünohistokimya ve moleküler biyoloji tekniklerinin konvansiyonel yöntemlere katkısı araştırılmaktadır. Çalışmamızda, immünofenotipik özellikler ve polimeraz zincir reaksiyonu ile T- hücre reseptörü γ gen yeniden düzenlenmesinin tanıdaki yerini saptamayı amaçladık. Çalışma grubuna, 73 olgu (39 klasik histomorfolojiye sahip mikozis fungoides, 16 mikozis fungoides şüphesi, 18 benign inflamatuar dermatozdan oluşan kontrol grubu olgular) dahil edildi. %10 luk formaldehitte tespit edilmiş, parafine gömülü dokulardan elde edilen histolojik kesitlerde rutin hematoksilen eozin boyası ve ışık mikroskobik inceleme yanısıra, immünohistokimyasal yöntemle CD3, CD4, CD8 e karşı antikorlar ile immünofenotipik özellikler, polimeraz zincir reaksiyonu ile T hücre reseptörü γ gen yeniden düzenlenmesi değerlendirildi. Mikozis fungoides ve mikozis fungoides şüphesi olan grupta, CD4 yüzdesi, CD4/CD8 oranı, klonalite varlığı istatistiksel olarak anlamlı bulundu. CD8 yüzdesi ise üç grup arasında istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı. Mikozis fungoides te, histomorfolojik bulgular -tipik olduğunda- altın standart tanı yöntemidir. Ancak, erken lezyonlarda ve mikozis fungoides şüphesi olan olgularda; histomorfolojik bulguların yetersiz kaldığı durumlarda, immünofenotipik değerlendirme ve polimeraz zincir reaksiyonu aracılı T hücre reseptörü γ gen yeniden düzenlenmesi ile klonalite saptanması, mikozis fungoides tanısında yardımcı yöntemler olarak kullanılabilir. Anahtar sözcükler: histomorfoloji, immünofenotip, mikozis fungoides, T hücre reseptörü γ geni. v

9 ABSTRACT The Evaluation of Histomorphological, İmmunophenotypical and T Cell Receptor Gamma Gene Rearrengement Features in Diagnosis of Mycosis Fungoides Mycosis fungoides is characterized with neoplastic infiltration of dominant CD4 positive T lymphocytes. The diagnosis may be diffucult in early lesions, both clinically and histomorphologically. Immunohistochemistry and molecular biology techniques have been researched as an adjunct to the diagnosis of mycosis fungoides. Our aim was to determine the help of immunophenotyping and T cell receptor γ gene rearrengement studies to the histomorphological diagnosis of mycosis fungoides. In this study, immunohistochemically, antibodies to CD3, CD4, CD8 and T cell receptor γ gene rearrengement analysis with a polymerase chain reaction were performed on formalline fixed, paraffin-embedded tissues of 73 cases (39 mycosis fungoides with classical histomorphology, 16 with suspicious histology for mycosis fungoides, 18 benign inflammatory dermatoses as control group). In mycosis fungoides and suspicious for mycosis fungoides groups, CD4 percentage, CD4/CD8 ratio, clonality were statistically significantly different. CD8 percentage was not statistically different between three groups. Histomorphological features if there is- are gold standart for diagnosis of mycosis fungoides. However, in early mycosis fungoides and the suspicious cases; when the histomorphological features are inadequate, immunophenotypical evaluation and T cell receptor γ gene rearrengement with polymerase chain reaction analysis may help to the diagnosis of mycosis fungoides. Key words: histomorphology, immunophenotype, mycosis fungoides, T cell receptor γ gene rearrengement. vi

10 1. GİRİŞ Deri lenfomaları, ekstranodal Hodgkin dışı lenfomalar arasında gastrointestinal sistemden sonra ikinci sıklıkta görülmektedir. T, NK ve B hücre neoplazmlarını içeren tümör grubudur. Derinin T hücreli lenfomaları (DTHL), WHO- EORTC sınıflamasına göre tüm primer deri lenfomalarının yaklaşık %75-80 ini oluşturan heterojen neoplazmlardır. 1 Mikozis fungoides (MF), DTHL lerin en sık rastlanan alt tipidir ve tüm primer kutanöz lenfomaların yaklaşık %50 sini oluşturur. 2 Patologlar ve dermatologlar için MF nin erken lezyonlarının tanısı oldukça zordur ve iyi bir klinikopatolojik korelasyon gerektirir. Bu zorluğun nedeni hastalığın davranışı ile ilgilidir. MF, sessiz ve yavaş gelişir, kesin tanı alıncaya kadar uzun süre, egzema veya parapsöriazis tanıları ile izlenir. 3 Bu dönemdeki lezyonlara tanı verebilmek için çeşitli histomorfolojik kriterler ortaya konmaya çalışılmış, yardımcı yöntemler olarak; immünohistokimyasal araştırmalar ve moleküler genetik çalışmalar yapılmıştır. Ancak halen erken ve sınır lezyonlar için kesin tanı kriterleri oluşturulamamıştır. Tanıya yardımcı olarak immünohistokimyasal yöntemle T hücre antijenleri değerlendirilmektedir. Baskın olarak CD4 antijenine sahip T lenfositlerin varlığı tanıya ışık tutmaktadır. Ancak erken evre lezyonlarda lenfositlerde immünofenotipik değişikliklerin oluşmaması nedeniyle bu bulgu da yardımcı olmayabilir. Son yıllarda çeşitli moleküler biyoloji teknikleri ile baskın T hücre klonlanmasının gösterilmesi diğer konvansiyonel tanı yöntemlerine yardımcı olarak araştırılmaktadır. Bu yöntemler, Southern blot analizi (SBA), polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) aracılı T hücre reseptörü (T cell receptor-tcr) geni yeniden düzenlenmesidir. SBA yöntemini taze dokuda çalışmak gerekmektedir. Bu nedenle arşiv materyalinde, parafin doku bloklarından da çalışılabilen ve daha duyarlı olan PCR yöntemi ile TCR β veya γ gen yeniden düzenlenmesi ile baskın T hücre klonu saptanabilmektedir. Biz, çalışmamızda MF tanısında, klinik, histomorfolojik, immünofenotipik ve PCR yöntemlerinin tanıdaki yerini belirlemek ve erken evre, sınır lezyonlarda tanıya gitmek amacıyla konvansiyonel histopatolojik bulgulara yardımcı yöntemler; immünohistokimya ve PCR ile TCR-γ gen yeniden düzenlenmesi tekniklerinin MF tanısındaki duyarlılık ve özgüllüklerini belirlemeyi amaçladık. 1

11 oluşur. 7 Deride en göze çarpan lenforetiküler eleman, intra-epidermal Langerhans 2. GENEL BİLGİLER Deri lenfomaları, tüm ekstranodal Hodgkin dışı lenfomalar arasında ikinci sıklıkta görülmekte olup tüm Hodgkin dışı lenfomaların 1/3 ünü oluşturur. Derinin T hücreli lenfomaları arasında MF en sık rastlanan alt tipidir. 2 MF, erken dönemde epidermis ve papiller dermis tutulumu ile ortaya çıkan bir CD4+ T hücreli lenfomadır. 4 Deri lenfomaları ve MF ile ilgili verilerden önce derinin normal anatomisi ve lenforetiküler hücreleri hakkında bilgiler sunulacaktır Deri Dokusunun Normal Yapısı Deri, vücudu dış ortama karşı koruyan, biribiriyle bağlantılı hücre ve dokulardan oluşmaktadır. Neonatal dönemde deri gelişimi gebeliğin dördüncü ayında tamamlanır. En dışta epidermis ve altında dermis ve deri altı yağ dokusu tabakalarından oluşur. 5,6 Epidermis, dıştan içe doğru; stratum korneum, stratum granulozum (granüler tabaka), stratum spinozum (malpighi tabakası), stratum bazale (bazal tabaka) tabakalarını içerir. Epidermiste yer alan başlıca hücreler, keratinositler, keratin proteini yapımı yanı sıra sitokin biosentezinde de önemli rol alır. Diğer hücreler; melanositler (güneş ışığındaki zararlı ultraviole ışınlara karşı endojen koruyucu olan melanin pigmenti yapar), Langerhans hücreleri (antijen sunan dendritik hücreler) ve Merkel (görevleri kesin olmamakla birlikte, mekanoreseptör ve cildin nöroendokrin fonksiyonunda rol aldıkları düşünülmekte) hücreleridir (şekil 1,2). 5,7 Dermis, yüzeyde papiller dermis, daha derinde retiküler dermis olarak adlandırılır. Esas komponenti ise kollajendir. Yüzeyel ve derin damar pleksusları, sinir ve deri ekleri içerir. Deri ekleri; kıl follikülleri, sebase bezler, ekrin bezler ve apokrin bezlerdir. Dermis, iltihabi reaksiyonların gerçekleştiği bölgedir. Normalde az sayıda fibroblast, makrofajlar, mast hücreleri, lenfositler ve dermal dendrositler mevcuttur. İltihabi hücreler, sıklıkla perivasküler, periadneksiyel alanlar ve papiller dermiste birikir. 5-7 Deri altı yağ dokusu, ince bağ dokuyla lobüllere ayrılmış, matür yağ dokudan hücresidir (LH). Normal bireylerde epidermisin her santimetreküpünde 20 lenfosite 2

12 karşılık LH mevcuttur. LH, zayıf fagositik, antijen sunan hücrelerdir ve monosit-makrofaj serisinden gelir. Yerli intraepidermal T hücre popülasyonunun %90 dan fazlası matür T hücrelerden oluşur. 8 Bu hücrelerin çoğu αβ T hücre reseptör heterodimeri salgılarken, kalanı bu reseptörün disülfid bağlı formunu salgılayan γδ hücreleridir. İlk grup tipik yuvarlak lenfositlerdir ve CD8 daha çok olmak üzere CD4 pozitif hücrelerden oluşurlar. Esas olarak suprabazal dağılırlar ve epidermal LH lerin uzantıları ile yakın temas ederler. γδ hücreleri ise hafif dendritik morfolojiye sahiplerdir ve epidermisin bazal tabakasında ve kıl folliküllerinin dış köklerinde yerleşirler. Çoğunlukla CD8 pozitiflerdir. 6,8 a Şekil 1a, b: Normal derinin şematik (a) 9 ve ışık mikroskobik (b) 10 görünümü b 2.2. Deri Lenfomaları Primer deri lenfomaları tanı esnasında deri dışı odak olmaksızın gelişen T, NK veya B hücreli lenfomalardır. Ekstranodal Hodgkin dışı lenfomalar arasında gastrointestinal sistemden sonra 1: insidans ile ikinci sırada yer alır. 2 Ayrıca deri, çok çeşitli nodal tip Hodgkin dışı lenfomalar için sık yayılım yeridir; özellikle de düşük ve yüksek dereceli T hücreli lenfomalar hastalık sırasında deri dokusunu tutabilir. Bu nedenle tanı esnasında deri dışı başka odak varlığının araştırılması tedavi açısından oldukça önemlidir. 8 3

13 Ocak 2004 tarihinde, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) ve European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC) grubu primer deri lenfomaları için ortak sınıflama sistemini oluşturmuşlardır (Tablo 1). 2 Tablo 1: Deri lenfomalarının sınıflandırılması (WHO-EORTC/2004) 2 Kutanöz T hücreli ve Naturel Killer(NK) hücreli lenfomalar Mikozis fungoides(mf) MF çeşitleri ve alttipleri Follikülotropik MF Pajetoid retikülozis Granülomatöz gevşek deri Sezary sendromu Yetişkin Thücreli lösemi/lenfoma Primer kutanöz CD30+ lenfoproliferatif hastalıklar Primer kutanöz anaplastik büyük hücreli lenfoma Lenfomatoid papülozis Subkutanöz pannikülit benzeri Thücreli lenfoma Ekstranodal NK/T hücreli lenfoma, nazal tip Primer kutanöz periferal Thücreli lenfoma, belirtilmemiş Primer kutanöz agresif epidermotropik CD-8+ Thücreli lenfoma (geçici antite) Kutanöz γδ T hücreli lenfoma (geçici antite) Primer kutanöz CD4+ küçük/orta boyutlu pleomorfik T hücreli lenfoma (geçici antite) Kutanöz B-hücreli lenfomaları Primer kutanöz marjinal zon B hücreli lenfoma Primer kutanöz follikül merkez lenfoma Primer kutanöz diffüz büyük B hücreli lenfoma, bacak tipi Primer kutanöz diffüz büyük B hücreli lenfoma, diğer İntravasküler büyük B-hücreli lenfoma Prekürsör hematolojik neoplazi CD4+/CD56+ hematodermik neoplazi (blastik NK hücreli lenfoma) 4

14 Mikozis Fungoides DTHL popülasyonda görülme insidansı kişide 0.5 dir. 1 MF, DTHL lerin en sık görülen alt tipidir ve tüm primer kutanöz lenfomaların yaklaşık %50 sidir. 8 İnsidansı yılda her kişide 0,36-0,90 olarak bildirilmiştir. 13 Klasik tip MF, Alibert ve Bazin tarafından 200 yıl önce tanımlanmıştır. MF adı verilmesinin sebebi tümör evresindeki nodüllerin Alibert tarafından mantara benzetilmesidir. 12 Orta ve ileri yaş yetişkinlerde (ortalama yaş 57), erkeklerde 1,6:1 ila 2,0:1 oranında daha sıktır. 13 Nadiren çocuklar ve genç yetişkinlerde de görülebilir. Lezyonlar gövdenin alt kısmı ve kalça gibi güneş görmeyen bölgelerde ortaya çıkar. İleri evrelerde yüz ve skalp dahil olmak üzere vücudun her yerinde görülebilir. 4,14 Etiyopatogenezi henüz bilinmemekle birlikte CD4+ hücrelerin monoklonal çoğalması ile karakterizedir. Neoplastik T hücreler matür deri yerleşimli CD3 pozitif, CD4 pozitif, CD45RO pozitif, CD8 negatif fenotipli hafıza T hücrelerdir. 1 Önceki çalışmalar MF nin antitümör yanıtında CD8+ sitotoksik T hücrelerin kritik rol aldığını göstermektedir. Bu görevlerini hem direk sitotoksik etki, hem de özellikle interferon-γ olmak üzere sitokin üreterek yaparlar. 2 Enfeksiyöz ajanlar (CMV, HTLV-1), mesleki maruziyetler, genetik mutasyonlar etiyolojik faktörler olarak gösterilmiştir, ancak bu nedenlerin kesin kanıtı henüz yoktur. 1 En sık saptanan genetik mutasyonlar; 10q da kromozom kaybı ve p15, p16 ve p53 tümör süpressör gen anormalliklerdir. Ancak MF için tanımlanan özgül kromozomal translokasyon yoktur. 15 Klinik olarak MF e ait lezyonlar sırasıyla yama, plak ve tümör evrelerini içerir. Yama evresinde ince maküler plaklar görülür. Pembemsi kırmızı renkte ve hafif pulludur (şekil 3a). Tek veya çok sayıda olabilir. Gövde ve proksimal ekstremitelerde dağılım gösterirler. 14 Yanı sıra kalça ve memeler gibi güneş görmeyen yerlerin de sıklıkla tutulması, ultraviole spektrumdaki ışınlarla erken evredeki neoplastik hücrelerin kolayca süpresse olması nedeniyledir. 4 Bu evre ilerleme oluşana kadar yıllarca devam edebilir. Bazı yamalar 10 cm yi aşan boyutlara ulaşabilir ki bu da geniş plak parapsöriazis olarak tanımlanır. Poikiloderma atrophicans vasculare ise kronik neoplastik infiltrasyon sonucu MF nin yama evresinin atrofik, depigmente, telenjiektatik görünüm almasına verilen addır. 4,14,16 5

15 Plak evresi, keskin sınırlı, kırmızı veya kırmızı-kahverenkli, sıklıkla annüler veya yay görünümde, sıklıkla pulludur (şekil 3b). Plaklar de novo veya yamalardan gelişebilirler, sıklıkla yamalarla birarada bulunurlar. Erken evrelerde lezyonlar tüm deri yüzeyinin %10 dan azına sınırlıdır, ancak özellikle geç dönemlerde daha yaygın olabilirler. 14,16 Nodül veya tümörler, en nadir görülenlerdir, diğer deri lenfomalarının tümörlerine benzer ancak farklı olarak her zaman beraberinde rezidüel yama ve plaklar vardır. Kırmızı-kahverenkte veya menekşe renklidir, ve ülserasyon oluşabilir. 1 cm veya daha büyük boyutlarda olabilir (şekil 3c). Eskiden d emblee MF terimi, öncesinde yama veya plak bulunmayan tümör lezyonları için kullanılırdı, ancak bu durum sadece MF değil, çeşitli T ve B hücreli lenfomalarda da olabileceği için halen kullanılmamaktadır. 16 MF nin nadir klinik görünümleri, hipopigmente yama ve plaklar, lökoderma, bül, perioral dermatit benzeri lezyonlar, püstüller, akneiform lezyonlar, hiperkeratotik ve verrüköz lezyonlar, akantozis nigrikansı anımsatan plaklar şeklinde olabilir. 4,14,16 Bazı hastalarda maküler lezyonlar periferik kana dökülmeden yaygın hale gelebilir; buna eritrodermik MF denilmektedir (şekil 3d). Periferik dolaşımda %5 in üzerinde atipik lenfositler mevcut ise, bazı araştırmacılar tarafından MF nin lösemik fazı olarak da adlandırılan Sezary Sendromu (SS) adını almaktadır. Her ne kadar SS yi konvansiyonel MF den histolojik olarak ayırmak mümkün değil ise de klinikte ortaya çıkışları, daha fazla kaşıntı ve göze çarpan baş, boyun ve akral bölge (avuç ve ayak tabanı dahil) tutulumu gibi, farklılık göstermektedir. Klinik seyri ve prognozu da daha kötüdür. 4,14,16 6

16 a b c Şekil 2: Mikozis fungoides (MF) nin yama (a), plak (b), tümör (c) ve eritrodermi (d) dönemlerine ait klinik görüntüler. 17 d MF, birincil olarak deriyi tutmakla beraber ileri evrelerde lenf nodu ve diğer organ tutulumları olabilir. Erken evrede lenfadenopati çoğu olguda dermatopatik lenfadenopatiye bağlıdır. Ancak hassas PCR yöntemi ile erken evrede de klonal Thücrelerin infiltrasyonu gösterilmiştir. Visseral tutulum genelde otopsilerde tespit edilmekte, en sık akciğer, dalak, karaciğer ve böbrek tutulumu saptanmaktadır. 7,14 MF nin klinik gidişi oldukça değişkendir. Hastalık sırasında her dönemdeki lezyonda herhangi zamanda spontan gerileme olabilir. EORTC serilerinde 5 yıllık yaşam %87 bulunmuştur. Yama veya plak evresindeki hastalarda median yaşam süresi 10 yıl veya daha uzundur. Kutanöz veya ekstrakutanöz tümör evresi hastalarda ise 5 yıllık yaşam oranı % 50 nin altındadır. Tümör oluşumu ile beraber deride yaygın tutulum, lenf nodu tutulumu ve organomegali kötü prognostik bulgulardır. CD30+ büyük hücreli lenfoma transformasyonu da gerçekleşebilir ve kötü prognostik faktördür. 1,6,14 7

17 MF tedavisinde, hastalık deriye sınırlı olduğu sürede deriye yönelik tedaviler; fototerapi (psoralen plus ultraviole A-PUVA gibi), nitrogen mustard veya chlormustine (BCNU) topikal uygulaması veya radyoterapi tercih edilebilir. 2,14 MF evrelemesi, TNMB (Tumor-Node-Metastasis-Blood) sistemine dayanmaktadır (Tablo 2). 8 Tablo 2: Mikozis fungoides in TNMB evrelemesi T1: Yama, plak veya her ikisi, vücut yüzeyinin %10 dan azının tutulumu T2: Yama, plak veya her ikisi,vücut yüzeyinin %10 ve fazlasının tutulumu T3: Bir veya fazla kutanöz tümörler T4: Eritrodermi N0: Klinik olarak tutulmamış lenf nodu N1: Klinik olarak büyük, fakat histolojik tutulum yok N2: Klinik olarak palpe edilemiyor fakat histolojik tutulum var N3: Klinik olarak büyük ve histolojik tutulum var M0: Visseral hastalık yok M1: Visseral hastalık var B0: Periferik kanda %5 in altında atipik hücre (Sezary hücreleri) var B1: Periferik kanda %5 in üzerinde atipik hücre (Sezary hücreleri) var Evre grupları IA T1N0M0 IB T2N0M0 IIA T1-2N1M0 IIB T3N0-1M0 IIIA T4N0M0 IIIB T4N1M0 IVA T1-4N2-3M0 IVB T1-4N0-3M1 8

18 Histopatoloji: MF, lenfositlerin papiller dermiste değişik yoğunlukta infiltrasyonu ve bu hücrelerin epidermise ilerlemesi (epidermotropizm) ile karakterizedir. Farklı klinik evrelerde histolojik tablo değişiklik gösterir. Klasik MF lezyonunda histomorfolojik olarak beklenen bulgular; lenfositlerin süperfisiyel dermiste band tarzı infiltrasyonu, küçük-orta çaplı, çentikli (serebriform) atipik lenfositlerin epidermise ilerlemesi, atipik hücrelerin intraepidermal kümelenmesi (Pautrier mikroabsesi) dir. 2 Histolojik görünüm, erken dönemde her zaman tipik olmayabilir, ayrıca tedavide uygulanan; kortikosteroid veya ultraviole (epidermotropizmi ve hücresel infiltrasyonu azaltan bir radyasyon tedavisi) ile de morfoloji değişebilir. 3 Yama evresi; Hafif genişlemiş papiller dermiste seyrek lenfosit infiltrasyonu vardır. İnfiltrasyon, yüzeyel pleksusun damarları çevresinde kümelenme eğilimindedir. Epidermiste, bazal tabakada sınırlı lenfositler vardır. Bu lenfositler boncuk dizisi veya hücre grupları halinde bulunurlar ve sıklıkla çevrelerinde şeffaf halo bulunur, ancak spongioz yoktur veya çok azdır. 2 Bu evrede Pautrier mikroabsesi -epidermiste, keskin sınırlı, birbirine yakın yerleşmiş lenfosit grupları- beklenmez. Papiller dermiste rastgele yerleşmiş kollajen bantlardan oluşan fibrozis vardır. Epidermiste hafif akantozis olabilir; poikilodermatik ve atrofik lezyonlarda ise epidermis incedir. 4 Bazı olgularda liken planusu anımsatan belirgin likenoid reaksiyon vardır. Liken planusun tersine atipik lenfositler yanı sıra plazma hücresi ve eozinofiller olabilir. 16 Yama ve diğer evrelerde ekrin bez yapılarına da infiltrasyon olabilir ve tedavi sonrası kalabilir. Yama evresinde lenfositlerde fark edilebilir nükleer atipinin görülmesi konvansiyonel histolojik kesitlerde oldukça zordur. Büyük büyütmede (x1000) nükleer kıvrım sıklıkla fark edilebilirse de rutin kesitler kalın olduğu için neoplastik lenfositleri nonneoplastik olanlardan ayırt etmek zordur. İntraepidermal lenfositler büyük olasılıkla neoplastik olduğu için ayırmak daha kolay olabilir, ancak papiller dermiste nonneoplastik lenfositlerle bir arada bulunmaları tanıda zorluk yaratır. Epidermiste yerleşen lenfositler, papiller dermistekilere kıyasla hafif genişçe ve daha koyu boyanan çekirdeklere sahiptirler. 3,18 Plak evresi; Yama ve plak evreleri birbirinin devamıdır. Bu evrede, lenfosit infiltrasyonu daha yoğun ve atipik lenfositler daha sıktır. Lenfositler μm çaplı ve çekirdekleri genelde çentikli, serebriform veya kırışmış görünümdedir. Çentikler en iyi ince kesitlerde görülür. Küçük hücre grupları yüzeyel pleksusta damarlar 9

19 çevresinde ve daha nadir derin pleksusta toplanabilir. Ayrıca, adnekslerin, özellikle pilosebasöz folliküllerin etrafına da uzanırlar. Atipik lenfositler yanısıra sıklıkla az sayıda eozinofil ve bazen plazma hücreleri infiltrasyonu görülebilir. Epidermotropizm halen göze çarpan bulgudur. Pautrier mikroabseleri %50 den fazla biyopside vardır. Epidermiste parakeratozis, hafif-orta derecede psöriaziform hiperplazi ve epidermal müsinozis olabilir. Hafif spongioz olması MF yi ekarte ettirmez. 3,4,16 Tümör evresi; Bu evrede neoplastik hücreler retiküler dermiste yoğunlaşır ve epidermotropizmin derecesi ve Pautrier mikroabseleri azalır. 16 Tümör hücrelerinin reaktif hücrelere oranı artmıştır, mitoz kolayca görülür. Tüm dermis tutulmuştur, derialtı yağ dokuya da ilerleyebilir. Dağınık eozinofiller, plazma hücreleri ve makrofajlar bulunabilir. İnfiltrasyonun %25 den fazlasını büyük ve çentikli lenfositler oluşturduğu zaman transforme MF olarak isimlendirilmektedir. 4 Klinik olarak yama, plak ve tümör dönemindeki MF li hastaların biyopsilerinde beklenmedik histopatolojik bulgular olabilir. Bunlardan en göze çarpanı granülomatöz MF dir. Genelde küçük ve tüberkülid tipidir fakat palizatlanmış olarak granüloma annülareyi anımsatabilirler. Multinükleer histiosit grupları vardır. 4,16 Anjiosentrik MF diğer bir varyanttır. Sıklıkla klasik MF içinde atipik lenfositlerden oluşan vaskülit görülür. Pilotropik (folliküler) MF, keratin tıkaç ile dolu komedo benzeri dilate folliküller ve geniş epidermal kistler; duvarlarında atipik lenfosit infiltrasyonu (pilotropizm) ile karakterizedir. 4 Ackerman et al ın çalışmasına göre, önemli histopatolojik bulgular şunlardır; Pautrier mikroabseleri, şeffaf perinükleer halo içeren lenfositler, bazal tabakada dizilen lenfositler, dermiste çentikli çekirdeğe sahip lenfositler, dermistekilerden büyük epidermal lenfositler ve epidermotropizm. 19 Ancak erken dönem lezyonlarda bu bulguları saptamak genellikle güçtür. MF yi diğer inflamatuar dermatozlardan ayırmak özellikle erken dönemlerde genellikle çok zordur ve dermatopatologlar arasında uzlaşmaya varılamamıştır. 3,18 MF ile özellikle karışan lezyonlar; parapsöriazisler (bir kısmı erken MF olarak kabul edilmekte), likenoid ve spongiotik dermatitlerdir. 10

20 2.3. MF benzeri klinik ve histomorfolojiye sahip deri lezyonları Özellikle erken dönem MF, başlıca spongiotik ve/veya likenoid mikroskopik görünüm sergileyen deri lezyonlarını taklit edebilir. Spongiotik dermatitlerde; lenfositlerin dermal infiltrasyonu kadar, az sayıda lenfositin epidermise ilerlemesi, ek olarak MF kronik yama döneminin bulgusu olan papiller dermal fibrozis ve hiperkeratozun da görülmesi histomorfolojik karışıklığa yol açabilir. Genellikle MF de daha hafif olmakla birlikte spongioz da görülebilmekte, hatta Pautrier mikroabsesini anımsatan gruplar oluşturabilmektedir. MF de görülen; çoğunluğu çentikli lenfositlerden oluşan, yuvarlak sınırlı Pautrier mikroabsesinin tersine, spongiotik dermatitlerde matara görünümünde olup, lenfositler, makrofajlar, Langerhans hücreleri ve dejenere keratinositlerden oluşan heterojen görünüme sahiptir. Likenoid dermatitlerden özellikle liken planus ve likenoid ilaç erüpsiyonlarında band tarzı lenfosit infiltrasyonu, papiller dermal fibrozisle beraber olabilir. Ancak likenoid dermatitlerde görülen baziler keratinositlerin harabiyetinin yol açtığı retelerde dişli görünüm MF de nadirdir. 4 Parapsöriazis, histomorfolojik olarak epidermise de ilerleyen papiller dermal lenfosit infiltrasyonu sergilemesi nedeniyle MF ayırıcı tanısında yer almakta; geniş plak tipi ise erken MF olarak kabul edilmektedir. 16 Tüm bu lezyonlarda görev alan lenfositlerin immünofenotipik olarak CD4 ve CD8 pozitif hücrelerden oluşması ayırıcı tanıyı zorlaştırmaktadır. Bu noktada, yardımcı yöntem olarak moleküler teknikler araştırılmaktadır Parapsöriazis Klinik olarak psöriazisle olan bazı benzerlikleri nedeniyle böyle isimlendirilen asemptomatik, pullu heterojen dermatoz grubudur. Kronik seyri ve tedaviye dirençli olmaları ile karakterizedir. Bu grubun içinde şu hastalıklar yer alır; kronik süperfisyel dermatit (küçük plak parapsöriazis, dijitat dermatoz) ve geniş plak parapsöriazis (atrofik parapsöriazis, retiform parapsöriazis, yama evresi MF). Kronik süperfisiyel dermatit (küçük plak parapsöriazis); gövde ve proksimal ekstremitelerde simetrik dağılan, pembe-sarı, hafif pullu, oval veya hafif elonge, sıklıkla parmak izi benzeri 1-5 cm çaplı yamalar şeklinde ortaya çıkar. Histopatolojik olarak epidermiste hafif spongioz, lenfosit egzositozu, hafif akantoz ve karakteristik 11

21 olarak üzerinde plazma bulunan basket örgüsü parakeratoz mevcuttur. Papiller dermiste hafif süperfisiyel perivasküler matür lenfositik infiltrasyon vardır. Geniş plak parapsöriazisde psöriaziform epidermal hiperplazi, bazal vakuoler değişiklikler ve epidermotropizm sıklıkla görülür. MF gelişiminde bir evre olarak kabul edilir. 4,16, Likenoid (interface) dermatitler Likenoid inflamasyon, lenfositlerin dermoepidermal bileşkede yoğun bant tarzı infiltrasyonudur. Epidermis kalınlığı, egzositotik lenfositlerin miktarı ve bazal hücre tabakasının bütünlüğüne bağlı olarak değişkendir. Hipergranülozis, gecikmiş epidermal matürasyonun sonucu olarak gelişir. Apoptotik veya nekrotik keratinositler (civatte cisimleri) sıklıkla görülür. Pigment inkontinansı mevcuttur. Lenfositlerin yoğun olduğu likenoid dermatit çeşitleri tablo 3 de sunulmuştur. 4 Tablo 3: Likenoid dermatit çeşitleri Liken planus Liken planus varyantları Atrofik liken planus Hipertrofik liken planus Lineer liken planus Ülseratif (eroziv) liken planus Liken planus eritematozus Eritema diskromikum persistans Liken planus aktinikus Liken pilanopilaris Liken planus pemfigoides Keratozis likenoides kronika Lupus eritematozus-liken planus overlap sendrom Liken nitidus Liken striatus Liken planus benzeri keratozis Pitriazis likenoides et varioliformis acuta (PLEVA) Eritema multiforme 12

22 Tablo 3 ün devamı GrafTversus-host hastalığı Lupus eritematozus Parapsöriazis Liken planus: Etiyolojisi bilinmeyen, sık rastlanılan erüpsiyondur. Dirseklerin fleksör yüzlerinde, gövde, kalça ve genital bölge yanı sıra oral lezyonlar da sıktır. Menekşe rengi, düz yüzeyli, sıklıkla kaşıntılı papüllerdir. Patogenezinde hücre aracılı immün reaksiyon rol almaktadır. Bu reaksiyonu başlatanın ise virüs, ilaç veya allojenik bir hücrenin epidermal keratinositlerin antijenisitesinde yaptığı değişiklik olduğu düşünülmektedir. Hücresel yanıt başlangıçta CD4 + lenfositler ile olmaktadır. CD8 + hücreler keratinositler üzerindeki MHC I ilişkili antijeni tanırlar ve apoptozis ile onların ölümüne yol açarlar. Sonuçta, esas rolü CD-8 + hücreler oynarken, artmış sayıda bulunan CD4 + hücreler ise geleneksel yardımcı rollerini yürütürler. Lenfositlerin interface bölgede toplanmasının sebebi monokin-interferon gamma (monokine induced by interferon-γ-mig) dır. 4,14 Histopatolojik olarak; epidermiste hiperkeratoz, kama şeklinde hipergranülozis, zamanla retelerde testere dişi görünümü saptanabilir. Bazal hücre hasarı sonucu çok sayıda, civatte cisimleri vardır. Papiller dermiste PAS pozitif, diastaz dirençli kolloid cisimler görülür. İnterface alanda band tarzı, bazen bazal tabakaya ilerleyen lenfosit infiltrasyonu görülür Spongiotik dermatitler Spongiozis, intraepidermal keratinositler arasında ödem sıvısı olması ile karakterizedir; bazı olgularda vezikül oluşumuna ilerleyebilir. Spongiotik dermatitler, akut, subakut ve kronik olabilirler. Dinamik seyri vardır ve her bir tipi akut fazdan kronik faza ilerleyebilir. Spongiotik dermatit çeşitleri tablo 4 de sunulmuştur. Histolojik görünüm akut, subakut veya kronik faza göre değişir. Akut fazda; stratum korneum normal, epidermis normal kalınlıktadır. Spongiozisin derecesi değişkendir. Papiller dermal ödem olabilir. Süperfisyel pleksusta lenfohistiositik infiltrasyon vardır. Spongiotik epidermise lenfositlerin egzositozu vardır. 13

23 Subakut fazda; sıklıkla hafif-orta şiddette spongioz ve sıklıkla mikrovezikülasyon vardır. Parakeratotik stratum korneumda plazma ve nötrofiller olabilir. Akut fazdan daha hafif şiddette süperfisiyel perivasküler lenfohistiositik infiltrasyon vardır. Kronik fazda; parakeratoz ve hiperkeratoz, sıklıkla hipergranüloz, ortabelirgin akantoz vardır. Spongioz minimal ve fokaldir. İnflamatuar hücre infiltrasyonu seyrek, papiller dermal fibrozis belirgin olabilir. 4 Spongiozun hafif olduğu olgularda, lenfositlerin epidermise egzositozu MF deki epidermotropizm ile ayırımda zorluk yaratabilir. Tablo 4: Spongiotik dermatit çeşitleri. Egzematöz dermatitler Atopik dermatitler Alerjik kontakt dermatit Fotoallerjik ilaç erüpsiyonu İrritan kontakt dermatit Nummuler egzema Dishidrotik dermatit Parapsöriazis, küçük plak tipi Polimorfik ilaç erüpsiyonu Liken striatus Kronik aktinik dermatit Aktinik prurigo, erken dönem id reaksiyonu Seboreik dermatit Staz dermatiti Eritroderma Miliaria Pitriazis rozea Papüler akrodermatit 14

24 2.4. T lenfositler ve T hücre antijen reseptörleri T lenfositler, timüs dokusunda immatür prekürsörlerden meydana gelirler. Matür T hücreler, periferik kanda tüm lenfositlerin %60-70 ini oluştururlar. Periferal lenfoid organlarda da T hücre zonunda yer alırlar; örneğin, lenf nodlarının parakortikal alanları ve dalakta periarteriolar kılıflar gibi. Her T hücresi genetik olarak, antijene özgü TCR aracılığı ile özgül hücre bağımlı antijenleri tanımaya programlanmıştır. 6 Her TCR beş polipeptid zincirinden oluşan grup ile nonkovalent bağlıdır. Bunlardan üç tanesi CD3 moleküler kompleksini oluştururlar ve iki tanesi de ζ zincirinin dimeridir. CD3 ve ζ proteinleri sabittir. Antijen bağlamazlar ancak TCR antijene bağlandıktan sonra sinyallerin T hücreye iletilmesinde rol alırlar. 6,8 TCR leri çok sayıda peptidi hatırlarlar; her T hücresi tek yapı ve özgüllükte TCR salgılar. TCR çeşitliliği, TCR zincirlerini kodlayan genlerin somatik yeniden düzenlenmesi ile meydana gelir. Her somatik hücre germ yaprağından TCR genlerine sahiptir. 8 Her T hücresi yegane DNA yeniden düzenlenmesine (dolayısıyla yegane TCR) sahip olduğu için poliklonal (nonneoplastik) T hücre proliferasyonunu monoklonal (neoplastik) T hücre proliferasyonundan moleküler yöntemlerle ayırmak mümkündür. 6,8 Dört adet TCR altünitleri vardır: α, β, γ, δ zincirleri. TCR zinciri yaklaşık 300 aminoasit uzunluğundadır ve iki bölge (domain) içerir: değişken (variable-v) bölge; oldukça değişken sekanslar içeren ekstrasellüler N-terminal kısım, ve sabit (constant-c) bölge; kısa sitoplazmik kuyruk içeren yüklü transmembran kısımdır. TCR molekülleri, normal Thücre yüzeylerinde membrana bağlı şekilde αβ ve δγ heterodimerleri olarak bulunurlar. αβ TCR taşıyan T hücreleri yetişkinlerde baskındır ve ayrıca transmembran koreseptör CD4 (yardımcı T hücreler) veya CD8 (süpressör veya sitotoksik T hücreleri) salgılayan hücrelere bölünebilirler. Yardımcı T hücreler class II moleküllere bağlı peptid antijenleri tanırlar, CD4 koreseptörü kullanarak bağlanırlar ve intrasellüler sinyali arttırırlar. Süpressör veya sitotoksik T hücreler class I moleküllere bağlı peptid antijenleri tanırlar ve benzer şekilde koreseptör CD8 i kullanarak bağlanır ve sinyali arttırırlar (şekil 3). 6,8 15

25 δγ T hücreler, tüm T hücrelerin küçük bir kısmını oluştururlar (%1-2), ancak intraepitelyal T hücrelerin yaklaşık %10 u δγ TCR içerir. 8 Bu hücreler koreseptör bağımlı görünmemektedir. Peptidler, lipidler ve küçük molekülleri tanırlar. 6 Thücre reseptör γ zinciri (TCR-γ) geni T hücre gelişimi sırasında yeniden düzenlenecek ikincil gendir. Bu gen, 11 fonksiyonel V bölgesi eksonları ve dört fonksiyonel birleşme (J-joining) bölgesi eksonları içerir. 21 Yeniden düzenlenme sırasında bir adet V bölgesi eksonu, bir adet J bölgesi eksonu ile yeniden birleşir. Yeniden oluşan gende yaklaşık rasgele seçilmiş nükleotidler V ve J eksonlarını birleştirirler. V bölgesi eksonları ise sekans homolojileri temel alınarak dört adet aile olacak şekilde gruplandırılır. J bölgesi eksonları ise sekans homolojileri ve kullanım sıklıklarına göre iki aileye ayrılır. J1 ve J2 yeniden düzenlenmiş TCR γ zinciri genlerinin homolojileri yüksek olup yaklaşık %90 ında kullanılmıştır (J major). 21 Şekil 3: T hücre reseptör (TCR) kompleksi

26 3. GEREÇ VE YÖNTEM Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Dermatoloji ve Patoloji Anabilim Dallarında tanı ve izlemi yapılan 35 adet MF hastasına ait 39 adet biyopsi, 16 adet MF şüphesi olan olgular, 18 adet interface ve spongiotik dermatit içeren kontrol grubu olguları çalışmaya alındı. %10 luk formaldehitte tespit edilen dokular, doku takip işleminden sonra bloklanarak 5 mikronluk seri kesitlerde hematoksilen eozin boyalı preperatlar hazırlandı. Işık mikroskobunda incelendi. Histolojik kesitler immünohistokimyasal boyama için özel polysinli lamlara alındı. PCR için ise 5-10 mikronluk yaprak örnek alındı. Çalışma grubuna alınan olguların parafin bloklarından hazırlanan kesitlere Strept Avidin-Biotin kompleks immünperoksidaz yöntemi ile CD-3 (Dako N1580), CD4 (Zymed ), CD8 (Dako N1582) uygulandı. Tüm antikorlar için pozitif kontrol olarak tonsil dokusu kullanıldı. Hazırlanan örnekler ışık mikroskobunda değerlendirildi. Ayrıca olguların parafin bloklarından hazırlanan kesitlere PCR yöntemiyle TCR gamma gen yeniden düzenlenmesi ile multiplex 1, multiplex 2 ve multiplex 3 olarak gruplandırılan primer dizilerini içeren monoklonal bant varlığı değerlendirildi Strept avidin-biotin boyama yöntemi Dokuların hazırlanması Parafin bloklardan 5 mikron kalınlığında alınan kesitler 60 ºC lik ısıda etüvde dakika arası sürede üzerindeki parafin eriyene dek bekletildi. Kesitler, aynı etüv içerisindeki ksilollü şale içerisinde 10 dakika tutuldu. Etüvden çıkarılan kesitler önce üç ayrı ksilollü şalede, sonra %95 alkollü üç ayrı şalede beşer dakika tutularak distile suda iyice yıkanarak deparafinize edildi. Endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için %3 lük H 2 O 2 (hidrojen peroksid) in distile sudaki solüsyonunda beş dakika inkübe edildi ve distile suda iyice yıkandı. 17

27 Boyanma evreleri: 1- Lamlar mikrodalgaya dayanıklı özel şalelerde ph 6 sitrat buffer solüsyonu içerisine sıralanarak Beko marka 1550 model mikrodalga fırında medium konumunda yedişer dakika iki kez çevrilerek inkübe edildi. Daha sonra oda ısısında dakika soğumaya bırakıldı. 2- ph 7,2-7,4 PBS (0,01 M Phosphate Buffer Saline) de 3-5 dakika yıkandı. 3- Doku çevresi silinerek dokular nemli bir ortamda yatay konularak üzerine PAB (primary antibody) damlatıldı. a) CD4 +4 ºC de bir gece bekletildi. b) CD3 ve CD8 oda ısısında 90 dakika bekletildi. 4- PBS de 3-5 dakika yıkandı. 5- Kesit çevresi silindikten sonra sekonder antibody (biotinli) damlatılarak 20 dakika oda ısısında inkübe edildi. 6- PBS de 3-5 yıkandı. 7- Kesit çevresi silindikten sonra HRP-strept avidin damlatılarak 30 dakika oda ısısında inkübe edildi. 8- PBS de 3-5 dakika yıkandı. Kesit çevresi silindi. 9- AEC kromojen damlatıldı dakika sonra mikroskop altında boyanma olup olmadığı kontrol edilerek dokular distile suya alındı. 10- Mayer Hematoksilen de 1-3 dakika zemin boyaması yapıldı ve musluk suyunda 3-5 dakika yıkandı. 11- Kesitler distile sudan geçirildi, su bazlı kapatma maddesi (Scytek Aqueous Mont Low Viscosity) ile kapatıldı. 18

28 3.2. Multiplex PCR Yöntemi ile TCR-γ Gen Yeniden Düzenlenmesi Analizi Dokudan Parafinin Uzaklaştırılması mg formalinle tespit edilmiş, parafin bloğa gömülmüş doku örneklerinden 10 μ kalınlığında yaprak kesilerek, 1,5 ml lik ependorf tüplerine alındı. 2-1 ml ksilol eklendi, 56 ºC de 15 dakika beklendi. 5 dakika rpm de santrifüj edildi, üstteki sıvı döküldü. Bu işlem 3-4 defa tekrarlandı. 3-1 ml %100 etanol eklendi, 5 dakika rpm de santrifüj edildi, üstteki sıvı döküldü. 4-1 ml %80 etanol eklendi, 5 dakika rpm de santrifüj edildi, üstteki sıvı döküldü. 5-1 ml %60 etanol eklendi, 5 dakika rpm de santrifüj edildi, üstteki sıvı döküldü. 6-1 ml %40 etanol eklendi, 5 dakika rpm de santrifüj edildi, üstteki sıvı döküldü. 7-1 ml çift distile su eklendi, 5 dakika rpm de santrifüj edildi, üstteki sıvı döküldü. DNA İzolasyonu Dokudan parafinle uzaklaştırma ve DNA izolasyonu Roche firmasının High Pure PCR Template Preparation Kit Cat. No: ile elde edilmiştir. 1- Dokular 200 μl doku buffer ve 40 μl proteinaz K ile karıştırıldı, 37 ºC de 1 gece bekletildi. 2- Üzerine 20 μl proteinaz K eklendi, 1-2 saat 55 ºC de bekletildi. 3- Üzerine 200 μl bağlanma buffer eklendi, +70 ºC de 10 dakika beklendi. 4- Üzerine 100 μl isopropanol eklendi, karıştırıldı. 5- Filtreli tüplerin altını örnek sayısı kadar dizip üzerine filtreli tüp koyduktan sonra kapağını kapatıp üstlerine numaraları yazıldı. 6- Karışım filtreli tüplere konuldu, 1 dakika rpm de santrifüj edildi. 7- Alttaki tüp atıldı, yerine temiz tüp kondu. 19

29 8- Filtreli tüpün üzerine 500 μl uzaklaştıran buffer eklendi, alt üst edildikten sonra 1 dakika rpm de santrifüj edildi. 9- Alttaki tüp atıldı, yerine temiz tüp kondu. 10- Filtreli tüpün üzerine 500 μl yıkama buffer eklendi, alt üst edildikten sonra 1 dakika rpm de santrifüj edildi. 11- Alttaki tüp atıldı, yerine temiz tüp kondu ve 11 numaralı basamaklar tekrarlandı. Sonra alttaki tüpün içindeki sıvı döküldü ve tekrar filtreli tüpün altına konup maksimum hızda rpm de tekrar santrifüj edildi ml ependorf tüpün kapağına numara yazılıp filtreli tüp bu ependorfun içine kondu ve üzerine 200 µl C de ısıtılmış sulandırma buffer eklendi, 1 dakika rpm de santrifüj edildi. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) β globulin PCR; β globulin amplifikasyonu için kullanılan oligonükleotid primerler, Hind III bölgesine ait 268 bp lik; Primer 1 (PCO4) = 5 -CAA-CTT-CAT-CCA-CGT-TCA-CC-3. Primer 2 (GH20) = 5 -GAA-GAG-CCA-AGG-ACA-GGT-AC PCR core kit (Promega M7660) ve yukarıdaki şekilde düzenlenen primerler kullanılarak, steril 0,2 ml lik mikrosantrifüj tüpünün içine herbir örnek için aşağıda belirtilen miktarlar kullanılarak PCR karışımı hazırlandı Ektrasyon örneği 10 µl. 10XPCR(10 mmol/l Tris HCl, ph 8,3, 50 mmol/l KCl) 2,5 µl. (Finalkonsantrasyon 1XPCRbuf.) 25 Mm MgCl 2 3 µl. (Final konsantrasyon 3 mmol/l) 10 mmol/l dntp 1 ml.(final konsantrasyon 0,2 mmol/l) Spermidin 2 µl. (Final konsantrasyon 0,01gr/L) 50 ku/ltaq DNA Polimerase 0,125 µl. P1 (PCO4) 0,25 µl. P2 (GH20) 0,25 µl. Distile su 6 µl. Toplam 25 µl 2- Hazırlanan karışıma bir damla mineral oil konup PTC-programmable Thermal Cycle system marka termal cyclerde: 20

30 saat dak sn. 1. basamak 95 o C basamak 94 o C basamak 55 o C basamak 72 o C basamak 2 ye git 35 döngü 6. basamak 72 o C basamak +4 o C basamak SON olacak şekilde programlandı. T Hücre Reseptör (TCR) γ Geni PCR I- Multiplex-1 Hind III-X bölgesine ait Aile I ( bp)/Aile II(90-120bp) J Major oligonükleotid primerler; Aile I V-bölgesi: TJG5 5 -AGG-GTT-GTG-TTG-GAA-TCA-GG-3 Aile II V-bölgesi: TCR1 5 -CAT-CCA-CTC-TCA-CCA-TTC-ACA-AT-3 J1/J2 :J17 5 -GTT-CCA-CTG-CCA-AAG-AGT-TTC-TT-3 II- Multiplex-2 Hind III-X bölgesine ait Aile III ( bp)/Aile IV (90-120bp) J Major oligonükleotid primerler: Aile III V-bölgesi: TCR2 5 -CAG-ATG-TCA-TTC-ACT-GGT-ACT-G-3 Aile IV V-bölgesi: TCR3 5 -CTT-CCA-ACT-CCA-CTT-TGA-AAT-A-3 III- Multiplex-3 Hind III-X bölgesine ait Aile I ( bp)/ Aile II ( bp) J Minor oligonükleotid primerler: Aile I V-bölgesi:TJG5 5 -AGG -GTTGTG-TTG-GAA-TCA-GG-3 Aile II V-bölgesi:TCR1 5 -CAT-CCA-CTC-TCA-CCA-TTC-ACA-AT-3 Jp1/Jp2 :TCR4 5 -GTT-ACT-ATG-AGC-(C/T)T-AGT-TT-3 21

31 PCR amplifikasyonu Her multiplex için PCR core kit (Promega M7660) ve yukardaki düzenlenen primerler kullanılarak, steril 0,2ml lik mikrosantrifüj tüpünün içine her bir örnek için aşağıda belirtilen miktarlar kullanılarak PCR karışımı hazırlandı. Ektrasyon örneği 10 µl. 10XPCR (10 mmol/l Tris HCl, ph 8.3, 50 mmol/l KCl) 5 µl. (Final konsantrasyon 1XPCR) 25 Mm MgCl 2 8 µl. (Final konsantrasyon 4 mmol/l) 10 mmol/l dntp 1 ml (Final konsantrasyon 0.01gr/L) 50 ku/ltaq DNA Polimerase 0,3 µl TJG5 (Multiplex-1 ve 3 için) 1 ml TCR1 (Multiplex-1 ve 3 için) 1 ml J17 (Multiplex-1 için) 1 ml TCR2 (Multiplex-2 için) 1 ml TCR3 (Multiplex-2 için) 1 ml TCR4 (Multiplex-3 için) 1 ml Distile su 18 µl Toplam 50 µl Hazırlanan karışıma bir damla mineral oil konup PTC-programmable Thermal Cycle system tipi termal cyclerde: saat dak. sn. 1. basamak 95 0 C de basamak 94 0 C de basamak 58 0 C de basamak 72 0 C de basamak 2 ye git 35 döngü 6. basamak 72 0 C de basamak +4 0 C de basamak SON olacak şekilde programlandı. 22

32 PCR Ürünlerinin Görüntülenmesi Oluşan PCR ürününden 10 μl alındı ve 2 μl yükleme buffer ile karıştırılıp, vertikal %8 lik etidium bromid ile boyalı poliakrilamid jelde 250 V da 2-2,5 saat 1XTBE bufferda ve 20x16 cm çift taraflı poliakrilamid jelde yürütüldü. Jel, UV ışığı kullanılarak görüntülenip, fotoğraflandı Değerlendirme Bu çalışmada, olgulara ait hematoksilen eozin boyalı kesitlerde ışık mikroskobu ile histomorfolojik değerlendirme yapıldı. İmmünohistokimyasal olarak uygulanan CD3, CD4 ve CD8 antikorları ile bağlanma özellikleri ve renklendirici substrat olarak AEC (Aminoethylcarbogal) kullanılmasından dolayı sitoplazmik ve membranöz kırmızı boyanış pozitif kabul edildi. Her kesitte büyük büyütmede (x400) 200 adet CD3 pozitif boyanan lenfoid hücre sayıldı. CD4 ve CD8 ile pozitif boyanan hücre sayısı tespit edildikten sonra toplam sayıya oranı üç hasta grubunda yüzde (%) olarak belirlendi. PCR ürününde jelin çekilen fotoğrafı üzerinden her aile için belirlenen band aralıklarında tek veya çift band varlığı pozitif kabul edildi. Band görülmeyen ürünler negatif, ikiden fazla bant içeren olgular poliklonal olarak kabul edildi. Her multiplex için üç hasta grubundaki pozitif band varlığı saptandı. Histopatolojik bulgular, immünohistokimyasal boyama ve PCR sonuçları her üç hasta grubu arasında ki-kare testi ile değerlendirildi. 23

33 4. BULGULAR Bu çalışmada Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi (ÇÜTF) Patoloji Anabilim Dalı nda tanı almış, 39 Mikozis fungoides (35 olgu), 16 MF şüphesi olan, 18 interface ve spongiotik dermatit olgusuna ait biyopsi örneklerinin histomorfolojik, immünohistokimyasal ve PCR bulguları karşılaştırıldı. MF hastaları na ait tedavi ve takipleri ÇÜTF Dermatoloji Anabilim Dalı arşivindeki dosyalarında incelendi. Dört hastanın dosyasına ulaşılamadı. MF grubunun 18 i kadın, 17 si erkek olup yaş ortalaması 54,3 (5-82) idi. Beş ve sekiz yaşlarında iki çocuk hasta vardı. 35 olgunun 15 i gövde, altısı tüm vücut, altısı gövde ve ekstremitelerde, üçü alt ekstremitelerde, biri glutea, biri glutea ve gövde, biri glutea ve alt ekstremitelerde, biri aksiler ve inguinal bölge ve biri ense yerleşimli idi. 17 yama, 12 plak, üç yama ve plak, iki eritrodermi ve bir tümör dönemine ait lezyonlardı. Olguların 18 i evre 1B, 14 ü evre 1A, ikisi evre 3A, biri evre 2B idi. Olguların tamamı tanı sonrası sistemik PUVA tedavisi aldı. Üç hastaya ait tedavi sonrası nüks biyopsileri de çalışmaya alındı. Dosyalarına ulaşılan 31 hastanın beşinde nüks gelişmişti. Nüks gelişen olgulardan dördü kadın, biri erkekti. Bu olgulardan ikisi eritrodermik dönemde (biri erkek hasta), üçü yama döneminde idi. MF şüphesi olan 16 adet olgunun 11 i kadın, beşi erkek olup yaş ortalaması 40,18 (3-66) idi. Olguların dördü gövde, dördü gövde ve ekstremite, üçü tüm vücut, üçü üst ekstremite, biri gövde ve glutea, biri glutea yerleşimli idi. Kontrol grubundaki 18 adet olgunun 11 i kadın, yedisi erkek olup, yaş ortalaması 42,4 (4-70) idi. Olguların sekizi liken planus, dördü likenoid dermatit, dördü kontakt dermatit, ikisi kronik dermatit tanısı almıştı. Dördü yüz, dördü bacak, üçü avuç içi, ikisi gövde, ikisi kol, biri oral mukoza, biri skrotum, biri ayak tabanı yerleşimli idi. 24

34 Tablo 5: Mikozis fungoides olgularının yaş, cinsiyet, lezyon lokalizasyonu, lezyonun dönemi ve klinik evrelerinin dağılımı. Sıra no Biyopsi no Yaş Cinsiyet Lokalizasyon Dönem Evre /02 50 K Tüm vücut Eritrodermi IIIA(T4N0M0) 16273/ / /02 30 K Aksilla ve Yama IA(T1N0M0) inguinal /03 5 E Glutea Plak IB(T2N0M0) /04 50 E Gövde ve Yama IA(T1N0M0) ekstremite /02 59 E Gövde ve Plak IB(T2N0M0) ekstremite /02 50 K Tüm vücut Plak IB(T2N0M0) /02 72 K Gövde ve Yama IB(T2N0M0) ekstremite /02 82 E Tüm vücut Yama+plak IB(T2N0M0) /03 46 K Gövde ve Yama IB(T2N0M0) ekstremite /03 43 K Tüm vücut Plak IB(T2N0M0) /02 50 E Gövde Yama IB(T2N0M0) 379/ /03 56 K Gövde ve ekstremite Plak IB(T2N0M0) /03 69 E Ense Plak IA(T1N0M0) /03 60 K Gövde Yama IB(T2N0M0) /04 53 E Gövde Yama IA(T1N0M0) /05 56 E Alt Yama+plak IA(T1N0M0) ekstremite 5198/ /03 63 K Gövde Yama IA(T1N0M0) /05 69 K Gövde Plak IB(T2N0M0) /03 8 K Gövde Yama IA(T1N0M0) /04 66 K Gövde Yama IA(T1N0M0) /03 41 K Gövde Yama IA(T1N0M0) /03 38 K Gövde Yama IA(T1N0M0) /02 69 E Glutea ve Plak IB(T2N0M0) bacak /04 68 K Gövde Yama+plak IB(T2N0M0) /03 60 E Alt Yama IA(T1N0M0) ekstremite /05 36 E Gövde Tümör IIB(T3N0M0) /03 70 E Tüm vücut Yama IB(T2N0M0) /03 57 E Gövde Plak IB(T2N0M0) /05 63 E Gövde Plak IB(T2N0M0) /05 60 E Tüm vücut Eritrodermi IIIA(T4N0M0) /05 74 E Alt Plak IA(T1N0M0) ekstremite /03 73 K Glutea ve Yama IA(T1N0M0) gövde /03 37 E Glutea ve Plak IB(T2N0M0) ekstremite /02 77 K Gövde ve Yama IB(T2N0M0) ekstremite /03 42 K Gövde Yama IA(T1N0M0) 25