WHO Laboratuvar El Kitabı İnsan semeninin incelenmesi ve işlemlerden geçirilmesi

Transkript

1 WHO Laboratuvar El Kitabı İnsan semeninin incelenmesi ve işlemlerden geçirilmesi BEŞİNCİ BASIM Çeviri Editörü Prof. Dr. Ateş KADIOĞLU Çeviri Editörü Yardımcıları Doç. Dr. Muammer KENDİRCİ Msc. Gülşan AKTAN Prof. Dr. Önder YAMAN Prof. Dr. Selahittin ÇAYAN Türk Üroloji Derneği

2 WHO Laboratuvar El Kitabı İnsan semeninin incelenmesi ve işlemlerden geçirilmesi BEŞİNCİ BASKI Çeviri Editörü Prof. Dr. Ateş KADIOĞLU İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı Androloji Bilim Dalı Çeviri Editörü Yardımcıları Doç. Dr. Muammer KENDİRCİ Şişli Etfal Eğitim ve Araştırma Hastanesi 2. Üroloji Kliniği, İstanbul Msc. Gülşan AKTAN İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı Androloji Bilim Dalı Prof. Dr. Önder YAMAN Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı, Ankara Prof. Dr. Selahittin ÇAYAN Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı, Mersin Çeviri Uzm. Dr. Gürkan KAZANCI Üroloji Uzmanı Tıbbi Çevirmen TDK ve TÜBA Tıbbi Terminoloji Çalıştayı Üyesi Türk Üroloji Derneği

3 Dünya Sağlık Örgütü tarafından 2010 yılında WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen 5 th ed. başlığı altında yayınlanmıştır ISBN: World Health Organization 2010 Dünya Sağlık Örgütü Genel Direktörü, Türkçe ye çeviri haklarını, Türkçe basımından tek sorumlu olan Türk Üroloji Derneğine vermiştir. WHO Laboratuvar El Kitabı İnsan semeninin incelenmesi ve işlemlerden geçirilmesi BEŞİNCİ BASKI 1. Semen kimyası. 2. Semen laboratuvar el kitapları. 3. Spermatozoa laboratuvar el kitapları. 4. Sperm sayısı. 5. Sperm ovum etkileşimleri laboratuvar el kitapları. 6. Laboratuvar teknikleri ve yöntemleri standartlar. 7. Kalite kontrolü. Dünya Sağlık Örgütü. TÜRK ÜROLOJİ DERNEĞİ 2011 Çeviri Editörü: Prof. Dr. Ateş KADIOĞLU ISBN: Düzenleme: Nobel Tıp Kitabevleri Ltd. Şti. Hakkı Çakır Baskı / Cilt: Nobel Matbaacılık Hadımköy-İSTANBUL

4 iii İÇİNDEKİLER Teşekkürler Bu el kitabında kullanılan kısa adlar ve kısaltmalar xi xv Bölüm 1 Temel Bilgiler Giriş Beşinci Baskı El kitabının kapsamı 3 KISIM I SEMEN ANALİZİ Bölüm 2 Standart Prosedürler Giriş Numune toplama Hazırlama Tanısal veya araştırma amacıyla semenin toplanması Yardımlı üreme teknikleri için semenin steril olarak toplanması Mikrobiyolojik incelemeler için semenin steril olarak toplanması Evde semen toplanması Kondomla semen toplanması Numunelerin güvenli biçimde işlenmesi İlk makroskobik değerlendirme Likefaksiyon Semen viskozitesi Ejakülatın görünümü Semen hacmi Semen ph sı İlk mikroskobik inceleme Semenin iyice karıştırılması ve temsili örneklemesi Islak preparat hazırlama Spermatozoanın agregasyonu (kümeleşmesi) Spermatozoanın aglütinasyonu Spermatozoa dışında hücresel elemanlar Sperm motilitesi Sperm hareketlerinin sınıflandırılması Motilite için numunenin hazırlanması ve değerlendirilmesi Çalışma örnekleri Alt referans sınırı Sperm vitalitesi Eozin nigrozin kullanarak sperm vitalite testi Yalnızca eozin kullanarak vitalite testi Hipoozmotik şişme testiyle vitalite Sperm sayısı Sayma kamarası tipleri Geliştirilmiş Neubauer hemositometresi Hemositometredeki bölmelerin kullanımı Sayma kamarasının bakımı Semeni seyreltici fiksatif Yeterli sayıda spermatozoa saymanın önemi 36

5 iv 2.8 Rutin sayma işlemi Gerekli seyreltmenin belirlenmesi Dilüsyonların hazırlanması ve hemositometre kamaralarına yerleştirilmesi Sayma kamaralarındaki sperm sayılarının değerlendirilmesi Semende spermatozoa konsantrasyonunun hesaplanması Çalışma örnekleri Alt referans sınırı Ejakülattaki toplam spermatozoa sayısının hesaplanması Alt referans sınırı Düşük sperm sayıları: kriptozoospermi ve kuşkulu azoospermi Düşük sperm sayılarının tam değerlendirilmesi gerekli olmadığında Başka bir girişimde bulunmak gerekmez Spermatozoa bulmak için santrifüjlenmiş numunelerin incelenmesi Hareketli spermatozoa saptamak için santrifüjlenmemiş numunelerin incelenmesi Düşük sperm sayılarının tam olarak değerlendirilmesi gerektiğinde Geliştirilmiş Neubauer kamarasının tüm karelerinde düşük sperm sayılarının değerlendirilmesi (faz-kontrast mikroskobisi) Geniş hacimli tek kullanımlık kamaralarda düşük sperm sayılarının değerlendirilmesi (floresan mikroskobisi) Spermatozoa dışındaki hücrelerin sayımı Semendeki yuvarlak hücre konsantrasyonunun hesaplanması Yöntemin duyarlılığı Çalışma örnekleri Sperm morfolojisi Normal spermatozoa kavramı Semen yayma preparatlarının hazırlanması Boyama yöntemleri Klasik fiksasyon ve ardışık boyama Sperm morfolojisi için Papanicolaou boyama prosedürü Sperm morfolojisi için Shorr boyama prosedürü Sperm morfolojisi için hızlı boyama prosedürü Boyanmış preparatın incelenmesi Normal sperm morfolojisinin sınıflandırması Anormal sperm morfolojisinin sınıflandırması Morfoloji tabloları Sperm morfolojisi yayma preparatının incelenmesi Normal sperm morfolojisinin değerlendirilmesi Çalışma örnekleri Alt referans sınırı Anormal sperm morfolojisinin değerlendirilmesi Çalışma örneği Spesifik sperm defektlerinin değerlendirilmesi Semendeki lökositlerin değerlendirilmesi Orto-toluidin kullanarak hücresel peroksidaz boyanması Semende immatür germ hücrelerinin değerlendirilmesi Antikorla kaplı spermatozoanın değerlendirilmesi Karma antiglobülin reaksiyon testi Direkt immunobead test İndirekt immunobead test 113

6 v Bölüm 3 İsteğe bağlı Prosedürler Çoklu sperm defektlerinin göstergeleri Çoklu morfolojik defekt indekslerinin hesaplanması Çalışma örneği Panlökosit (CD45) immünositokimyasal boyama İlke Reaktifler Prosedür Spermatozoa ve servikal mukus arasındaki etkileşim İn vivo (postkoital) test İn vitro testler İn vitro basitleştirilmiş lam testi Kapiller tüp testi Aksesuar seks organ fonksiyonunun biyokimyasal analizleri Seminal plazmada çinko ölçümü Seminal plazmada fruktoz ölçümü Seminal plazmada nötral α-glukozidaz ölçümü Bilgisayar yardımlı sperm analizi Giriş Sperm motilitesini değerlendirmek için CASA kullanımı Sperm konsantrasyonunu tahmin etmek için CASA kullanımı Spermin bilgisayar yardımlı morfometrik değerlendirmesi 140 Bölüm 4 Araştırma Prosedürleri Reaktif oksijen türleri Giriş Sperm süspansiyonlarının oluşturduğu reaktif oksijen türlerinin ölçümü İnsan sperm-oosit etkileşim testleri İnsan zona pellusidasına bağlanma testleri Akrozom reaksiyonunun değerlendirilmesi Akrozomal durumun floresanla değerlendirme prosedürü İndüklenmiş akrozom reaksiyonu analizi Zonasız hamster oosit penetrasyon testi Protokol Sperm kromatininin değerlendirmesi 157 KISIM II. SPERMiN HAZIRLANMASI Bölüm 5 Sperm hazırlama teknikleri Giriş Spermin seminal plazmadan ne zaman ayrılması gerekir Yöntemin seçimi Seminal plazma ve enfeksiyon etkenlerinden sperm ayrılmasının etkinliği Genel ilkeler Basit yıkama Reaktifler Prosedür Direkt yüzdürme (swim-up) Reaktifler Prosedür 164

7 vi 5.5 Kesintili dansite gradyanları Reaktifler Prosedür HIV le enfekte semen numunelerinin hazırlanması Testiküler ve epididimal spermatozoanın hazırlanması Enzimatik yöntem Mekanik yöntem İntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu için sperm süspansiyonlarının işlenmesi Retrograd ejakülasyon numunelerinin hazırlanması Yardımlı ejakülasyon numunelerinin hazırlanması 168 Bölüm 6 Spermatozoanın kriyoprezervasyonu Giriş Semeni dondurarak saklama (kriyoprezervasyon) protokolleri Standart prosedür Oligozoospermi ve cerrahi yolla elde edilen spermi dondurmak için modifiye protokoller Pipetlerin işaretlenmesi ve kayıt 176 KISIM III. KALİTE GÜVENCESİ Bölüm 7 Kalite güvencesi ve kalite kontrolü Androloji laboratuvarında kalitenin kontrolü Semen analizindeki hataların niteliği İstatistiksel örneklem hatasını en alt düzeye indirmek Kalite güvence programı Laboratuvar prosedürleri el kitabı İç kalite kontrolü Satın alınmış kalite kontrol (QC) numuneleri Laboratuvarda hazırlanmış QC numuneleri Stoklanmış numuneler (satın alınmış veya laboratuvarda hazırlanmış) Yeni hazırlanmış QC numuneleri (laboratuvarda hazırlanmış) Teknisyene özgü bireysel ve teknisyenler arası sistematik hataları değerlendirmek ve bildirmek için kullanılan istatistiksel prosedürler X bar çizelgesi S çizelgesi Yüzdelerin kalite kontrolü X bar ve S çizelgelerinin değerlendirmesi Kontrol dışı değerleri nasıl tanıyalım Kontrol dışı değerlerin nedenleri Kontrol dışı değerlere yanıtlar Laboratuvar teknisyenleri arasında değişkenliği analiz ve raporlamaya ilişkin istatistiksel yöntemler İki veya daha fazla sayıda teknisyenden alınan sonuçların karşılaştırması Aylık ortalamaların izlenmesi Dış kalite kontrolü ve kalite güvencesi Dış kalite kontrol sonuçlarının değerlendirmesi Kontrol dışı sonuçlara yanıtlar Kalite kontrol sıklığı ve önceliği 197

8 vii 7.13 Eğitim Sperm konsantrasyonunu değerlendirmede zorluk yaşandığında faydalı pratik ipuçları Sperm morfolojisini değerlendirmede zorluk yaşandığında faydalı pratik ipuçları Sperm motilitesini değerlendirmede zorluk yaşandığında faydalı pratik ipuçları Sperm vitalitesini değerlendirmede zorluk yaşandığında faydalı pratik ipuçları 202 KAYNAKLAR 205 EKLER Ek 1 Referans değerler ve semen terminolojisi 223 A1.1 Referans değerler 223 A1.2 Terminoloji 225 Ek 2 Donanım ve güvenlik 227 A2.1 Bir androloji laboratuvarında gerekli temel gereçler 227 A2.2 Androloji laboratuvarında potansiyel biyolojik tehlikeler 230 A2.3 Laboratuvar personeli için güvenlik işlemleri 230 A2.4 Laboratuvar donanımı için güvenlik işlemleri 232 A2.5 Sıvı nitrojenle çalışırken güvenlik önlemleri 233 Ek 3 Mikroskopi 234 A3.1 Numunenin yerleştirilmesi 234 A3.2 Okülerlerin ayarlanması 236 A3.3 Görüntünün odaklanması 236 A3.4 Okülerlerin odaklanması 236 A3.5 Işık kondansatörünün odaklanması 236 A3.6 Kondansatörün ortalanması 237 A3.7 Faz halkalarının ayarlanması 237 A3.8 Floresan mikroskobisi 237 Ek 4 Stok çözeltileri 238 A4.1 Biggers, Whitten ve Whittingham 238 A4.2 Dulbecco fosfat tamponlanmış salin 238 A4.3 Earle s medyumu 239 A4.4 Ham F-10 medyumu 239 A4.5 Hanks dengeli tuz çözeltisi 240 A4.6 İnsan tubal sıvısı 240 A4.7 Krebs-Ringer medyumu 240 A4.8 Tris le tamponlanmış salin 241 A4.9 Tyrode çözeltisi 241 A4.10 Papanicolaou boyama 241 Ek 5 Servikal mukus 245 A5.1 Giriş 245 A5.2 Servikal mukusun toplanması ve saklanması 246 A5.3 Servikal mukusun değerlendirilmesi 247 Ek 6 Semen ve servikal mukus analizlerinin kayıt formları 251 A6.1 Semen analizi kayıt formu için taslak 251 A6.2 Servikal mukus kayıt formu için taslak 253

9 viii Ek 7 Örneklem hataları ve kalite kontrolü 254 A7.1 Sperm konsantrasyon ölçümündeki hatalar 254 A7.2 Örneklem hatalarını anlamanın önemi 256 A7.3 Yüzdelerin ölçümündeki hatalar 257 A7.4 Kalite kontrolü için semen numunelerinin oluşturulması 260 A7.5 Sperm motilite analizinin iç kalite kontrolü için bir video kaydın hazırlanması 261 A7.6 Sperm konsantrasyonunu belirlemede iç kalite kontrolü için seyreltik semenin hazırlanması 265 A7.7 Sperm morfolojisini değerlendirmede iç kalite kontrolüne ilişkin lamların hazırlanması 268 A7.8 Donanımın kalibrasyonu 269 Ek 8 Semen analizi için ulusal dış kalite kontrol programları 271 ŞEKİLLER Şekil 2.1 Bir buçuk yılda toplam spermatozoa sayısı ve sperm konsantrasyonunda oluşan değişiklikler 9 Şekil 2.2 Semende spermatozoanın nonspesifik agregasyonu (kümeleşmesi) 19 Şekil 2.3 Farklı sperm aglütinasyon derecelerinin şematik diyagramı 20 Şekil 2.4 Sperm motilitesini değerlendirmede kullanılan yardımcı araçlar 24 Şekil 2.5 Eozin nigrozin yayma preparatının parlak alanda gözlemlenmesi 28 Şekil 2.6 Hipoozmotik strese maruz bırakılmış insan spermatozoasındaki morfolojik değişikliklerin şematik görünümü 32 Şekil 2.7 Geliştirilmiş Neubauer hemositometresi 34 Şekil 2.8 Hemositometrenin karelerinde hangi spermleri sayalım 36 Şekil 2.9 Hareketli spermatozoayı bulmak için lamelin tümüyle taranması 47 Şekil 2.10 Morfolojik olarak normal spermatozoa 58 Şekil 2.11 Sperm morfolojisi için semenden yayma preparatı hazırlama yöntemleri 59 Şekil 2.12 Normal semen yayma preparatının hazırlanması 60 Şekil 2.13 İnsan spermatozoasının bazı anormal formlarının şematik resmi 70 Şekil 2.14 İnsan semeninde peroksidaz pozitif ve negatif hücreler 105 Şekil 3.1 Semende lökositler 120 Şekil 3.2 Kremer sperm penetrasyon ölçeri 128 Şekil 3.3 CASA sistemleriyle ölçülen değişkenler için standart terminoloji 139 Şekil 4.1 Opsonize zimosan tedavisine yanıt olarak oluşturulan kemilüminesans 145 Şekil 4.2 Hücre süspansiyonunun reaktif oksijen oluşturma kapasitesine lökosit ve sperm alt popülasyonlarının göreceli katkıları 146 Şekil 4.3 İnsan sperminin floresan Pisum sativum aglütininiyle (PSA) boyanması 149 Şekil 4.4 İnsan spermi içeren zonasız hamster oositinin faz kontrast mikrografisi 157 Şekil 7.1 Sperm konsantrasyonu için X bar çizelgesi 187 Şekil 7.2 Sperm konsantrasyonu için S çizelgesi 189 Şekil 7.3 İleri hareketli sperm yüzdesinin Bland-Altman grafiği manuel plotu ve CASA yla hesaplanması 192 Şekil 7.4 Sperm konsantrasyonun Youden grafiğiyle hesaplanması 193 Şekil A2.1 Rotor yarıçapı ve dönme hızına göre göreceli santrifüjleme gücünü (RFC) okuma nomogramı 231 Şekil A5.1 Cam lam üzerine havada kurumaya bırakılan servikal mukusta fern oluşumuna örnekler 246 Şekil A7.1 Değerlendirilen toplam sperm sayısının bir fonksiyonu olarak iki kez yapılan sayım arasında kabul edilebilir farklılıklar 255

10 ix Şekil A7.2 Değerlendirilen spermlerin toplam sayısı ve gerçek yüzdesinin bir fonksiyonu olarak iki kez yapılan değerlendirme arasındaki kabul edilebilir farklılıklar 258 Şekil A7.3 Sperm motilitesinin değerlendirilmesine yardımcı teknikler 263 Şekil A7.4 Retiküllü (kırmızı kareli) okülerden görünüm 264 Şekil A7.5 Monitördeki dereceli mikrometrenin videoya çekilmiş görüntüsü ve çizili krokisi 264 KUTULAR Kutu 2.1 Semen toplama kaplarının uyumluluğunu doğrulama 11 Kutu 2.2 Bromelainin hazırlanması 14 Kutu 2.3 Semenin iyice karıştırılması 18 Kutu 2.4 Islak preparatların derinliği 18 Kutu 2.5 Yüzdelerin hesaplanmasındaki hatalar 24 Kutu 2.6 Replikat yüzdelerin karşılaştırılması 25 Kutu 2.7 Sayıların hesaplanmasındaki hatalar 36 Kutu 2.8 Geliştirilmiş Neubauer kamarasının ortadaki üç büyük karesinde replikat başına 200 er spermatozoanın sağlanması 38 Kutu 2.9 Yüksek büyütme alanında 20 µm derinlikteki preparatın gözlenen hacmi 38 Kutu 2.10 Replikat sayımların karşılaştırması 42 Kutu 2.11 Geliştirilmiş Neubauer kamarasının dokuz büyük karesinde replikat başına 200 spermatozoanın sağlanması 48 Kutu µm derinliğinde, geniş hacimli tek kullanımlık kamarada replikat başına 200 spermatozoanın sağlanması 52 Kutu µm derinliğinde, geniş hacimli tek kullanımlık kamarada her yüksek büyültme alanında gözlenen hacim 54 Kutu 2.14 Kapama medyumu 63 Kutu 3.1 Mum-vazelin karışımının hazırlanması 123 Kutu µm derinliğindeki bir mukus preparatında yüksek büyütmede gözlenen hacim 124 Kutu 4.1 Hamsterlerde ovulasyonun indüksiyonu 154 Kutu 4.2 Cam pipetlerin hazırlanması 155 Kutu 6.1 Spermlerin dondurularak saklanma (kriyoprezervasyon) nedenleri 170 Kutu 6.2 İnsan semeninin kriyoprezervasyonu ve depolanmasına ilişkin risk değerlendirmesi 171 Kutu 7.1 Kalite güvence ve kalite kontrol terminolojisi 180 Kutu 7.2 X bar S çizelgesinin uyarı ve eylem kontrol limit değerlerinin belirlenmesi 186 Kutu 7.3 Toplu standart sapma değerlerine göre X bar hesaplamanın alternatif yöntemi 187 Kutu 7.4 Bir S çizelgesinin uyarı ve eylem kontrol limit değerlerinin belirlenmesi 188 Kutu 7.5 Kalite kontrol çizelgeleri için temel kontrol kuralları 190 Kutu 7.6 Teknisyenler arasında sistematik farklılıkların değerlendirmesi 195 Kutu 7.7 İç kalite kontrol prosedürlerinin başlıca özellikleri 196 Kutu 7.8 Kalite kontrolün zaman çizelgesi 198 Kutu 7.9 Kalite kontrol testlerinin özeti 198 Kutu A2.1 Santrifüjleme güçlerinin hesaplanması 230 Kutu A3.1 Objektifin merceği 235 Kutu A5.1 Toplanan mukus hacminin belirlenmesi 247 Kutu A µm derinlikteki bir mukus preparatında her büyük büyütmede gözlenen hacim 249

11 x TABLOLAR Tablo 2.1 Yinelenen sayımlarda 200 sperm (sayılan toplam sperm sayısı: 400) için belirlenen iki ortalama yüzdenin arasındaki kabul edilebilir farklılıklar 25 Tablo 2.2 Sayılan toplam spermatozoa sayısına göre yuvarlanmış örneklem hataları (%) 37 Tablo 2.3 Gerekli semen dilüsyonları, nasıl yapılacağı, kullanılan kamaralar ve değerlendirme için potansiyel alanlar 39 Tablo 2.4 Belli bir toplam sayı için iki replikat arasında kabul edilebilir farklılıklar 42 Tablo 2.5 Belli bir toplam sayı için iki yinelenen sayım arasında kabul edilebilir farklılıklar: düşük konsantrasyonlar 50 Tablo 2.6 Morfoloji tablolarında kullanılan yorumların açıklamaları 71 Tablo 2.7 İmmunobead testi için ne kadar semen kullanılır 111 Tablo 3.1 Çoklu sperm defektleri indekslerinin hesaplanması 116 Tablo 3.2 Fertil ve infertil çiftlerde erkeklerin sperm defekti indeksleri 117 Tablo 3.3 Sperm penetrasyon dansitesinin sıralı derecelendirmesi 129 Tablo 3.4 Kapiller tüp testi sonuçlarının sınıflandırması 129 Tablo 7.1 Ortalama standart sapmaya (S bar ) dayanan X bar ve S çizelgeleri için kontrol limitlerini belirleyen faktörler 186 Tablo 7.2 Sperm konsantrasyonunun değerlendirmesinde değişkenlik (hata) kaynakları ve önerilen çözümler 199 Tablo 7.3 Sperm morfolojisinin değerlendirmesinde değişkenlik (hata) kaynakları ve önerilen çözümler 200 Tablo 7.4 Sperm motilitesinin değerlendirmesinde değişkenlik (hata) kaynakları ve önerilen çözümler 201 Tablo 7.5 Sperm vitalitesinin değerlendirmesinde değişkenlik (hata) kaynakları ve önerilen çözümler 202 Tablo A1.1 Semenin karakteristik özelliklerinin alt referans limitleri (5. yüzdelikleri ve % 95 güven aralıkları) 224 Tablo A1.2 Eşleri doğum kontrol yöntemlerini bıraktıktan sonraki 12 ay içinde gebe kalmış erkeklerin semen parametrelerinin dağılımı 225 Tablo A1.3 Semen kalitesine ilişkin terminoloji 226 Tablo A7.1 Belli bir toplam için iki replikat sayımı arasındaki kabul edilebilir farklılıklar 255 Tablo A7.2 Replikat sayısı 100 olan spermin (sayılan toplam sperm sayısı: 200) bilinen iki ortalama yüzdesi arasında kabul edilebilir farklılıklar 259 Tablo A7.3 Replikat sayısı 200 olan spermin (sayılan toplam sperm sayısı: 400) bilinen iki ortalama yüzdesi arasında kabul edilebilir farklılıklar 259 Tablo A7.4 Replikat sayısı 400 olan spermin (sayılan toplam sperm sayısı: 800) bilinen iki ortalama yüzdesi arasında kabul edilebilir farklılıklar 260

12 xi Teşekkürler Bu yayın UNDP/UNFPA/WHO/World Bank Special Programme of Research, Development and Research Training in Human Reproduction (HRP), WHO Depart ment of Reproductive Health and Research (RHR)* tarafından hazırlanmıştır. Aşağıdaki bireylerin bu el kitabının hazırlanması ve redaksiyonuna katkıları minnettarlıkla takdir edilmektedir. Baş Editör Dr Trevor G Cooper Centre of Reproductive Medicine and Andrology of the University, Münster, Almanya (WHO Collaborating Centre for Research in Male Reproduction) Editörler Kurulu Dr John Aitken Biological Sciences School of Life and Environmental Sciences University Drive Callaghan, New South Wales, Avustralya Dr Jacques Auger Service de Biologie de la Réproduction Pavillon Cassini Hôpital Cochin Paris, Fransa Dr HW Gordon Baker University of Melbourne Department of Obstetrics and Gynaecology Royal Women s Hospital Carlton, Victoria, Avustralya Dr Chris LR Barratt Division of Maternal and Child Health Sciences The Medical School Ninewells Hospital Dundee, İskoçya Dr Hermann M Behre Centre for Reproductive Medicine and Andrology Martin-Luther-University Halle, Almanya Dr Lars Björndahl Andrology Centre, Karolinska University Hospital and Institute, Stockholm, İsveç Ms Charlene Brazil Center for Health and the Environment University of California Davis, CA, ABD Dr Christopher De Jonge University of Minnesota Reproductive Medicine Center Minneapolis, MN, ABD Dr Gustavo F Doncel CONRAD Department of Obstetrics and Gynecology Eastern Virginia Medical School Norfolk, VA, ABD Dr Daniel Franken Department of Obstetrics and Gynaecology Tygerberg Hospital Tygerberg, Güney Afrika Dr Trine B Haugen Faculty of Health Sciences Oslo University College Oslo, Norveç Dr Aucky Hinting Andrology Unit, Department of Biomedicine School of Medicine Airlangga University, Surabaya, Endonezya

13 xii Mr Godwin E Imade Department of Obstetrics and Gynaecology Faculty of Medical Sciences University of Jos Jos, Nijerya Dr Thinus F Kruger Reproductive Biology Unit Stellenbosch University Tygerberg, Güney Afrika Dr Hesbon O Odongo Department of Zoology University of Nairobi Nairobi, Kenya Ms Elizabeth Noonan Fred Hutchinson Cancer Research Center Statistical Center for HIV/AIDS Research and Prevention Seattle, WA, ABD Dr Steven M Schrader National Institute for Occupational Safety and Health Centers for Disease Control and Prevention Cincinnati, OH, ABD Dr Christina CL Wang Harbor-UCLA Medical Center Torrance, CA, ABD Dr William Shu-Biu Yeung Department of Obstetrics and Gynaecology University of Hong Kong Hong Kong SAR, Çin WHO Sekreteryası Dr Kirsten M Vogelsong Scientist, RHR Research Alan Yöneticisi Dr Sigrid von Eckardstein Önceki Araştırma Alan Sorumlusu Yönetici, RHR Dr Michael T Mbizvo Geçici Direktör, RHR Ms Maud Keizer Sekreter, RHR Besiyerlerini kontrol ettikleri ve morfoloji mikrofilmlerini çektikleri için Bn Cathy Treece, Bn Charlene Tollner ve Profesör Jim Overstreet e (University of California, Davis, CA, ABD), sperm dışındaki hücrelerin tanımlanmasına yardımcı oldukları için Dr Rune Eliasson a (Sophiahemmet Hospital, Stockholm, İsveç), el kitabının derlenmesinde kullanılan ek bilgileri sağladıkları için Dr Gary N Clarke (The Royal Women s Hospital, Carlton, Avustralya), Dr Roelof Menkveld (Tygerberg Academic Hospital and University of Stellenbosch, Tygerberg, Güney Afrika) ve Profesör Pieter Wranz a (University of Stellenbosch, Tygerberg, Güney Afrika) ilâve teşekkürlerimizi sunarız. Uluslararası Androloji Derneği nin (International Society of Andrology) mali desteğini minnettarlıkla takdir ediyoruz. El kitabının bu basımı, Dünya Sağlık Örgütü Erkek Fertilitesinin Düzenlenmesindeki Yöntemlere İlişkin Görev Gücü nün (WHO Task Force on the Methodology of the Regulation of Male Fertility) önceki yöneticisi, bu laboratuvar el kitabının ikinci, üçüncü ve dördüncü basımlarının ortak editörü olan müteveffa Geoffrey Waites in ( ) anısına adanmıştır. Geoff un dürüstlüğü, adaleti ve temel sosyal haklardan yoksun kişilere ilgisini takdir eden editörler kurulu kendilerini bu görev için adamışlardır. *UNDP/UNFPA/WHO/Dünya Bankası Özel, İnsan Üremesi Alanında Araştırma, Araştırma ve Geliştirme Programı (HRP), DSÖ Üreme Sağlığı ve Araştırması (RHR)

14 xiii WHO 2010 Semen Analizi Kitabı Çevirisine Katkıda Bulunanlar (Alfabetik soyadı sırasıyla) BARIŞ ALTAY Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı, İzmir GÜLŞAN AKTAN İstanbul Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı Androloji Bilim Dalı, İstanbul ALI BEYTUR İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı, Malatya ERAY ÇALIŞKAN Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı, Kocaeli SELAHİTTİN ÇAYAN Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı, Mersin ÖNDER ÇELİK İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı, Malatya MURAT DİNÇER Süleymaniye Eğitim ve Araştırma Hastanesi Üroloji Kliniği, İstanbul OĞUZ EKMEKÇİOĞLU Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı, Kayseri İLHAN GEÇİT Yüzüncüyıl Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı, Van SERÇİN KARAHÜSEYİNOĞLU Süleymaniye Eğitim ve Araştırma Hastanesi IVF Kliniği, Embryoloji Birimi, İstanbul MUAMMER KENDİRCİ Şişli Etfal Eğitim ve Araştırma Hastanesi 2. Üroloji Kliniği, İstanbul İRFAN ORHAN Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı, Elazığ SEMIH Y. SARGIN İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı, Malatya KEREM TAKEN Sağlık Bakanlığı Van Eğitim ve Araştırma Hastanesi Üroloji Kliniği, Van MURAT Y. UĞRAŞ İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı, Malatya ÖNDER YAMAN Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı, Ankara

15

16 xv Bu el kitabında kullanılmış kısa adlar ve kısaltmalar Ab antibody antikor AI artificial insemination yapay döllenme AID artificial insemination with donor semen verici spermiyle yapay döllenme AIH artificial insemination with husband s semen kocanın spermiyle yapay döllenme ALH amplitude of lateral head displacement dış yana baş deplasmanının amplitüdü ANOVA analysis of variance değişkenlik analizi APAAP alkaline phosphatase anti-alkaline phosphatase complex alkalen fosfataz antialkalen fosfataz kompleksi AR acrosome-reacted akrozomla reaksiyona giren ART assisted reproductive technology yardımlı üreme teknolojisi ASA anti-sperm antibody antisperm antikor BAEE N-benzoyl-L-arginine ethyl ester N-benzoil-L-arjinin etil ester BCF beat-cross frequency (Hz) sperm kuyruğu vuruş sıklığı (Hz) BSA bovine serum albümin sığır serum albümini BWW Biggers, Whitten and Whittingham Biggers, Whitten ve Whittingham CASA computer-aided sperm analysis bilgisayar yardımlı sperm analizi CASMA CBAVD computer-aided sperm morphometric assessment congenital bilateral absence of the vas deferens spermin bilgisayar yardımlı morfometrik ölçümü vaz deferensin doğuştan çift taraflı yokluğu CD compact disk yoğun disk CD cytoplasmic droplet sitoplazmik damlacık CD45 cluster of determination 45 belirleyici küme 45 (panlökosit belirteç) (pan-leukocyte marker) CD46 cluster of determination 46 belirleyici küme 46 (akrozomal antijen) (acrosomal antigen) CI confidence interval güven aralığı CL confidence limits güven sınırları CO2 carbon dioxide karbondioksit DMSO dimethyl sulfoxide dimetil sülfoksit DNA deoxyribonucleic acid deoksiribonükleik asit DPBS Dulbecco s phosphate-buffered saline Dulbecco fosfatla tamponlanmış salin DVD digital versatile disc dijital çok amaçlı disk EDTA ethylenediamine tetra-acetic acid etilendiamin tetra-asetik asit EQA external quality assurance dış kalite güvencesi EQC external quality control dış kalite kontrolü ERC excess residual cytoplasm aşırı rezidüel sitoplazma FITC fluorescein isothiocyanate floresan izosiyanat FMLP formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine formil-metionil-lösil-fenilalanin GIFT gamete intrafallopian transfer gametin fallop tüpü içine aktarımı GPC glycerophosphocholine gliserofosfokolin H2O2 hydrogen peroxide hidrojen peroksit HBSS Hanks balanced salt solution Hanks dengeli tuz çözeltisi HBV hepatitis B virus hepatit B virüsü hcg human chorionic gonadotrophin insan koriyonik gonadotropini HCV hepatitis C virus hepatit C virüsü HIV human immunodeficiency virus insan immünyetersizlik virüsü HOP hamster oocyte penetration hamster oosit penetrasyon

17 xvi HOS hypo-osmotic swelling hipoozmotik şişme HPF high-power field yüksek büyütmede incelenen alan HRP horseradish peroxidase yaban turpu (horsedish) peroksidazı HSA human serum albumin insan serum albümini HTF human tubal fluid insan tuba sıvısı IB immunobead antikor kaplı boncuk IBT immunobead test antikor kaplı boncuk testi ICSI intracytoplasmic sperm injection intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu Ig immunoglobulin immünoglobülin IM immotility immotilite IQC internal quality control iç kalite kontrolü IU international unit uluslararası birim IUI intrauterine insemination intrauterin inseminasyon IVF in-vitro fertilization in vitro fertilizasyon KRM Krebs Ringer Medium Krebs-Ringer medyumu LIN Linearity doğrusallık LLQ lower limit of quantification kantitatif analizin alt limiti LPF low-power field düşük büyütmede incelenen alan MAD mean angular displacement ortalama açısal yer değiştirme MAI multiple anomalies index çoklu anomaliler indeksi MAR mixed antiglobulin reaction karma antiglobülin reaksiyonu NA numerical aperture sayısal açıklık NP non-progressive (motility) yerinde hareket PBS phosphate-buffered saline fosfatla tamponlanmış salin PDCA plan, do, check, act planla, gerçekleştir, kontrol et, harekete geç PMA phorbol 12-myristate 13-acetate forbol 12-miristat 13-asetat PMSG pregnant mare serum gonadotrophin gebe kısrak serumu gonadotropini PNPG p-nitrophenol glucopyranoside p-nitrofenol glukopiranosit PR progressive (motility) ileri hareket PSA Pisum sativum agglutinin Pisum sativum aglütinini QA quality assurance kalite güvence QC quality control kalite kontrol RCF relative centrifugal force göreceli merkezkaç gücü RI refractive index kırılma indeksi RNA ribonükleik acid ribonükleik asit ROS reactive oxygen species reaktif oksijen türleri rpm revolutions per minute dakikadaki dönüş sayısı SD standard deviation standart sapma SDI sperm deformity index sperm deformite indeksi SDS sodium dodecyl sulfate sodyum dodesil sülfat SE standard error standart hata SOP standard operating procedure standart çalışma prosedürü STR straightness (VSL/VAP) doğruluk testi (VSL/VAP) TBS Tris-buffered saline Tris le tamponlanmış salin TGG Tyrode s glucose glycerol Tyrode glukoz gliserol çözeltisi TZI teratozoospermia index teratozoospermi indeksi VAP average path velocity ortalama hız VCL curvilinear velocity kavisli hareket hızı VSL straight-line (rectilinear) velocity ileri doğru doğrusal hareket hızı WHO World Health Organization Dünya Sağlık Örgütü WOB wobble (VAP/VCL) sperm başı titreşim hareketi (VAP/VCL)

18 1 BÖLÜM 1 Temel bilgiler 1.1 Giriş İnsan semeni analizlerinin standardize edilmesine giderek artan gereksinmeye yanıt olarak Dünya Sağlık Örgütü nün ilk kez 1980 yılında (WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm cervical mucus interaction [İnsan semeni ve sperminin incelenmesi servikal mukusla etkileşimi]) adlı el kitabını yayınlanmıştır. El kitabı, o zamandan beri üç kez güncellenmiş ve birçok dile çevrilmiştir. Son 30 yıldır el kitabının evrensel standartları sağladığının farkına varılmış, dünya ölçeğinde araştırma ve klinik laboratuvarları tarafından yaygın biçimde kullanılmıştır. Bu başarıya rağmen, el kitabının önceki basımlarındaki bazı önerilerin yeni kanıtların ışığı altında gözden geçirilmesi, bazı kavramların ise daha fazla açıklama ve destekleyici kanıta ihtiyacı olduğu ortaya çıkmıştır. Bu düşüncelerin etkisiyle WHO, el kitabında tanımlanan yöntemlerin, doğrulama, değiştirme ve güncelleştirme amacıyla tümüyle gözden geçirilmesi için bir editörler kurulu oluşturmuştur. Bu zor bir durumdu, çünkü bu el kitabında anlatılan yöntemlerle elde edilen sonuçlara ilişkin veriler yetersizdi. Bazen sağlam akreditasyonlu laboratuvarlar tutarlı sonuçlar elde etseler de, bu durum diğerleri tarafından doğrulanmamıştı. Bu durumlarda editörler kurulu, ilgili literatürü değerlendirdikten sonra bir uzlaşıya varmıştır. Laboratuvar teknisyenleri ve bilim adamlarından, özellikle yöntem tanımlarına dair daha fazla ayrıntı gereksinimi olduğu konusunda birçok ek öneri alınmıştır. Önceki basımlarda ayrıntıların olmaması, bazı laboratuvarların WHO el kitabına göre semen analizini yaptıklarını iddia etmelerine rağmen, başka yerlerde tanımlanan yöntemleri seçtikleri veya yöntemleri kendilerine göre uyarladıkları anlamına gelmektedir. Dünya çapında karşılaştırmayı kolaylaştırmak amacıyla, el kitabının bu basımı çok daha fazla ayrıntı içermekte, alternatif analiz yöntemleri sunulduğunda ise bunun gerekçesi açıklanmaktadır. Sonuçlarını basılı makalelerle rapor ederken laboratuvarların, bu el kitabınından bahsederlerken hangi spesifik yöntemi kullanmış olduklarını belirtmeleri önerilir. 1.2 Beşinci baskı Beşinci basım üç kısımdan ibarettir: semen analizi (Bölüm 2 4), spermin hazırlanması (Bölüm 5 ve 6) ve kalite güvence (Bölüm 7). Semen analizini ele alan 1. Kısım, kitabın önceki basımlarına benzemekle birlikte üç bölüme ayrılmıştır: semen kalitesini belirlemede güçlü, rutin standart yöntemler ve halen rutin olarak kabul edilmeyen, belli durumlarda veya laboratuvarın seçimine ve araştırma testleri olarak kullanılabilen isteğe bağlı testler. Normalde androloji laboratuvarında semen kültürü yapılmadığından, bu konu sadece steril semen toplanması bölümünde verilmiştir. Spermin hazırlanmasına ilişkin bölüm, ejakülatın ötesinde testis ve epididimden elde edilen spermatozoayı da kapsamaktadır. Notlar (metodolojinin açıklaması), Yorumlar (sonuçların yorumlanması) ve Kutular (ek açıklayıcı notlar) gibi metodolojik direktiflerin madde başlıkları işaretlenmiştir.

19 2 BÖLÜM 1 Temel bilgiler Beşinci baskının başlıca özellikleri aşağıda özetlenmiştir: Semen analizine ilişkin bölümler çalışma çözeltilerinin, işlemlerin, hesaplamaların ve yorumun ayrıntılarını içermektedir. Böylece, sunulan metodoloji anlatımı, el kitabının diğer kısımlarına minimal çapraz referansla eklenmiştir. Spermin hazırlanmasına ait bölüm genişletilmiş ve spermatozoanın dondurularak saklanmasına (kriyoprezervasyon) ilişkin de bir bölüm eklenmiştir. Servikal mukus analiz süreçleri, isteğe bağlı işlemler bölümünde ve mukusun karakteristik özelliklerinin bulunduğu ekte anlatılmıştır. Eski basımlara göre daha az sayıda ek konulmuş, ekler özel veya nadiren gereken bilgilerle sınırlandırılmıştır. Sperm sayılarının değerlendirilmesi. Semen dilüsyonları ve bir semen numunesinde spermatozoa sayısını değerlendirmek için kullanılan sayma kamarasının alanları değiştirilerek, mükerrer numunelerde 200 spermin sayılmasına olanak tanınmıştır. Örneklem hatalarının önemi ve elde edilen sayısal sonuçların kesinliği vurgulanmıştır. Editörler Kurulu, sperm konsantrasyonuna göre her bir ejakülatta toplam sperm sayısının testiküler fonksiyonu daha doğru değerlendirdiğini düşünmüştür. Ancak, bu yöntem için de semen hacminin doğru ölçülmesi gerekmektedir. Azoosperminin değerlendirmesi. Yüzeysel olarak basit olmasına rağmen azoospermi tanısı, az sayıda spermatozoa sayılmasıyla ilişkili büyük hatalar, incelenecek çok sayıda mikroskobik alan ve debris yüklü sperm pelletlerinin incelenmesinin zorluğu gibi birçok faktörle karmaşıklaşmaktadır. Bu konuda önerilen değişiklikler; fikse edilmiş ancak santrifüj edilmemiş numunelerin incelenmesi ve uygulanan sayım yöntemlerinin duyarlılığının belirtilmesidir. Ancak, tedaviye yönelik işlemler için yeterli sayıda hücre toplanması amacıyla gereken santrifüjleme yöntemleri ve vazektomi sonrası semenin değerlendirmesi için fikse edilmemiş numunelerde hareketli spermatozoa saptama yöntemleri de dahil edilmiştir. Sperm hareketliliğinin değerlendirilmesi. Daha önceki basımlardan ana bir fark da, sperm hareketliliğinin kategorilere ayrılmasında olmuştur. Artık, spermatozoanın ileri hareketli, yerinde hareketli ve hareketsiz olarak kategorize edilmesi gerektiği önerilmektedir (a,b,c veya d şeklinde derecelendirme yerine). Sperm morfolojisinin değerlendirilmesi. Bazı laboratuvarlar yalnızca normal şekilli spermleri değerlendirirken, diğerleri spermin tipi, yerleşimi ve anormalliklerin boyutunun daha önemli olduğunu düşünür. Bu ayırt edici veya yarı-kantitatif değerlendirmelerin semen analizinin değerini artırıp-artırmadığı konusu hâlâ tartışmalıdır. Normal formların yüzdesiyle (kesin sınıflandırma veya morfolojinin bilgisayar yardımlı değerlendirmesiyle tanımlandığı gibi) in vivo ortamda döllenme (fertilizasyon) oranları arasındaki ilişkiyi destekleyen kanıtlar, semen içinde spermin morfolojik olarak farklı alt popülasyonlarının belirlenmesine çalışılmasını haklı göstermektedir. Bu basımda, normal ve sınırda normal spermatozoanın daha fazla ve daha kaliteli mikrograflarına yer verilmiş ve her birinin neden bu şekilde sınıflandırıldığı da açıklanmıştır. Bu yaklaşımın, spermleri tutarlı biçimde kategorize eden eğitimli teknisyenlere yardımcı olması gerekir. Bir fertil popülasyona ilişkin güncel veriler, morfolojik olarak normal formların yüzdeleri konusunda referans değerlerinin hesaplanmasına olanak tanımıştır.

20 BÖLÜM 1 Temel bilgiler 3 Kalite kontrol. Bu bölüm tamamen yeniden yazılmıştır. Analiz yöntemlerinin güçlü olması için semen analizi kalite güvence kontrollerinin de çok sıkı olması gerekir. Kalite kontrol sonuçları tatminkâr olmadığı zaman, laboratuvar performansının nasıl iyileştirileceğine ilişkin ipuçları ve öneriler verilmektedir. Referans aralıkları ve referans sınırları. Partnerleri 12 ay veya daha kısa sürede gebe kalmış fertil erkeklerin semen kalitesi, bu el kitabındaki referans değerlerine kaynak teşkil etmiştir. Referans aralıklarını oluşturmak için üç kıta ve sekiz ülkede yakın zamanda baba olmuş kişilerden alınmış yaklaşık semen numunesinden elde edilen ham veriler kullanılmıştır. Konvansiyonel istatistiksel gelenek, eşik değer olarak iki yanlı referans aralığının 2,5 persentilini (2,5 inci yüzdelik dilimini) kabul etmek ve bunun dışındaki değerlerin farklı bir popülasyondan geldiğini düşünmektir. Ancak semen söz konusu olduğunda, herhangi bir parametreye ait yüksek değerlerin fertiliteye zararlı olma olasılığı bulunmadığından, tek yanlı referans aralığının kullanılmasının daha uygun olduğu düşünülmüştür. Alt referans sınırı olarak 5. yüzde birlik değer kabul edilmiş ve her bir semen parametresi için tam dağılım grafiği de Ek 1 de verilmiştir 1.3 El kitabının kapsamı Burada anlatılan yöntemler semen analizinin kalitesi ve sonuçların karşılaştırılabilirliğini iyileştirmeyi amaçlayan kılavuzlardır. Yerel, ulusal ve küresel akreditasyon makamları tarafından zorunluluk gibi kabul edilmesi gerekmemektedir. Semen analizi, erkeğin fertilite durumunun araştırılması kadar, erkek fertilitesinin düzenlenmesi sırasında ve sonrasında, spermatogenezi izlemek amacıyla hem klinik hem de araştırma ortamlarında yararlı olabilir.