Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ KIKIRDAK DOKU ONARIMI İÇİN HİYALÜRONİK ASİT TEMELLİ YAPI İSKELELERİNİN GELİŞTİRİLMESİ VE HÜCRE KÜLTÜRLERİNDE KULLANIMI Bermali DEMİRDÖGEN KİMYA ANABİLİM DALI ANKARA 2012 Her hakkı saklıdır

2 ÖZET Doktora Tezi KIKIRDAK DOKU ONARIMI İÇİN HİYALURONİK ASİT-TEMELLİ YAPI İSKELELERİNİN GELİŞTİRİLMESİ ve HÜCRE KÜLTÜRLERİNDE KULLANIMI Bermali DEMİRDÖGEN Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Y. Murat ELÇİN Bu çalışmada hiyalüronik asit-kitosan (HA-C) ve hiyalüronik asit-elastin (HA-El) iskeleler liyofilizasyon yöntemi ile hazırlanmıştır. İskelelerin morfoloji ve kimyasal bileşimleri sırasıyla taramalı elektron mikroskopisi (SEM) ve foruier transform infrared analizi (FTIR) ile belirlenmiştir. İskelelerin şişme ve in vitro bozunma oranları ph 7,4 e tamponlanmış fosfat tuzu çözeltisi (PBS) içerisinde ve 37 C da inkübe etmek suretiyle analiz edilmiştir. İskele sistemlerinin biyolojik davranışlarının analizi için HA-C iskelelere sıçan kemik iliği mezenkimal hücreleri (MKH) ve sıçan artiküler kondrositleri ekilmiş, HA-EL iskelelere ise sıçan kemik iliği mezenkimal hücreleri ekilmiştir. Hücre yüklenmiş iskeleler 37 o C da, %5 CO 2 içeren nemlendirilmiş atmosferde kültüre edilmiştir. Mezenkimal kök hücrelerin farklılaştırılması ve kondrositlerin yeniden farklılaştırılması için TGF-β1 kullanılmıştır. Belirlenmiş zaman noktalarında örnekler kültür kaplarından alınmış ve fikse edilmiştir. Kompozit iskelelerin hücre adezyonu, çoğalması ve morfoloji değişimleri üzerine etkileri ışık mikroskopisi, histolojik ve immünohistokimyasal analizler ile incelenmiştir. Iskelelere ekilen hücrelerin yaşayabilirliği ve çoğalması belirli zaman noktalarında MTT testi ile belirlenmiştir. HA-C iskelelere ekilen mezenkimal hücrelerin farklılaşmasının tayini için hücrelerce sentezlenen toplam sgag miktarını ölçen bir dimetilmetilen mavisi boya bağlanma testi kullanılmıştır. SEM bulguları HA-C ve HA-El iskelelerin gözenek boyutları sırasıyla µm ve olan oldukça gözenekli bir yapı gösterdiğini işaret etmiştir. İskelelerin FTIR spektrumları, kompozit iskelelerin, iskeleleri oluşturan polimerleri yapısında bulundurduğunu göstermiştir. In vitro bozunma çalışmaları iskelelerin kültür koşullarında stabil olduğunu ortaya koymuştur. İskelelere ekilen hücreler yapıştı ve yayıldı oldu. MTT testi sonuçları hücrelerin iskelelerde yaşayabilirliğinin iyi olduğunu, hücrelerin HA-C ve HA-El iskelelerde çoğalmaya devam ettiklerini, histolojik incelemeler ise kondrojenik koşullar altında kondrogenezin gerçekleştiğini gösterdi. HA-C-hücre yapılarının toplam GAG analizi, sgag miktarının zamanla artma eğilimi gösterdiğini dolayısıyla kondrojenik farklılaşmayı doğruladığını işaret etmiştir. Hücreli ve hücresiz HA-C iskelelerle yapılan ilk in vivo deneyler hafif düzeyde doku reaksiyonuna neden olmuş ve MKH ekilmiş HA-C iskele örneğinde ektopik yeni kıkırdak oluşumu gözlenmiştir. Mevcut çalışmanın nihai hedefi kıkırdak doku mühendisliği için hiyalüronik asit temelli hibrit iskelelerin geliştirilmesidir. Bu sonuçlara göre HA-C ve HA-El iskeleler hücre yapışması ve çoğalması için iyi birer destek materyali olarak değerlendirilebilir. Ocak 2012, 103 sayfa Anahtar Kelimeler: Doku mühendisliği, İskele, Doğal Polimerler, Hiyalüronik asit, Kondrogenez, TGFβ, Mezenkimal kök hücreler, Artiküler kondrosit. i

3 ABSTRACT Ph.D. Thesis PREPARATION OF HYALURONIC ACID-BASED SCAFFOLDS FOR CARTILAGE TISSUE REPAIR AND THEIR USE IN CELL CULTURES Bermali DEMİRDÖGEN Ankara University Graduate School of Natural and Applied Science Department of Chemistry Supervisor: Prof. Dr. Y. Murat ELÇİN In this study hyaluronic acid-chitosan (HA-C) scaffolds and hyaluronic acid-elastin scaffolds (HA-El) were prepared by lyophilization method. The morphology and chemical composition of the scaffolds was determined by scanning electron microscopy (SEM) and Fourier transformed infrared (FTIR), respectively. Swelling ratio and in vitro degradation rate of the scaffolds were analyzed by incubation of the scaffolds in phosphate buffered saline (PBS) (ph 7.4) at 37 C. To analyze the biological behaviour of the scaffold systems, rat bone marrow mesenchymal cells (rmsc s), and rat articular condrocyte cells were seeded onto HA-C scaffolds and rat bone marrow mesenchymal cells (rmsc s) were seeded onto HA-El scaffolds. The cell-loaded scaffolds were cultivated at 37 o C in 5%CO 2 humidified atmosphere. TGF-beta1 used to induce chondrogenic differentiation of the mesenchymal cells and re-differentiation of the chondrocytes. Samples were taken at predetermined time points from culture plates and fixed. The effects of the composite scaffolds on cell adhesivity, proliferation and morphological changes were analyzed by light microscopy, histological and immunohistochemical analyses. Cell viability and proliferation of the cells that seeded on the scaffolds were determined by MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2- yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] assay at specific time points. For determination of chondrogenic differentiation of the mesenchymal stem cells seeded on the HA-C scaffolds, a dimethylmethylene blue (DMMB) dye binding assay was used which quantifies total sgag amounts synthesized by the cells. For in vivo studies the cell-loaded HA-C scaffolds were transplanted subcutaneously into 4-month-old Wistar rats. After 7, 14, 21 and 28 days the animals were sacrificied and the grafts were explanted. The explanted samples were analysed histologically. SEM observations indicated that HA-C and HA-El scaffolds showed a highly porous structure with the pore size of µm and µm, respectively. The FTIR spectra of the scaffolds showed that the composite scaffolds contain the polymers that comprised the scaffolds. In vitro degradation studies revealed that the scaffolds are stabil under culture conditions. The seeded cells onto scaffolds adhered and expanded. Results from the MTT assay showed the cells had good cellular viability within the scaffolds indicating that the cells continued to proliferate inside both HA-C and HA-El scaffolds, and histological examinations showed that under the chondrogenic conditions, chondrogenesis occurred. Total GAG analysis of HA-C-cells construct pointed out that the amount of sgag produced has a tendency of increase with time confirming chondrogenic differentiation. Preliminary in vivo studies with both the cell loaded and cell free scaffold showed a mild level of tissue reaction and in the case of the MSCs-loaded HA-C scaffold, ectopic formation of neocartilage was observed. The final goal of the current study was to develop hyaluronic acid based hybrid scaffolds for cartilage tissue engineering. According to these results HA-C scaffolds and HA-El scaffolds can be considered as good supports for cell adhesion and proliferation. January 2012, 103 pages Key Words: Tissue engineering, Scaffold, Natural polymers, Hyaluronic acid, Chondrogenesis, TGFβ, Mesenchymal stem cells, Articular condrocyte. ii

4 TEŞEKKÜR Bu çalışmanın hazırlanması aşamasında değerli fikir ve önerileri ile katkıda bulunan danışman hocam sayın Prof.Dr. Y.Murat ELÇİN e (Ankara Üniversitesi Kimya ABD), araştırmaların mikroskopiye dayalı bölümleri başta olmak üzere her konuda yardımlerını esirgemeyen değerli hocam Doç.Dr. A.Eser ELÇİN e (Gazi Üniversitesi Eğitim Fakültesi) teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca bu çalışma süresince beni destekleyen Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu na (TÜBİTAK) teşekkür ederim. Her zaman ve her koşulda yanımda olan sevgili aileme ve çok değerli arkadaşlarıma en içten duygularımla teşekkür ederim. Bermali DEMİRDÖGEN Ankara, Ocak 2012 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET...i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii KISALTMALAR DİZİNİ... viii ŞEKİLLER DİZİNİ...ix ÇİZELGELER DİZİNİ... xii 1. GİRİŞ KURAMSAL TEMELLER Kıkırdak Dokusunun Yapısı Kıkırdak Dokusunun Gelişimi Kıkırdak Dokusu Çeşitleri Hiyalin kıkırdak Elastik kıkırdak Fibröz kıkırdak Kıkırdak Doku Hasarı ve Tedavi Yöntemleri Cerrahi müdahale Transplantasyon Doku mühendisliği Kıkırdak Doku Mühendisliği Kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılan biyomalzemeler Sentetik polimerik malzemeler Doğal polimerik malzemeler Proteinler iv

6 Kollajen Jelatin Elastin Polisakkaritler Nişasta Alginat Kitosan Hiyalüronik asit Kıkırdak tedavisinde kullanılan iskeleler Hidrojeller Ağsı (fibröz) yapılar Gözenekli iskeleler (süngerler) İskele hazırlama yöntemleri Gazla köpükleme Dondurarak kurutma (liyofilizasyon) yöntemi Faz ayrımı Çözücü döküm/ tanecik uzaklaştırma yöntemi Lif (fiber) bağlama Elektroeğirme Kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılan hücreler Hücre kültür metotları Döner kap biyoreaktörleri Döner duvarlı biyoreaktörler Akış perfüzyon biyoreaktörleri Uyarıcı faktörler v

7 Büyüme faktörleri MATERYAL VE YÖNTEM Madde ve Malzeme Hiyalüronik asit-kitosan (HA-C) İskelelerin Hazırlanması Hiyalüronik asit-elastin (HA-El) İskelelerin Hazırlanması HA-C ve HA-El İskelelerin SEM Analizi HA-C ve HA-El İskelelerin FTIR Analizi Hiyalüronik asit-kitosan (HA-C) ve Hiyalüronik asit-elastin (HA-El) İskelelerin Su Tutma Kapasitelerinin Tayini Hiyalüronik asit-kitosan (HA-C) ve Hiyalüronik asit-elastin (HA-El) İskelelerin In Vitro Kütle Kaybı Tayini In Vitro Hücre Kültürü ve Kondrojenik İndüksiyon Çalışmaları Sıçan artiküler kıkırdak hücrelerinin HA-C iskelelere tohumlanması ve kondrojenik farklılaşması Sıçan kemik iliği mezenkimal hücrelerinin HA-C iskelelere tohumlanması ve kondrojenik farklılaşması Sıçan kemik iliği mezenkimal hücrelerinin izolasyonu Kemik iliği mezenkimal kök hücrelerin HA-C iskelelere tohumlanması ve kondrojenik farklılaşması MTT [3-(4,5-dimetildiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür] analizi Glikozaminoglikan (GAG) Tayini Kemik iliği mezenkimal kök hücrelerin HA-El iskelelere tohumlanması ve kondrojenik farklılaşması MTT [3-(4,5-dimetildiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür] analizi HA-C iskele hücre yapılarının in vivo deneyi Histolojik Analizler Hematoksilin-Eosin (H&E) boyaması vi

8 Alsiyan boyaması İmmünhistolojik Analizler BULGULAR Hiyalüronik asit-kitosan (HA-C) İskelelerin Hazırlanması HA-El İskelelerin Hazırlanması HA-C ve HA-El İskelelerin FTIR Bulguları HA-Ch iskelelerin FTIR bulguları HA-El iskelelerin FTIR bulguları In Vitro Şişme Oranı ve Biyobozunma Deneyi Hiyalüronik Asit-Kitosan (HA-C) İskelelere Sıçan Artiküler Kondrosit Tohumlanması ve Kondrojenik İndüksiyon Hiyalüronik Asit-Kitosan (HA-C) İskelelere Ekilmiş Sıçan Mezenkimal Hücrelerinin Kondrojenik Farklılaşması Glikozaminoglikan (GAG) tayini Hiyalüronik Asit-Elastin (HA-El) İskelelere Ekilmiş Sıçan Mezenkimal Hücrelerinin Kondrojenik Farklılaşması MTT Analizi Bulguları HA-C iskelelerde hücre yaşayabilirliğinin tayinine ait MTT bulguları HA-El iskelelerde hücre yaşayabilirliğinin tayinine ait MTT bulguları HA-C-Hücre Yapılarının In Vivo daki Davranışı TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ vii

9 KISALTMALAR DİZİNİ ADH α -MEM DMEM DMMB EDC EDTA FTIR GAG HA-C HA-El HDM H&E IHC SEM MKH MTT NHS PBS TGFβ1 Adipik asit Dihidrazit α-modifiye Eagle Besiyeri (α-modified Eagle s Medium) Dulbecco Modifiye Eagle Besiyeri (Dulbecco s Modified Eagle s Medium) Dimetilmetilen mavisi (Dimethylmethylene blue) N-Etil-N -(3-dimetilaminopropil) karbodiimit Etilen diamin tetra asetik asit Fourier Dönüşümlü Kızılötesi (Fourier Transformed Infrared) Glikozaminoglikan Hiyalüronik asit-kitosan Hiyalüronik asit-elastin Hücre dışı matriks Hematoksilin-Eosin İmmünhistokimya (Immunohistochemistry) Taramalı Elektron Mikroskopisi (Scanning Electron Microscopy) Mezenkimal Kök Hücreler [3-(4,5-dimetildiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür N-Hidroksisüksinimit Tuzlu Fosfat Tamponu (Phosphate Buffered Saline) Dönüştürücü Büyüme Faktörü (Transforming Growth Factor) β1 viii

10 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Kıkırdak histolojisi... 7 Şekil 2.2 Proteoglikan agregatı... 8 Şekil 2.3 Mezenkimal hücrelerden kondrositlere geçiş... 9 Şekil 2.4 Kıkırdak dokusu çeşitleri Şekil 2.5 Kıkırdak doku bozukluklarının tedavisinde kullanılan ve ilik uyarılmasına dayanan yöntemler Şekil 2.6 Doku mühendisliğinin basamakları Şekil 2.7 Kıkırdak doku mühendisliğinde enjekte edilebilir sistemlerden, implantasyon öncesi in vitro kültür sistemlerine ve çeşitli biyomalzeme ve kültür metodlarını kullanan yaklaşımlar Şekil 2.8 Poliglikolik asit (PGA), polilaktik asit (PLA) ve poli(laktik asit-ko-glikolik asit) (PLGA) in kimyasal formülleri Şekil 2.9 Kollajenin yapısı Şekil 2.10 Jelatinin yapısı Şekil 2.11 Nişastayı oluşturan polimerler; Amiloz ve Amilopektin Şekil 2.12 Alginatın formülü Şekil 2.13 Kitinin kitosana deasetilasyonu Şekil 2.14 Hiyalüronik asitin formülü Şekil 2.15 Kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılan iskele türleri Şekil 2.16 Embriyonik kök hücreler Şekil 2.17 Döner kap biyoreaktörü Şekil 2.18 Döner duvarlı biyoreaktör sistemi Şekil 2.19 Akış perfüzyon biyoreaktörü Şekil 2.20 TGFβ sinyal yolağı ix

11 Şekil 3.1 HA-El iskelelerin hazırlanmasının şematik gösterimi Şekil 3.2 Formazan kristallerinin oluşum reaksiyonu Şekil 4.1 HA-C iskelelerin makroskopik görüntüsü Şekil 4.2 HA-C iskelelerin SEM mikrografları Şekil 4.3 HA-El iskelelerin makroskopik görüntüsü ve SEM mikrografları Şekil 4.4 Hiyalüronik Asit (HA), Kitosan (C) polimerleri ile HA-C iskeleye ait toplu FTIR spektrumları Şekil 4.5 Hiyalüronik Asit (HA), Elastin (El) polimerleri ile HA-El iskeleye ait toplu FTIR spektrumları Şekil 4.6 HA, HA-C ve C iskelelerin şişme oranları Şekil 4.7 İskelelerdeki % kütle kaybının zamanla değişimi HA, C ve HA-C Şekil 4.8 HA, ve HA-El iskelelerdeki % kütle kaybının zamanla değişimi Şekil 4.9 HA, HA-C ve HA-El iskelelerin şişme oranları Şekil 4.10 Kondrosit tohumlanmış HA-C iskelelerin 26.gün SEM mikrografları Şekil 4.11.a,b Kondrosit tohumlanmış HA-C iskelelerin 26. ve c,d 32.gün Hematoksilin-Eosin boyamaları ve e 26.günde agrekan için yapılan IHC boyamaları Şekil 4.12.a,b Sıçan MKH leri tohumlanmış HA-C iskelelerin kondrojenik farklılaşmanın 21.günündeki Hematoksilin-Eosin, c,d Alsiyan mavisi ve e agrekan için yapılan IHC boyamaları Şekil 4.13.a Sıçan MSC leri tohumlanmış HA-C iskelelerin in vitro kondrojenik farklılaşmanın 7. ve b,c 21. günlerindeki inversiyon mikroskop görüntüleri Şekil 4.14 sgag standart grafiği Şekil 4.15 HA-C iskele- hücre kompozitlerinden salınan toplam sgag miktarının kültivasyon zamanıyla değişimi x

12 Şekil 4.16 Şekil 4.16.a Sıçan MKH leri tohumlanmış HA-El iskelelerin kondrojenik farklılaşmanın 21. ve b 28. günündeki Hematoksilin-Eosin ve c 7. ve d 14. günlerdeki Alsiyan boyamaları Şekil 4.17.a Mezenkimal kök hücre tohumlanmış HA-C iskelelerin MTT boyaması; tohumlamadan sonraki 14.gün ve b. 28.gün faz-kontrast görüntüleri Şekil 4.18 HA-C iskelelerde hücre çoğalması ve yaşayabilirliği Şekil 4.19 Mezenkimal hücre tohumlanmış HA-El iskelelerin MTT boyaması; a tohumlamadan sonraki 14.gün ve b 21.gün faz-kontrast görüntüleri Şekil 4.20 HA-El iskelelerde hücre çoğalması ve yaşayabilirliği Şekil 4.21 Kondrojenik indüksiyonun 7.gününde implante edilen MKH-HA-C yapılarının in vivo daki testinin 7., 14. ve 60. günündeki ve HA-C kontrol örneğinin 14.gündeki Hematoksilin-Eosin boyaması Şekil 4.22.a Kondrojenik indüksiyonun 7.gününde implante edilen MKH-HA-C yapılarının in vivo daki testinin 14. ve b 60. gününde agrekan için yapılan IHC boyamaları Şekil 5.1 HA-C ve HA-El iskelelere ekilmiş hücrelerin hücre yaşayabilirliği ve çoğalması xi

13 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 1.1 Çalışmada kullanılan deney grupları... 5 Çizelge 4.1 Çizelge 4.1 HA-C iskele yapımında kullanılan polimer oranlarının iskele homojenliği üzerine etkisi Çizelge 4.2 Kullanılan çapraz bağlayıcı ve çapraz bağlanma süresinin iskele dayanıklılığı üzerine etkisi xii

14 1.GİRİŞ Organ ya da doku kaybı yaşam kalitesini azaltan metabolik ve yapısal değişikliklere neden olmaktadır. Kimi hastalıklarda hasta vücudundaki eksiklik ve hasarların tedavisi için transplantasyon yapılmakta ya da tamamen yapay (polimer, metal veya seramik) olan implantlar kullanılmaktadır. Ancak tedavi için gerekli olan doku veya organ kaynağının bulunmasında hala sıkıntı yaşanmakta ve birçok hasta organ transplantasyonu listelerinde beklerken hayatını kaybetmektedir. Zenotransplantasyon kaynakları da denilen alternatif donör kaynaklarının (domuz gibi diğer türlerin verici olarak kullanıldığı) kullanımının uzun vadede uygun hale gelmesi ise spekülatif bir konudur. Ayrıca immünolojik engelin yanı sıra domuz endojenik retrovirüsü (PERV) gibi potansiyel mikrobiyolojik tehlikeler de söz konusudur. Doku mühendisliği doku reddi (hiperakut ve gecikmiş) gibi immünolojik tepkiler ve viral enfeksiyonlar gibi risklerden otolog hücreleri kullanarak kaçınabilmektedir (Vacanti vd. 2001). Rejeneratif tedavi yaklaşımı olan doku mühendisliği, normal ve hastalıklı memeli dokularında yapı-fonksiyon ilişkisinin temellerinin anlaşılması ve doku fonksiyonunun geliştirilmesi, sürdürülmesi ve yenilenmesi amacıyla biyolojik yapılar oluşturulması için sentetik veya doğal biyomalzemeler ile hücreleri bir araya getirmeyi esas almaktadır. Doku mühendisliği, mühendislik ve yaşam bilimleri ilkelerinin uygulandığı multidisipliner bir alandır (Langer ve Vacanti 1993). Organ transplantasyonu ve biyomalzeme implantasyonunun zorluklarını aşmayı amaçlamaktadır (Shalak ve Fox 1988). Doku mühendisliğinin nihai amacı, hedeflenen dokunun doğal mimarisi ve fonksiyonunu yeniden yaratmaktır. Kullanılacak malzeme, hücrelerin büyümesi ve gelişmesini destekleyebilmeli, hücrelerin serbest difüzyonlarını ve yapı içerisinde hareketlerini kolaylaştırabilmeli ve bu arada doğal doku gibi yeterince sert kalabilmelidir. Ayrıca, hücre göçüne, besin ve atıkların geçişine olanak veren yeterli 1

15 miktarda gözeneğe ve bu gözenekler arasında bağlantılara sahip olmalıdır (Kessler ve Grande 2008, Haleem ve Chu 2010) Doku mühendisliğinde, polimer yapılı iskeleler önemli bir role sahiptir. İskele yapımında kullanılan malzeme biyouyumluluk, biyobozunurluk ve mekanik dayanım gibi özelliklere sahip olmalı, daha da önemlisi iskele doku oluşumunu sağlayacak hücresel süreçleri yönetecek uygun sinyalleri sağlayabilmelidir. İskele yüzeyi, iskeleye ekilmiş hücrelerin ya da iskeleyi çevreleyen dokudaki hücrelerin hayatta kalması için önemli olan hücre bağlanması ve göçü için gerek duyulan zemini oluşturmaktadır (Segura vd. 2004). Doku mühendisliği iskelelerinin geliştirilmesinde aralarında liflerin dokuma ve dokuma olmayan yapılara manipülasyonu, buz ya da çözünür moleküllerin ( örneğin tuz, sükroz) gözenek oluşturucu ajanların ve kendiliğinden düzenlenen moleküllerin (bazı peptidler) kullanıldığı yöntemlerin bulunduğu pek çok yöntem kullanılmaktadır (Spector 2006). Doku mühendisliği için bir diğer önemli konu hücrelerdir. Kök hücreler, doku mühendisliği uygulamaları için önemli bir hücre kaynağıdır (Elçin 2004). Nispeten daha kolay izolasyon ve hızlı çoğalma özelliği taşıyan kemik iliği mezenkimal kök hücreleri, doku mühendisliği uygulamalarında sıklıkla kullanılmaktadır. Kök hücreler dışında dokuya ya da organa spesifik hücrelerin de kullanılması söz konusudur. Deri, karaciğer, kalp, damar, kıkırdak hücreleri bu sınıfa örnek olarak verilebilir. Travmatik lezyonlar ya da patolojik durumlar kıkırdakta hasarlara neden olur. Kıkırdak doku organizmada rejenerasyon kabiliyeti en zayıf dokulardan biridir. Doku mühendisliğinde son dönemlerde kıkırdak doku rejenerasyonu için kullanılmak üzere kondrositlerin ya da kemik iliğinden izole edilen mezenkimal kök hücrelerin kullanıldığı çalışmalar söz konusudur (Cristino 2008). 2

16 Sahip olduğu biyolojik ve fizikokimyasal özellikler dolayısıyla hiyalüronik asit (HA) yalnız ya da diğer doğal polimerlerle birlikte doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmaktadır. Yapılan bir çalışmada hiyalüronik asit benzil esteri (HYAFF 11) kullanılarak elde edilen iskeleye insan nazoseptal kondrositleri ekilmiş ve kıkırdak oluşumu potansiyeli araştırılmıştır. İmmünohistokimya, SEM ve konfokal lazer tarama mikroskopisi kullanılarak iskeleye ekilmiş olan kondrositlerin davranışı ve morfolojisi araştırılmıştır. İskelenin, hücrelerin yaşayabilirliği ve bağlanması açısından iyi olduğu görülmüştür. Kıkırdağa spesifik kollajen tip II üretmeleri hücrelerin, iskele içerisinde yeniden farklılaştığını ve kondrosit fenotpilerini uzun in vitro kültür koşullarında sürdürdüklerini göstermiştir. Ancak hücrelerin kollajen I ekspresyonu yaptıkları da görülmüş. Tip I kollajen ekspresyonu geri-farklılaşan ya da tamamen yeniden farklılaşmamış hücrelerin de bulunduğunu işaret etmiştir (Aigner vd. 1998). Yine bir başka çalışmada ıslak eğirme yöntemiyle elde edilen kitosan ve hiyalüronik asit (% 0.04 ve % 0.07) kaplı kitosan hibrit fiberleri tabaka şekline getirilmiş ve Japon beyaz tavşanlarından izole edilen artiküler kıkırdak hücreleri ekilmiştir. Fiberlerin hücre bağlanması, çoğalması, morfolojik değişiklikler ve hücredışı matriks sentezi üzerindeki etkileri kantitatif olarak DNA sayımı, ışık ve taramalı elektron mikroskopi (Scanning Electron Spectroscopy; SEM), yarı-kantitatif RT-PCR ve immünhistokimyasal analiz kullanılarak analiz edilmiştir. Hücre bağlanması, çoğalması ve agrekan üretiminin hibrit fiberlerde kitosan fiberlere göre belirgin şekilde yüksek olduğu görülmüştür. SEM analizi, hibrit malzeme üzerine ekilen kondrositlerin kültür süresince çoğaldığını, morfolojik fenotiplerini sürdürdükleri ve zengin bir hücredışı matriks senztezlediklerini göstermiştir. Anti-tip II kollajen antikoru ile yapılan immünhistokimyasal boyamalar, kondrositler tarafından üretilen tip II kollajeni göstermiştir (Nishimura vd. 2004). 3

17 Bir diğer çalışmada ise N-süksinil kitosan ve oksitlenmiş hiyalüronik asitten enjekte edilebilir hibrit hidrojel elde edilmiş; elde edilen jel FTIR analizi ile karakterize edilmiş. Polimer oranlarının mikroyapı, yüzey morfolojisi, basınç modülü ve in vitro bozunma üzerine etkisi araştırılmıştır. Kompozit iskelenin enjekte edilebilir iskele olarak potansiyeli domuz artiküler kıkırdak hücreleri ekilerek in vitro da test edilmiştir. Kompozit jelin hücre canlılığını desteklediği, hücrelerin kültür süresince kondrositik morfolojilerini korudukları görülmüştür (Marra vd. 2009). Bu tez çalışmasında hiyalüronik asit (HA) temelli kompozit iskelelerin geliştirilmesi amaçlanmış ve elde edilen bu iskelelerin doku mühendisliği açısından potansiyeli araştırılmıştır. Bu amaçla farklı kompozit iskeleler oluşturmak üzere hiyalüronik asitle birlikte kitosan ve elastin kullanılmıştır. Doku biyomekaniği için gerekli olan dayanıklılık ve esnekliğin sağlanmasında önemli bir rol oynayan elastin bir hücredışı matriks (HDM) proteinidir. Elde edilen kompozit yapılara hücre ekilerek kıkırdak hücrelerine farklılaşması indüklenmiş ve iskelelerin kıkırdak doku mühendisliği açısından potansiyeli in vitro ve in vivo koşullarda araştırılmıştır. Elde edilen hiyalüronik asit-kitosan (HA-C) ve hiyalüronik asit-elastin (HA-El) iskelelerin karakterizasyonu için FTIR ve SEM analizleri gerçekleştirilmiştir. İskeleler için ayrıca su tutma ve biyobozunma deneyleri gerçekleştirilmiştir. Yapı iskelelerinin biyolojik özellikleri, HA-El iskelelerde mezenkimal kök hücreler ve HA-C iskele örneğinde ise mezenkimal hücreler ve kondrositler kullanılarak incelenmiştir. Kondrojenik indüksiyon (büyüme faktörü, katkılar, vd.) uygulanmış kültür şartları ile hücre-iskele tohumlama şartları optimize edilmiş, hücre ekilen iskeleler 37 o C, %5 CO 2 - % 95 hava, % 90 nem şartlarındaki karbondioksit inkübatöründe kültüre alınmıştır. Hücre kültürleri faz-kontrast mikroskobuyla rutin olarak takip edilmiştir. Belirlenecek zaman noktalarında hücre canlılığı ve çoğalabilirliği mitokondriyal dehidrogenaz aktivitesi esas alınarak MTT yöntemiyle takip edilmiştir. Kültürde gelişen doku taslaklarının farklılaşma ve hücre dışı matriks 4

18 oluşturma özellikleri, belirli zaman noktalarında alınan örnekler üzerinde yapılan histokimya ve immünhistokimya yöntemleriyle incelenmiştir. Ayrıca HA-C iskelelere ekilen mezenkimal kök hücrelerin indüklenmiş kondrojenik farklılaşmasının belirlenmesi için glikozaminoglikan (GAG) analizi yapılmıştır. Kıkırdak doku mühendisliği açısından potansiyelleri in vitro da test edilen sıçan kemik iliği mezenkimal hücreleri ekilmiş HA-C iskelelerin, in vivo uyumluluğu insancıl protokollere uygun şekilde Wistar sıçanlarda subkutan olarak, epigastrik kasık fasiya modelinde test edilmiştir. Çizelge 1.1 Çalışmada kullanılan deney grupları Kullanılan iskele Kondrogenez için kullanılan hücre tipi Kültür şartları Hiyalüronik asit-kitosan (HA-C) Sıçan artiküler kondrositleri in vitro Hiyalüronik asit-kitosan (HA-C) Sıçan mezenkimal kök hücreleri Hiyalüronik asit-elastin (HA-El) Sıçan mezenkimal kök hücreleri Hiyalüronik asit-kitosan (HA-C) Sıçan mezenkimal kök hücreleri in vitro in vitro in vivo 5

19 2. KURAMSAL TEMELLER 2.1 Kıkırdak Dokusunun Yapısı Özel bir bağ dokusu çeşidi olan kıkırdak, embriyonun mezoderm tabakasından gelişir. Kemik hariç diğer bağ dokusu türlerinden daha serttir ancak belirli bir bükülebilirliğe ve esnekliğe sahiptir. Kıkırdak üç önemli fonksiyona sahiptir. Uzun kemiklerin gelişmesi ve büyümesi için bir kalıp gibi görev yapar. Fetal iskeletin büyük kısmını oluşturur ve endokondral kemikleşmede önemli bir rol oynar. Ayrıca büyüme çağında özellikle uzun kemiklerin büyümesine yardımcı olur. Kıkırdak kemiklerin eklem yüzeylerinde bulunmakta olup sürtünmeye karşı dirençli bir yüzey sağlar. Dahası vücuttaki bazı organları destekleyen bir yapı iskelesi görevini yerine getirir. Örneğin solunum sisteminde trake, bronş gibi hava yollarının yapısına girerek kapanmalarına engel olur. Kıkırdak sert ancak esnek bir dokudur ve temelde su ve matriks olmak üzere iki bileşenden meydana gelir. Kıkırdağın yaklaşık %85 i sudur, ancak bu oran yaşlandıkça %70 e kadar düşer. Kıkırdak dokunun içerdiği hücreler ve lifler jel kıvamındaki temel madde (matriks) içine gömülü olarak yerleşmiştirler. Kıkırdak matriksi, kollajen, proteoglikan ve non-kollajen proteinlerden oluşur. Lif ve hücrelerarası maddenin oluşturduğu yapıya matriks adı verilir. Matriks proteoglikanlar ve glikozaminoglikanlarca zengindir. Yapıdaki proteoglikanlar kıkırdağın sertliğini sağlar (Wojnar 2010). Diğer bağ doku çeşitlerinden farklı olarak kıkırdak kan damarı içermez. Bu nedenle diğer bağ dokularına nispeten kıkırdak dokusu daha yavaş büyür ve tamir olur. Kıkırdakta ayrıca sinirler ve lenf sistemi de bulunmaz. İlerleyen yaşla birlikte kıkırdak kireçlenme (kalsifikasyon) eğilimine girer. Dolayısıyla besinlerin matriksten geçişi yavaşlar, bu da kondrositlerin ölümüne ve kıkırdak dejenerasyonuna yol açar (Serafini ve Smith 1974). 6

20 Kan damarları içermeyen kıkırdak dokusunda hücrelerin beslenmesi dokunun etrafını saran ve bağ dokudan oluşan bir kıkırdak zarı (perikondriyum) vasıtasıyla gerçekleştirilir. Perikondriyum kıkırdak dokusunun (eklem yüzeylerindeki hariç) etrafında bulunan yoğun bir bağ doku tabakasıdır. Perikondriyum fibröz bir dış tabaka ile kondrojenik (kıkırdak oluşturucu) potansiyeli olan hücrelerden oluşan iç tabaka olmak üzere iki tabakadan oluşmaktadır. Dış fibröz tabaka çevre bağ doku ve damarlara komşudur; iç tabaka ise hücresel olup burada kıkırdak hücresi ve dolayısıyla hücreler arası matriks yapımının gerçekleştirildiği yerdir. İç tabakadaki kondrojenik hücreler kondroblastlara farklılaşmaktadırlar (Şekil 2.1). Şekil 2.1 Kıkırdak histolojisi ( histology.html) Erken evredeki kıkırdak hücresine kondroblast, olgun kıkırdak hücresine ise kondrosit denir. Kondroblastlar ve kondrositler kıkırdak matriksinin üretimi ve devamında görevlidirler. Kondroblastlar yüksek protein sentezleme aktivitesine sahiptir. Kondrositler kendilerine ait lakün denilen kovuklara yerleşmiş durumdadırlar µm çapındaki kondrositler genellikle bir araya gelerek izogen gruplar yaparlar. Kondrosit çekirdeği yuvarlaktır ve bir ya da daha çok nukleolus (çekirdekçik) içerir. 7

21 Kıkırdak zemin maddesi (matriksi) bazik boyalara karşı affinite gösterir. Matriksin bazofilikliği asidik sülfat gruplarından kaynaklanmaktadır. Matriksin temel bileşenleri proteinlerin, kondroitin sülfat ve keratan sülfat gibi kompleks karbohidratlarla birleşmesinden oluşan proteoglikanlardır. Proteoglikanlar hiyalüronik asite bağlanarak dev moleküller oluştururlar (Şekil 2.2). Proteoglikan agregatları denilen bu dev moleküllerin büyük negatif yükleri zincirleri iterek sıkı bir jel meydana getirirler. Ayrıca kıkırdaktaki neredeyse bütün suyu bağlar ve devasa moleküler kompleksler şeklinde kollajen liflere bağlanırlar. Matrikste kollajen lifler (Tip II) ya da elastik lifler bulunur. Proteoglikanların hücreler etrafındaki konsantrasyonu genellikle daha fazladır. Hücre etrafındaki proteoglikanca zengin mavi renkli bölgelere territoryal matriks, hücreden uzaktaki daha açık bölgelere ise interterritoryal matriks denir. Kıkırdağa esnekliğini, dayanıklılığını ve gerilmeye karşı direncini veren lifleri içeren bu hücre dışı matrikstir. Şekil 2.2 Proteoglikan agregatı (Alberts vd den değiştirilerek alınmıştır) 8

22 2.2 Kıkırdak Dokusunun Gelişimi Embriyonal dönemde tüm iskelet kıkırdak dokusundan oluşur. Daha sonra kıkırdağın büyük bir kısmının yerini kemik doku alır. Burun, gırtlak, trake, bronş, akciğerler, kulak kepçesi, eklem yüzeyi, kafatası tabanı gibi yerlerde kıkırdak kalır. Tüm bağ dokuları gibi kıkırdak dokusu da mezankim dokusundan gelişmektedir. Bu gelişme sırasında önce mezenkimal hücreler bir araya gelerek mitozla çoğalır. Oluşan bu hücre topluluğuna kıkırdaklaşma merkezi denir. Kıkırdaklaşma (kondrogenez) kıkırdağın yoğun mezankim dokusundan oluştuğu bir süreç olup, mezenkimal hücreler (a) kondroblastlara (b) farklılaşmaktadır. Kondroblastlar ise kıkırdak matriksini oluşturan molekülleri salgılamaya başlar (c). İleriki aşamada kondroblastlar kondrositlere (d) dönüşür (Şekil 2.3). Şekil 2.3 Mezenkimal hücrelerden kondrositlere geçiş Kondrogenez hücre-hücre ve hücre-matriks arasındaki sinyaller, biyomekanik sinyaller ve TGFβ süper ailesi kemik morfogenetik proteinleri (BMPs), fibroblast büyüme faktörü (FGF), epidermal büyüme faktörü (EGF), insülin benzeri büyüme faktörü (IGF), paratiroid hormon bağlantılı peptit (PTHrP)- de dahil çeşitli büyüme faktörleri ile kontrol edilir. Bu faktörler, kondrogenezi hücresel sinyal yolaklarını başlatıp 9

23 sonlandırmak suretiyle ve spesifik genlerin transkripsiyonunu kontrol ederek düzenlerler (Mainil-Varlet vd. 2006). Kıkırdağın gelişimi aposizyonel ve interstisyel olmak üzere iki mekanizmayla gerçekleşir (Alberts vd. 2002). Apozisyonel büyüme perikondriyumda, interstisyel büyüme ise kıkırdağın iç kısmında gerçekleşir. Aposizyonel büyümede perikondriyumun kondrojenik tabakasındaki hücreler, kondroblastlara farklılaşır. Kondroblastlar ise lifler ve zemin maddesini oluşturup var olan kıkırdak matriksine ekleyerek büyümeyi sağlar ve kendileri ise kondrositlere farklılaşır. İnterstisyel büyümede kıkırdak içerisindeki kondrositler mitoz bölünmeyle çoğalır ve zemin maddesi üretirler. Her iki türdeki kıkırdaklaşma gelişim çağına kadar devam eder. Ancak perikondriyumun kondrojenik özelliği devam eder ve herhangi bir kıkırdak hasarı durumunda rejenerasyonu sağlar. Kıkırdaklaşma oluşurken dokunun ara maddesinin miktarı artar ve hücreler tek tek veya gruplar halinde birbirlerinden uzaklaşırlar. 10

24 2.3 Kıkırdak Dokusu Çeşitleri Kıkırdak dokusu biyokimyasal bileşim, yapı ve vücuttaki yeri bakımından farklılık göstermektedir. Temel olarak üç tip kıkırdak mevcuttur. Bunlar; hiyalin kıkırdak, elastik kıkırdak ve fibröz kıkırdak (Şekil 2.4). Şekil 2.4 Kıkırdak dokusu çeşitleri ( /basic-anatomy/ cartilage-types) 11

25 2.3.1 Hiyalin kıkırdak Hiyalin kıkırdak, kıkırdağın en fazla bulunan şeklidir. Embriyonik dönemde pek çok kemik için bir kalıp, gelişim süresince ise birçok kemiğin büyümesinde bir büyüme plağı görevi yapar. Hiyalin kıkırdak solunum sisteminin burun, trakea, bronş gibi bölgelerinde, dış kulak yolunda ve eklem yüzeylerinde bulunur. Mavimsi beyaz renklidir. Kondrositleri yuvarlak veya oval olup lakünler içinde tek veya birkaç tanesi birlikte yer alır. Çok az bükülebilir özellikte olan hiyalin kıkırdak içerdiği kollajen lifler nedeniyle büyük gerilme direncine sahiptir ve zemin maddesi nedeniyle de basınca karşı oldukça dirençlidir. Hiyalin kıkırdak son derece pürüssüzdür ve düşük sürtünmeye sahiptir. Bu da hareket sırasında eklemdeki kemiklerin birbiri zerinde kaymasına olanak verir. Embriyonun iskeleti tamamen hiyalin kıkırdaktan oluşmuştur. Gelişmenin ileri aylarında iskelet sistemindeki kıkırdak yerini yavaş yavaş kemik dokusuna bırakır. Hiyalin kıkırdakta matriks homojen yapıdadır. Hücrelerarası temel madde glikokozaminoglikanlar ve glikoproteinlerden oluşmuştur. Proteoglikanlar katyon bağlayıcı özelliktedir bu nedenle matriks içinde su ve elektrolitlerin taşınmasında önemli rol alırlar. Tüm hiyalin kıkırdak dokularında agrekan yani miktarı yüksektir. Proteoglikan agrekan yapıları hiyalüronik asit ve bağ proteini ile bağlı proteoglikan agregatları şeklinde bulunur. Proteoglikan agregatları kıkırdağa şişkin bir hal verir, artiküler (eklem) kıkırdakta basınç yüklerine karşı koyabilecek ozmotik nitelikleri sağlarlar. Kemiklerin eklem yüzeylerinde bulunan artiküler kıkırdak hyalin kıkırdaktan oluşmaktadır (Mankin 1974). Hiyalin kıkırdağın lif türü kollajendir (Tip II). Kollajenler ince olup gevşek yapıda yerleşmişlerdir. Kollajenle proteoglikanların oluşturduğu ortam hem dokunun sağlamlığını hem de dokunun beslenmesi için gerekli diffüzyon ortamına olanak sağlar. Eklem kıkırdağı (artiküler kıkırdak) dışında hiyalin kıkırdakta perikondriyum bulunmaktadır. Eklem kıkırdağındaki bu durum gerekli sürtünme direnci için fibröz bir 12

26 tabaka yerine pürüzsüz bir yüzeye ihtiyaç olması ile açıklanabilir. Hiyalin kıkırdakta ilerleyen yaşla birlikte matriks kalsifikasyonu gibi dejenerasyonlar meydana gelir. Hiyalin kıkırdak rejenerasyonu oldukça güçtür Elastik kıkırdak Yapısında elastik liflerin hakim olduğu elastik kıkırdak, dış kulak, gırtlakta bulunur ve elastin içerir. Sarımsı bir renkte olup hiyalin kıkırdaktan kolayca ayırt edilebilmektedir. Yapısal olarak hiyalin kıkırdağa benzemekle beraber lifleri farklılık göstermektedir. Hiyalin kıkırdağa oranla elastik kıkırdak hücrelerinin sitoplazmalarında daha az yağ ve glikojen bulunur. Bu tip kıkırdakta da perikondriyum vardır. Elastik kıkırdaktaki kondrositler hiyaline göre daha fazladır. Bu kıkırdak türünde organik matriks daha az zemin maddesi (GAG lar ve diğer bileşenler) içermektedir ve elastik liflerden oluşan yoğun bir ağ yapısı söz konusudur. Ayrıca yapıda tip II kollajen lifleri de bulunmaktadır. Kıkırdağın yüzeyinde elastik lifler ince ve az sayıda iken derin kısımlarında kalın ve çoktur. Elastik kıkırdak, hiyalin kıkırdak gibi kemikleşmez Fibröz kıkırdak Çıplak gözle grimsi-beyaz renkte görülür. Bu tür kıkırdakta çok yoğun kollajen lifleri yer almaktadır. Aynı zamanda sıkı bağ dokusu ile hiyalin kıkırdak dokusu arasında geçiş tipi olarak da sınıflandırılır. Kıkırdak hücreleri ve az miktarda matriks bol bulunan kollajen lifler (Tip I) arasında yer alır. Kondrositler, tek tek ya da izogen grup dizileri oluşturarak art arda yerleşirler. Fibröz kıkırdak hiyalin ve elastik kıkırdaktaki gibi bir perikondriyum ile çevrili değildir. Bulunduğu yerler arasında; intervertebral diskler, simfizis pubis örnek verilebilir. Fibröz kıkırdak diğer kıkırdak türlerine göre daha düşük glikozaminoglikan (GAG) seviyesine sahiptir. Büyük ölçüde organize olmuş kollajen liflere sahiptir ve ligament ve tendonların uçlarında, kalça kemiklerinin birleşim yerinde bulunur. Hücreler kollajen demetleri arasında küçük lakünlerde sıralanmış bir halde bulunmaktadır. Diz eklemlerinde bulunan menisküs, fibröz kıkırdaktan meydana gelmektedir. 13

27 2.4 Kıkırdak Doku Hasarı ve Tedavi Yöntemleri Artiküler kıkırdaktaki hastalıklı ve travmatik doku bozuklukların tedavi edilerek yapısal ve fonksiyonel olarak doğal kıkırdak dokusunun özelliğinin devam ettirilmesi için çok sayıda deneysel ve klinik deneme gerçekleştirilmiştir. Bu doku bozuklukları osteoartrit (OA) gibi eklem hastalıkları, akromegali, Paget Hastalığı, Stickler Sendromu vb. genetik ya da metabolik hastalıklardan kaynaklanabileceği gibi bir travma neticesinde de meydana gelebilmektedir. Örneğin osteoartritde doku hasarı tipik olarak artiküler kıkırdak tabakasında oluşur. Süreç hücredışı matrikste proteoglikanların kaybı ve kollajenöz fibriler ağın yapısında bozulmalar meydana gelmesi ile başlar. Bunu ise hücre metaplazı ve kaybı takip eder (Hunziker 2001) Cerrahi müdahale Artiküler kıkırdak hasarlarının tedavisinde çeşitli cerrahi prosedürler kullanılmaktadır. Bunlar kondral tıraşlama, aşınma artoplastisi, subkondral delme ve osteomi gibi yöntemlerdir. Kondral tıraşlamada hasarlı bölgenin kıkırdaktan çıkarılması için bir tıraş makinesi kullanılır. Dejenere ve kısmi kalınlık hasarlarının tedavisinde bu yöntem ile irritasyon kaynağının eklemden çıkarılmasının semptomlarda bir rahatlama meydana getirdiği rapor edilmiştir (Buckwalter ve Lokmander 1994). Ancak bu yöntem kondrogenezi ve dolayısıyla da yaralı bölgenin yenilenmesini uyarmaz. Artroskopik abrazyon artroplastisi (Şekil 2.5b) 30 yıl önce, yaşlılarda diz protezine alternatif olarak geliştirilmiştir (Johnson 2001). Kemik subkondral tabakasının birkaç milimetre kazınması sonucu hücrelerin kemik ve damarlı bölgeden hasarlı bölgeye geçmesi esasına dayanır. Hasarlı bölgede oluşan kan pıhtısı fibröz kıkırdak oluşumu ile iyileşmeyi sağlamaktadır. Yöntem minimal invaziftir, ancak bu yöntemle kısa süreli (1-3 yıl) ağrı hafiflemesi sağlanabilmektedir. 14

28 Şekil 2.5 Kıkırdak doku bozuklukları tedavisinde kullanılan ve ilik uyarılmasına dayanan yöntemler Femoral kıkırdak doku bozukluğu (a), abrazyon artroplastisi (b), eğilmiş tığ kullanılarak yapılan mikrokırılma tedavisi (c), subkondral delme (d) gibi yöntemlerde fibröz kıkırdak (e) oluşumu ile tedavi edilmektedir (Ahmed ve Hincke 2010 dan değiştirilerek alınmıştır). Mikrokırılma tekniği (Şekil 2.5c) doku bozukluğu bölgesinde yaklaşık olarak 2 cm 2 lik alanda 3-4 delik olacak şekilde oldukça küçük mikro delikler açılmasını öneren Steadman tarafından geliştirilmiştir (Kocheta ve Toms 2004). Pahalı enstrümansyon gerektirmemesi ve minimal iatrojenik (tedaviden kaynaklı) doku hasarı meydana getirmesi avantajıdır. Ancak tedavi edilen doku biyomekanik olarak zayıftır, kısmi defekt dolması ve doku bozukluğu bölgesinde anormal kemik büyümesi dezavantajıdır. Subkondral (kıkırdakaltı) delme (Şekil 2.5d), tek basamaklı bir artoskopik yöntemdir yılında Pridie tarafından geliştirilmiştir (Mitchell ve Shepard 1976). Bu yöntemde kanama kanalları oluşturmak için subkondral kemik içerisine delikler açılır. Subkondral tabakada çok sayıda delik açılarak hiyalin kıkırdak oluşumu teşvik edilmektedir. Bu 15

29 prosedürün özellikle yüksek tibiyal osteomi ile birlikte diz yaralanmalarında hastaların % 85 inin tedavi ettiği rapor edilmiştir. Ancak yeni oluşan hiyalin kıkırdağın morfolojisini bir yıl içerisinde kaybettiği görülmüştür. Ayrıca delme prosesi, açığa çıkan ısı nedeniyle subkondral kemikte hasara neden olabilmektedir. Osteokondral doku bozuklukları eklemin üç bölmesinde (medial, lateral ve patellofemoral) meydana gelebilir. Bir diğer tedavi yöntemi olan yüksek tibyal (kaval kemiği) osteotomi (kemik kesimi), hasarlı orta bölgenin boşaltılması ve yükün sağlam olan lateral bölmeye transfer edilmesi esasına dayanır. Böylece acıda azalma sağlanır ve ostekondral hasarın ilerlemesi engellenmiş olur. Tedavi genç ve aktif varus diz hastalarında kullanılmaktadır. Hastaların % 80 ininden 5 yıllık dönemde, % 60 ından ise 10 yıllık dönemde etkili sonuçlar alındığı gözlenmiştir. Ancak bu yöntem ikili ya da üç bölmeli lezyonlarda kullanılamaz ve klinik sonuçlar zamanla bozulmaktadır (Wright vd. 2005) Transplantasyon Son dönemlerde ortopedi camiası biyolojik yaklaşımları daha çok kullanmaya başlamıştır (osteokondral transplantasyon ve otolog kondrosit transplantasyonu). Bu yaklaşımlardan osteokondral transplantasyon, otolog osteokondral transplantasyon (mozaikplasti) ve allograft osteokondral transplantasyon olarak ikiye ayrılmaktadır. Mozaik plasti üç aşamadan oluşmaktadır. İlk aşamada alıcı bölge hazırlanır. Bunun için kondral hasarın olduğu bölge subkondral bölgeye kadar çıkarılır ve 11 mm derinlikte delikler açılır. İkinci aşamada silindirik osteokondral greftlerin (10-15 mm uzunlukta) ağırlık taşımayan artiküler yüzeylerden çıkarılmasıdır. Son aşamada ise ostekondral greftlerin alıcı bölgelere yerleştirilmesidir. Allogreft osteokondral transplantasyon ise osteokondral lezyonların çok büyük olduğu dolayısıyla da mozaikplastinin yeterli olmadığı durumlarda kullanılır. Yöntemde hasarlı 16

30 kıkırdak dokusu ve altındaki subkondral kemik, başka organ vericisinden alınmış taze ya da taze-dondurulmuş kıkırdak parçalarıyla değiştirilir. Taze femoral osteokondral allogretlerin 10 yıllık dönemde % 85, 15 yıllık dönemde ise % 74 ünün dayanabildiği gösterilmiştir. Ancak greft bulunmasının zorluğu, vericiden hastalık bulaşma riski ve teknik zorluklar söz konusudur. Otolog kondrosit transplantasyonu (ACT), kondral ya da osteokondral hasarlarda diz fonksiyonunu iyileştirmek ve acıyı gidermek için kullanılan iki aşamalı bir hücre temelli tedavi yöntemidir (Brittberg vd. 1994). İlk aşamada sağlıklı kondrositler hastadan izole edilir ve in vitro da yaklaşık 6 hafta boyunca kültüre edilir. ikinci aşamada ise kültüre edilen hücreler açık ameliyat ile hasarlı bölgeye nakledilir. Bu yöntemle hastaların % ında hiyalin-benzeri dokusu oluşumu sağlanır ve acıda azalma, fonksiyonda iyileşme gözlenmektedir. Fakat oluşan dokunun belli oranda fibröz kıkırdak içerdiği rapor edilmiştir. İki ameliyat gerektirmesi, kondrositlerin hasarlı alandan dışarı sızması olasılığı, eşit olamayn dağılım gibi dezavantajları söz konusudur Doku mühendisliği Kıkırdak doku hasarlarının tedavisini amaçlayan bir diğer yöntem ise doku mühendisliğidir. Doku mühendisliği dokuların yapısal ve fonksiyonel olarak yeniden oluşturmayı amaç edinen bir alandır. Doku mühendisliği terimi ilk kez Amerikan Ulusal Bilim Vakfı sponsorluğunda 1988 de yapılan bir toplantıda tanımlanmıştır te Langer ve Vacanti bu alandaki gelişmeleri toparlayıp doku mühendisliğini, doku ya da organ fonksiyonunu onarmak, korumak ya da geliştirmek için hayat bilimleri ve mühendislik ilkelerini uygulayan disiplinler arası bir alan olarak tanımlaşmışlardır (Chapekar 2000). Doku mühendisliği organ ya da doku nakline bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Doku mühendisliği için çeşitli şekillerde uygulanabilir. Örneğin yeni dokunun oluşumu için yalnızca biyomalzeme ya da yalnızca hücreleri kullanılabilir. Yine hücre olmaksızın biyomalzeme ile biyosinyal moleküllerini kullanılarak da tedavi 17

31 amaçlanabilmektedir. Ancak genel olarak doku mühendisliğinin üç temel bileşenden oluşur: iskele, hücreler ve sinyal molekülleri (büyüme faktörleri vb.). Doku mühendisliği çeşitli basamaklardan oluşan bir süreçtir. Öncelikle uygun hücre kaynağı belirlenir, hücreler kaynağından n izole edilir ve yeterli miktara gelene kadar çoğaltılır. Hücrelerin bağlanacağı yüzey ya da enkapsülasyon malzemesi olarak kullanılacak uygun biyouyumlu malzeme sentezlenir, istenilen şekil ve boyutlarda üretilir. Hücreler malzemenin yüzeyine ve/veya içerisine ekilir, belirli şartlarda inkübe edilir. Hücre-iskele yapısı uygun in vivo bölgelere yerleştirilir (Şekil 2.6). Şekil 2.6 Doku mühendisliğinin basamaklar ( 18

32 2.5 Kıkırdak Doku Mühendisliği Avasküler bir doku olan kıkırdakta, vasküler dokulardaki inflamasyon ve tamir sürecinden farklı olarak tipik bir yaralanmadan sonra nekroz meydana gelmektedir. Bu nedenle kıkırdak rejenerasyonu için yenilikçi yaklaşımlara ihtiyaç vardır. Kıkırdak doku mühendisliğinde amaç, elde dilen yapay kıkırdağın doğal kıkırdakla aynı biyomekanik özelliklere sahip olmasıdır. Kıkırdak doku mühendisliğinde çeşitli yaklaşımlar denenmektedir (Şekil 2.7). Bir doku mühendisliği uygulamasının başarılı olmasında bazı faktörler önemlidir. Bunlar implansplantasyon için uygun hücrelerin sağlanması, büyüme faktörleri ve/veya sitokinler kullanılarak hücrelerin kondrojenik farklılaşmasının kontrol edilmesi, hücrelerin 3-boyutlu matriks yapılarıyla desteklenmesi ve iyileşme gerçekleşene kadar söz konusu matriksin defekt bölgesinde kalmasıdır. Hücreler immün olarak ayrıcalıklı olmalı ya da konak immün sisteminin hücreleri reddetmesini önlemek amacıyla immün baskılayıcı ajanlar sağlanmalıdır (Stock ve Vacanti 2001). Kemik morfogenetik proteinleri (BMPs) çeşitli büyüme faktörleri kemik ve kıkırdak gelişimiyle bağlantılıdır. Bu açıdan doku gelişimini kıkırdak aşamasında durdurmak önemlidir. Aksi takdirde implante edilen hücreler kemikleşmeye uğrayabilir. Hücreleri desteklemek için kullanılacak polimerik malzemelerin bozunma ürünlerinin toksik olmaması yani biyouyumlu olması tercih edilir. 19

33 Şekil 2.7 Kıkırdak doku mühendisliğinde enjekte edilebilir sistemlerden, implantasyon öncesi in vitro kültür sistemlerine ve çeşitli biyomalzeme ve kültür metodlarını kullanan yaklaşımlar (Chung ve Burdick 2008 den değiştirilerek alınmıştır) Kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılan biyomalzemeler Doku mühendisliğinde biyomalzemeler büyük öneme sahiptir. Kullanılan biyomalzeme, hücrelerin bağlanması, büyümesi farklılaşması ve yeni bir doku oluşturması için gerekli biyokimyasal mekaniksel özelliklere sahip olmalıdır. İskele yapımında kullanılan malzeme me biyouyumluluk, biyobozunurluk ve mekanik dayanım gibi özelliklere sahip olmalı, daha da önemlisi iskele doku oluşumunu sağlayacak hücresel süreçleri yönetecek uygun sinyalleri sağlayabilmelidir (Segura vd. 2004). İskele, istenilen dokuya integrasyonu ve damarlaşmayı kolaylaştıracak boyutta birbiriyle bağlantılı gözeneklere sahip olmalıdır. Biyobozunma hızı kontrol edilebilen bir malzemeden yapılmış olmalıdır. Böylece sonuçta yeni oluşan doku, biyobozunur iskelenin yerini alacaktır. İskeleler, hücrelerin bağlanması, farklılaşması ve çoğalması için uygun yüzey kimyasına sahip olmalıdır. Ayrıca implantasyon bölgesi için yeterli mekanik özelliklere sahip olmalıdır. Vücutta istenmeyen bir cevaba neden olmamalıdır. Son olarak da çeşitli şekil ve boylarda kolaylıkla üretilebilmelidir (Hutmacher 2001). 20

34 İleri doku mühendisliği üç boyutlu polimerik iskelelerin doku defektinin olduğu bölgede kullanımını içermektedir. Polimerik iskeleler, kaybedilmiş ya da zarar görmüş dokunun yeniden oluşturulması için hücrelerin bağlanacağı, çoğalacağı ve hücredışı matriksi oluşturabileceği bir iskelet yapı sağlarlar. Yapılan çalışmalar, iskele olarak hücre adezyonu ve çoğalmasını destekleyecek biyomalzemenin seçilmesinin oldukça önemli olduğunu göstermektedir. Bu nedenle kullanılacak iskele malzemesi, söz konusu dokudaki hücredışı matriksteki doğal ortama benzemelidir (Yamane 2005). Günümüzde doku mühendisliği uygulamalarında deneysel ve/veya klinik olarak 4 tip biyomalzeme ile çalışılmaktadır (Chaignaud vd. 1997). - Sentetik organik malzemeler: alifatik poliesterler, polietilen glikol vd. - Sentetik inorganik malzemeler: hidroksiapatit, trikalsiyumfosfat, cam seramikleri vd. - Doğal organik malzemeler: kollajen, hyaluronik asit, jelatin, kitosan vd. - Doğal inorganik malzemeler: mercan hidroksiapatiti vd. Biyobozunur polimerler sentetik ve doğal olmak üzere iki ana sınıfa ayrılabilir Sentetik polimerik malzemeler Sentetik polimerler, kolayca temin edilebilmeleri, ucuz maliyetleri ve kolayca işlenebilmeleri gibi özelliklerin yanı sıra göreceli olarak daha iyi mekanik dayanıma sahiptir. Bozunma hızları, hidrofilik olmaları, kristallikleri, biyoaktiflikleri ve dayanıklılıkları gibi özellikleri kolayca kontrol edilebilir. Ancak hücre tanıma sinyallerinden yoksundurlar. Bu nedenle dokudaki biyolojik çevreyle etkileşebilmeleri için sinyal molekülleri ile fonksiyonalize edilmeleri gerekir (Vial ve Andreopoulos 2009). Poliglikolik asit (PGA), polilaktik asit (PLA) ve kopolimerleri poli(laktik asit-koglikolik asit) (PLGA) (Şekil 2.8) doku mühendisliğinde sıkça kullanılan polimerlerdir. Biyouyumludurlar ve in vivo da kontroledilebilir bir hızla toksik olmayan bileşenlere 21

35 parçalanmaktadırlar. Uzun zamandır, bozunabilen cerrahi dikiş ipliği yapımında kullanılmaktadırlar. Ester bağlarının hidrolizi ile bozunmakta olup, bozunma ürünleri vücuttan CO 2 ve su şeklinde uzaklaştırılmaktadır. Bozunma hızı kimyasal bileşimin, kristalliğin, molekül ağırlığının değiştirilmesiyle düzenlenebilmektedir. PGA, nispeten daha hidrofilik yapıda olması nedeniyle polimerik iskele yapımında sıkça kullanılmaktadır. In vivo da mekanik dayanımını iki ila dört hafta içerisinde kaybetmektedir. PLA daki ekstra metil grubu onu PGA ya göre daha hidrofobik hale getirmektedir. Bu nedenle de sulu çözeltilerde ve in vivo da daha yavaş bir bozunma hızına sahiptir. PLA in vivo ve in vitro da aylarca mekanik dayanımını koruyabilmektedir. PLA hidrolitik olarak laktik asite parçalanır. Bozunma hızları PGA ve PLA in bozunma hızları arasında olan PLGA kopolimerleri değişik oranlarda PGA ve PLA kulllanılarak sentezlenmektedir (Pachence ve Kohn 2000, Armentano 2010). Şekil 2.8 Poliglikolik asit (PGA), polilaktik asit (PLA) ve poli(laktik asit-ko-glikolik asit) (PLGA) in kimyasal formülleri Doku mühendisliğinde kullanılan diğer sentetik polimelere poli(kaprolakton) (PCL) (Lepoittevin vd. 2002) ve poli(hidroksi butirat) (PHB) (Martin ve Williams 2003) örnek verilebilir. PCL PLA, PGA ve PLGA dan oldukça yavaş bir bozunma hızına sahiptir (Kang vd. 2007). Bu nedenle de PCL biyomedikal uygulamalar açısından daha az kullanışlıdır. Ancak uzun dönem implantları ve kontrollü salım sistemleri uygulamaları 22

36 açısından PCL daha çekicidir. PCL daha çok kemik doku mühendislği uygulamalarında kullanılmakta, iskele uygulamalarında yeterli mekanik özelliklere sahip olup en az 6 aya kadar fiziksel özelliklerini koruyabilmektedir Doğal polimerik malzemeler Bu tip biyomalzemeler spesifik hücre reseptörleri aracılığıyla hücrelerle etkileşebilme yeteneğine sahiptirler. Bu etkileşim hücre çoğalması ve protein sentezine katkı sunar. Ancak bu malzemeler immün cevaba neden olabilmektedir. Ayrıca enzimatik bozunmaya uğradıklarından uzun dönem dayanıklılık gerektiren uygulamalar için pek uygun değillerdir (Vial ve Andreopoulos 2009). Pek çoğu kaynak bakımından sınırlı olduğundan, pahalı olabilmektedir. Doğal polimerlerin kullanıldığı organik malzemeleri klinik olarak protein-temelli ve karbohidrat-temelli olmak üzere sınıflandırılabiliriz Proteinler Proteinler aminoasitlerin peptit bağları ile bir araya gelmesi sonucu oluşan tekrar eden aminoasit ünitelerinden oluşan yüksek molekül kütleli polimerlerdir. İnsan vücudundaki yumuşak ve sert dokuların temel bileşeni olduğundan protein temelli malzemelerin kullanımı doku mühendisliği ve ilaç salım sistemleri uygulamaları araştırılmaktadır Kollajen Kollajen insan vücudunda kemik, deri, ligamentler, kıkırdak ve tendonların temel bileşenidir. Ayrıca kan damarlarının yapısında da bulunur. Kollajen üçlü-helis yapısına sahip bir protein olup, hücre adezyonu, göçü ve farklılaşmasına olanak sağlayan ligandlar içermektedir. Ana zinciri boyunca sahip olduğu fonksiyonel grupları yerel ya da yüklenmiş büyüme faktörleri ile etkileşmesine yardımcı olur (Nair ve Laurencin 2006). 23

37 Kollajen tekrar eden glisin, pirolin be hidroksipirolinin tekrar eden sekanslarından oluşan bir polipeptittir. Tekrar eden tripeptit dizileri (Glisin X Prolin) veya (Glisin X Hidroksiprolin) şeklinde gösterilebilir ki burada X, herhangi bir amino asit olabilir. Bunlardan hidroksiprolin ve hidroksilizin kollajene özgü amino asitlerdir. Hidroksilleme kollajenin kararlılığını arttırır. C vitamini eksikliğinde pirolin hidroksi piroline dönüşemediğinden bağ dokusu iyi oluşmaz. Diş etinde şişme ve kanamalarla seyreden iskorbit hastalığı oluşur. Şimdiye kadar moleküler yapılarından dolayı birbirinden farklı olan en az 22 tane değişik tipi tanımlanmıştır. Şekil 2.9 Kollajenin yapısı ı (Campbell 1995 ten değiştirilerek alınmıştır) Kollajende her biri sola dönen 3 helis, birbirinin etrafında sarılarak sağa dönen üçlü bir sarmal yapı oluşturur. H bağları ile sağlamlaşan bu 3 lü helise tropokollajen denir. Polipeptit alt birimler olan α-zincirler, bir ortak eksen etrafında dönerek katı bir çubuk benzeri bir molekül yapar; bunlar fibrilleri oluştururlar. Fibriller, lifleri, lifler de kollajen demetleri oluşturur (Şekil 2.9). Biyouyumluluğu ve çeşitli ajanlarla kolaylıkla çapraz bağlanabilmesi nedeniyle doku mühendisliği ve ilaç salımı uygulamalarında sıklıkla kullanılmaktadır. Kollajen oftalmolojide göze kornea yedeği, dikiş malzemesi, ameliyat süresince vitröz yapının yedeği olarak görev yapmak üzere viskoz çözeltiler olarak kullanılmaktadır (Kaufman 1994). 24

38 Daha önce de bahsedildiği gibi kollajen hücresel adhezyonu ve çoğalmayı önemli ölçüde arttırmaktadır. Bu nedenle kollajen süngerler yara ve yanık tedavisi uygulamalarında kullanılmaktadır. Proteoglikanlarla birleştirilmiş kollajen yapıları yapay deri olarak araştırılmaktadır (Burke 1981). Fibröz yapısından dolayı kollajen gerilmeye karşı dirençlidir ve bu nedenle yapısal bütünlüğün korunmasının gerektiği uygulamalarda kullanılmaktadır. Örneğin kollajen ve hidroksiapatitten oluşan iskele yapıları kemik doku mühensiliğinde kullanılmaktadır. Collagraft (Zimmer and Collagen Corporation), tip I kollajen ve hidroksiapatit/trikalsiyumfosfat granüllerinden oluşan bir malzemedir ve Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından onaylanmış bir kemik greftidir. Ancak immünojenik olma özelliği ve yüksek maliyeti nedeniyle klinik denemelerde sıkça kullanılamamaktadır Jelatin Jelatin sıkça tekrarlanan glisin (%30), pirolin ve 4-hidroksipirolin (%25) sekanslarından ve diğer 20 aminoasitden meydana gelen biyouyumlu bir proteindir (Şekil 2.10). Jelatin kollajenin termal denatürasyonu ile elde edilir. üretim yöntemine göre asidik (Tip A) ya da bazik (Tip B) jelatin elde edilebilir. Jelatin antijen özelliği göstermez ve yüksek hemostatik özelliğe sahiptir. Biyolojik olarak güvenli olmasından dolayı Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi tarafından onaylanmış birçok medikal üründe kullanılmaktadır. Jelatin kolaylıkla çeşitli çapraz bağlayıcılar ile çapraz bağlanarak hidrojeller oluşturmaktadır. Hazırlama koşullarına bağlı olarak jelatinin elektrik doğası değiştirilebilmekte ve böylelikle değişik izoelektrik noktaları olan jelatinler elde edilebilmektedir. Bu da jelatinin diğer iyonik polimerlerle bir araya gelerek polielektrolit kompleksler oluşturmasına olanak verir (Nair ve Laurencin 2006). 25

39 Şekil 2.10 Jelatinin yapısı Elastin Elastin, deri, akciğerler, mesane, elastik kıkırdak ve kan damarlarında bulunan bir hücredışı matriks proteinidir. İnsan elastini, düz kas hücreleri, endotelyal hücreler, fibroblastlar ve kondrositler tarafından yaklaşık 72 kda luk çözünebilir bir öncül molekül olan tropoelastinden sentezlenir (van Kuppevelt 2007). Bileşimi yaklaşık % 75 hidrofobik kalıntılar (Gly, Val, Ala), ve çözünür olmayan zincirler arası çapraz bağlardan oluşur (Debelle 1999). Elastin yaklaşık 70 yıllık yarılanma ömrü ile insan vücudundaki en kararlı proteindir (Powell 1992). Elastin bulunduğu dokuya esneklik ve dayanaklılık verir. Elastin son dönemlerde doku mühendisliğinde hidrojeller (Hoffman 2001), elastin mimetik polimerler (McMillan ve Conticello 2000) ve aselüler elastin matrisler (Kajitani vd. 2001) olarak biyomalzemelerin dizaynında kullanılmaktadır. Ancak dikkate değer özelliklerine rağmen çözünür olmaması nedeniyle doğal elastin doku mühendisliği greftlerinde çok fazla kullanılmamaktadır (Weiss 2004). 26

40 Polisakkaritler Polisakkaritler bir ya da iki monosakkarit ünitesinin tekrar etmesiyle oluşmuş yüksek molekül kütleli polimerlerdir. Değişik özellikte ve yapıda bulunur, kolayca temin edilir ve nispeten düşük maliyetlere sahiptirler. Ayrıca polisakkaritlerin çoğu sahip oldukları reaktif fonksiyonel gruplar nedeniyle kolayca modifiye edilebilmektedir. Biyobozunurlukları, biyouyumlulukları ve suda çözünebilmeleri ve hidrojel oluşturabilmeleri polisakkaritleri doku mühendisliği ve ilaç salımı için değerli kılmaktadır (Nair ve Laurencin 2006) Nişasta Bitkilerde glikozun depolanma biçimi olan nişasta yapısal olarak doğrusal olan amiloz (% 20-30) ve dallanmış olan amilopektin (% 70-80) polimerlerinden oluşur. Amiloz ve amilopektin tekrar eden glikoz ünitelerinden meydana gelmiştir. Amilozda glikoz birimleri α (1 4) bağı ile bağlanmış olup nispeten daha uzun bir yapı oluşturmaktadır. Amilopektin ise ona sıkı ve dallanmış bir yapı sağlayan α (1 6) bağlarına sahiptir (Şekil 2.11). 27

41 A B Şekil 2.11 Nişastayı oluşturan polimerler; Amiloz (a) ve Amilopektin (b) Nişasta, çeşitli biyomedikal uygulamalarda kullanılmak üzere kolaylıkla film, lifli ve gözenekli yapılar şekline getirilebilir. Ayrıca son dönemlerde nişasta temelli gözenekli iskeleler geliştirilmektedir (Hutmacher 2002, Oliveira 2007). 28

42 Alginat Alginat deniz yosunlarından elde edilen negatif yüklü bir kabrohidrat olup, mannuronik asit ve guluronik asit kalıntıları içermektedir (Şekil 2.12). Kalsiyum varlığında alginat zincirleri çapraz bağlanmaktadır. Bir çalışmada artiküler kondrosit hücreleri küreler içerisine enkapsüle edilmiş ve hasarlı bölgeye transplante edilmiştir (Heiligenstein 2011). Şekil 2.12 Alginatın formülü Kitosan Kitosan (2-amino-2deoksi-(1 4)-β-D-glukopiranoz), kitinin deasetilasyonu ile elde edilen doğrusal bir aminopolisakkarittir. Kitin, kabuklu deniz hayvanlarının (karides, yengeç, kalamar) kabuklarında çok miktarda mevcut olan ve yeryüzünde selülozdan sonra en fazla bulunan doğal bir biyopolimerdir. Kitosanda β(1-4)- bağlı D-glukozamin ve N-asetil D-glikozamin birimleri rastgele olarak dağılmıştır. Deasetilasyon işlemi, kitinin üzerindeki asetilamino (-NH-CO-CH 3 ) gruplarının amino (-NH 2 ) gruplarına dönüştürülmesi işlemidir (Şekil 2.12). Bu deasetilasyon sonunda N-asetil-D-glukozamin 29

43 grupları tamamen dönüştürülemez ancak sayıları D-glukozamin gruplarına göre azalır (Şekil 2.13). Şekil 2.13 Kitinin kitosana deasetilasyonu Kitosan ph 5.0 den asidik sulu çözeltilerde tamamen çözünmektedir. Vücutta enzimatik olarak lizozim tarafından toksik olmayan ürünlere parçalanır. Kitosanın bozunma hızı asetilasyon derecesine ve kristalliğine bağlıdır (Khor ve Lim 2003). ph 6.5 in altında, kitosan yüksek pozitif yük yoğunluğa sahiptir. Kitosan bu katyonik özelliği nedeniyle anyonik glikozaminoglikanlar (GAG), proteoglikanlar ve diğer negatif yüklü moleküllerle elektrostatik etkileşimlere girer. Kitosanın biyoahdesiv özelliği buradan kaynaklanmaktadır. Kitosan negatif yüklü yüzeylere (örneğin mukozal membran gibi) kolayca bağlanabilir. Kitosanın bir diğer ilgi çekici özelliği antibakteriyel aktivitesidir. Tavşanlarda deneysel olarak meydana getirilen Staphylococcus Aureus un neden olduğu osteomiyelitin enfeksiyon oranını düşürdüğü gözlenmiştir. Kitosanın katyonik grupları bakteri hücre 30

44 duvarındaki anyonlarla etkileşerek biyosentezi baskılamış, ayrıca kitosan hücre duvarından madde geçişini engelleyerek bakterinin ölümüne yol açmıştır. Kitosanın kolay işlenilebilirliği diğer özellikleriyle bireşerek onu çeşitli medikal uygulamalar açısından uygun bir polimer haline getirmektedir. Kitosan aralarında alginat, hidroksiapatit, hiyalüronik asit, kalsiyum fosfat, poly-l-laktik asit (PLLA) ve büyüme faktörleriyle birlikte ortopedik uygulamalar için kullanılmıştır. Ayrıca doku mühendisliğinde jeller, süngerler, fiberler ve seramikler, jelatin ya da kollajen gibi malzemelerle birlikte kullanıldığı gözenekli kompozitlerin yapımında da kullanılmaktadır (Di Martino 2005) Hiyalüronik asit Hyalüronik (HA) asit sülfatlanmamış bir mukopolisakkarittir (glikozaminoglikan). Bu nedenle de GAG ların içinde en basit yapılı olanı olarak değerlendirilir. Hücredışı matriksteki polisakkarit zincirlerine mukopolisakkaritler ya da Glikozaminoglikan (GAG) denir. GAG lar tekrar eden disakkarit ünitelerinden oluşan dallanmamış polisakkaritlerdir. GAG olarak adlandırırlar çünkü tekrarlanan ünitelerdeki 1 ya da 2 şeker bakiyesi amino şeker (N-asetilglikozamin, N-asetilgalaktozamin) yapısındadır. Hiyalüronik asit (hiyaluronan ya da hiyaluronat) ilk olarak, 1934 yılında Karl MEYER ve John PALMER tarafından inek gözünün vitröz kısmından(camsı sıvı) izole edilmiştir (Meyer ve Palmer, 1934). Hiyalüronik asit ismi hyalos (yunanca vitröz, camsı anlamına gelir) ile üronik asitten gelmektedir. Üronik asit içermesi ve izole edildiği yerin vitröz doku olmasından dolayı ona hiyalüronik asit ismini vermişlerdir. Hiyaluronat terimi tuz şeklini (konjugat bazı) ifade eder. HA molekülü tipik olarak in vivo da polianyonik formunda bulunduğu için daha çok hiyaluronan olarak ifade edilir. HA, hücredışı matriksin temel bileşenlerinden biridir. Tüm vücutta bulunmasına rağmen eklem sıvısı (sinoviyal sıvı), göbek kordonu, dermis (alt deri), deri altı dokuları ve kıkırdak gibi gelişen özelleşmiş dokularda, gözde ve dişte oldukça fazla bulunmaktadır. Bu dokularda doku viskozitesi, doku ozmozu, şok absorpsiyonu, yara 31

45 iyileşmesi ve boşluk doldurma gibi çeşitli fonksiyonları etkiler. Hücreleri bir arada tutar, oksijen ve diğer besleyici maddelerin geçişine olanak verir. Hücre çoğalması ve göçüne belirgin bir katkıda bulunur. Tendon ve kıkırdak dokusunda bulunur ve onlara esneklik ve dayanıklılık kazandırır. Eklem boşluklarını doldurarak kayganlık sağlar. HA ses tellerine bazı viskoelastik özellikler sağlaması nedeniyle ses üretimi için de oldukça önemlidir (Brown ve Jones 2005). Ovum, etrafi spermlere karşı seçici bir bariyer gibi görev yapan HA tabakasıyla çevrilidir. Şekil 2.14 Hiyalüronik asitin formülü HA temel olarak 2 şeker ünitesinden (glukuronik asit ve N-asetil glukozamin) oluşur (Şekil 2.14). Bu şeker molekülleri polimerleşerek den fazla tekrar üniteden oluşan bir yapı meydana getirir. Yapıda glukuronik asit ve N-asetil glukozamin β-1,4 ve β-1,3 glikozidik bağları ile bağlanmıştır. Hiyalüronan polimerinin kütlesi in vivo da 5000 den 20 milyon Da arasında değişmektedir. Örneğin insan sinoviyal sıvısındaki ortalama molekül kütlesi 3-4 milyon Da, göbek kordonundan izole edilen hiyalüronanın ise 3,14 milyon Daltondur. Molekül kütlesi değerlerinden de görüldüğü gibi HA, hücredışı matriksin en büyük bileşenlerinden biridir. HA suda çözünebilen bir polimer olup suda oldukça yüksek viskoziteli çözeltiler oluşturmaktadır. HA ana zinciri disakkarit yapısı, internal H bağları ve çözücüyle etkileşimlerden dolayı yüksek viskozitede çözelti verir. Aksiyel hidrojen atomları polar 32

46 olmayan, nispeten hidrofobik yüzey oluştururken, ekvatoral zincirler daha polar, hidrofilik yüzeyler oluşturur bu da dolambaçlı bir şerit yapısını meydana getirir. Sonuç olarak HA molekülü rastgele bükülmüş geniş bir yapı oluşturur ki bu yapı oldukça geniş bir alanı işgal eder. HA çözeltisinin viskozitesi HA nın zincir büyüklüğüne, çapraz bağlanmaya, ph ve kimyasal modifikasyona bağlıdır (Price 2007). HA pek çok kaynaktan elde edilebilir ancak en fazla kullanılan yöntem horoz ibiğinden ekstraksiyon ve streptococcus bakterisi kullanılarak rekombinant üretimdir. Hiyaluronan, hiyaluronan sentetaz adındaki bir sınıf integral membran proteini tarafından sentezlenir. HA sentetaz HAS1, HAS2 ve HAS3 olmak üzere üç çeşittir. Bu enzimler oluşan polisakkarit zincirine tekrar tekrar glukuronik asit ve N- asetilglikozamin ekleyerek HA yı uzatırlar. Oluşan HA zinciri hücre membranından çıkarak hücredışına gelir (Manna 1999, Price 2007). Hiyaluronan, hyaluronidaz denilen bir enzim ailesi tarafından bozunur. İnsanlarda birkaçı tümör baskılayıcı olan en az 7 tip hyaluronidaz bulunmaktadır. Hyalüronidaz, hyalüronik asitteki glikozidik bağları koparan bir enzimdir. Enzimatik degredasyon HA makromolekülünü daha küçük olan polimerlere böler. HA nın bozunma ürünleri (oligosakkaritler ve çok düşük molekül kütleli HA) pro-anjiyogenik özellikler gösterir (West vd. 1991). Bunlardan pek çoğu yara iyileşmesini düzenler. Fetal ve yetişkin doku onarımı arasında temel farklılıklar vardır. Fetal yaralarda akut inflamatuar cevap yoktur, fibroblast kümelenmesi ve proliferasyonu minimaldir, belirgin neovaskülarizasyon görülmez, kollajen depo edilmez ve yara matriksi primer olarak hücre migrasyon ve proliferasyonunu artıran bir hiyalüronik asittir. Fetal yaralarda hiyalüronik asitin bol oluşu sellüler yapı ve matriksin oldukça organize şekilde gelişmesini sağlayarak skarsız iyileşmede rol oynar. Yetişkinlerde yara yerinde bir fibrin ve hiyalüronik asit matriks oluşur, fakat bu, hızla yerini kalıcı, başlıca Tip l'den oluşan kollajen matrikse bırakır. Oysa fetal matriksde onarım tamamlanıncaya kadar hyalüronik asit seviyesi yüksek oranda kalır (Mast vd 1992). HA sahip olduğu özellikler dolayısıyla yara tedavisi uygulamalarında kullanılmaktadır. Yara bölgesindeki serbest 33

47 radikalleri etkisiz hale getirir ve böylelikle inflamasyonu azaltır. Çeşitli biyomoleküllerle etkileşir, bakteri önleyici özelliğe sahiptir ve doku tedavisiyle ilişkili çeşitli hücrelerdeki reseptörler tarafından tanınabilmektedir. HA, mezenkimal ve epitel hücrelerin göçü ve farklılaşmasına katkı sağlar ve böylece kollajen depolanmasını ve anjiyogenezi artırarak doku onarımını hızlandırır (Lloyd 1998). Hiyaluronan (HA) ilaç salımı, doku mühendisliği ve viskodestekleme gibi uygulamalar için oldukça ilgi çekicidir. Ancak hiyaluronan temelli biyomalzemelerin geliştirilmesinde HA nın zayıf biomekanik özellikleri engel teşkil etmektedir. Doğal HA ya çeşitli modifikasyonlar yapılarak mekanik ve kimyasal olarak sağlam malzemeler elde edilebilmektedir. Elde edilen HA türevleri doğal HA dan farklı olan fizikokimyasal özeliklere sahip olup, pek çoğu doğal HA nın sahip olduğu biyouyumluluk ve biyobozunurluk özelliklerine sahip olmaya devam eder. Kovalent modifikasyon için en çok kullanılan iki fonksiyonel grup; karboksilik asit ve hidroksil gruplarıdır Kıkırdak tedavisinde kullanılan iskeleler Bir iskelenin temel amacı hücre ekimini, çoğalmasını ve bazı durumlarda farklılaşmasını (mekanik uyarı ve sinyal molekülleri sayesinde) desteklemektir (Vial ve Andreopoulos 2009). İskeleler morfolojilerine göre hidrojeller, fibröz (ağsı) yapılar ve gözenekli iskeleler olmak üzere sınıflandırılabilir (Şekil 2.15). 34

48 Şekil 2.15 Kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılan iskele türleri (Chung ve Burdick 2007 den değiştirilerek alınmıştır.) İskeleler kıkırdak dokusu için gerekli olan 3-boyutlu ortamı sağlarlar. İskelelerin sahip olması gereken bir takım özellikler vardır. İskeleler kontrol edilebilen bir bozunma kinetiğine sahip olmalı, hücre yaşayabilirliğini, farklılaşmasını ve hücredışı matriks üretimini uyarabilmeli, besin maddelerinin ve atıkların difüzyonuna olanak vermeli, çevresindeki doğal kıkırdak dokusuyla kaynaşabilmeli ve hasarın olduğu bölgedeki mekanik sağlamlığı sağlamalıdır. İskeleler hidrolitik ya da enzimatik olarak bozunabilir. İskele bozunma hızı zamansal ve mekansal olarak kontrol edilerek, iskelelerin yeni doku oluşumunu desteklemesi sağlanabilir (Chung ve Burdick 2007) Hidrojeller Hidrojeller, çok miktarda su ve diğer biyolojik sıvıları absorblayan çapraz bağlanmış polimerik ağlardır. Kıkırdak gibi yüksek su oranına sahip dokuların doku mühendisliği uygulamalarında tercih edilmektedir (Kuo vd 2006). Hidrojeller enjekte edilebilir ya da implante edilebilir bir formda hazırlanabilir. Enjekte edilebilir formda hazırlanan hidrojeller her şekil ve büyüklükteki defekt bölgesini kolayca doldurabilir ve minimal invazif bir şekilde implante edilebilirler. Hücreler hidrojeller içerisinde homojen bir şekilde 3-boyutlu olarak süspanse olabilir. Hidrojeller mekanik yüklere uyum sağlayabilir. Mekanik özellikleri çapraz bağlama 35

49 yoğunluğu değiştirilerek değiştirilebilir ancak sınırlı mekanik özellikleri hidrojellerin temel dezavantajıdır (Bryant ve Anseth 2002). Hidrojeller fiziksel ya da kimyasal olarak çapraz bağlanabilir. Fiziksel çapraz bağlamada moleküller iyonik, hidrofobik etkileşimler ve hidrojen bağları ile bir arada tutulurken, kimyasal çapraz bağlamada moleküller kovalent olarak bağlıdır Ağsı (fibröz) yapılar Ağsı yapılar dokunmuş ve dokunmamış liflerden oluşur. Fiber çapı, fiberin yönlenmiş olup olmadığı ve fiberler arası alan hücresel aktiviteyi etkilemektedir. Dokunmamış fibröz yapılar fiberlerin mekansal dağılımı ve yüzey alanı nedeniyle doku rejenerasyonu açısından daha uygundur. Dokunmuş fibröz yapılar ise daha güçlüdür ve gözenek yoğunluğu ve boyutu açısından çeşitli şekillerde üretilebilirler (Chung ve Burdick 2007) Gözenekli iskeleler (süngerler) Gözenekli iskeleler fizyolojik ortamdaki davranışlarını belirleyen gözenek boyutu, gözeneklilik ve gözenekler arası bağlanabilirliği gibi belirli özelliklere sahiptir. Gözeneklilik hücre adezyonu için yüzey alanını, gözenek boyutu ve bağlanabilirliği ise hücre davranışı ve gerekli besinlerin iskele içerisine taşınmasını etkiler. Gözenekli iskeleler çeşitli biyomalzemelerden çeşitli yöntemler kullanılarak değişik konformasyonlarda hazırlanabilmektedir. Biyolojik faktörler (büyüme faktörleri, sitokinler vb.), hücreler ya da farmasötiklerin enkapsülasyon ya da yüzey modifikasyonu ile ilavesi kıkırdak tedavisini destekleyebilmektedir (Hile vd. 2000). 36

50 2.5.3 İskele hazırlama yöntemleri Doku mühendisliğinde 3-boyutlu iskelelerin polimerlerden hazırlanmasında porojen özütleme, emülsiyon dondurarak kurutma ve gaz köpükleme dahil pek çok metot kullanılmaktadır (Chen vd. 2002) Gazla köpükleme Gaz köpükleme yönteminde PLGA gibi bir polimer çözeltisi yüksek basınçta CO 2 ile doyurulmaktadır (Mooney vd. 1996). Gazın polimerdeki çözünürlüğü, CO 2 in basıncının atmosferik değerine hızlıca düşürülmesi ile azaltılır. Böylece polimerik yapı içerisinde büyüklüğü µm arasında değişen ve gözenekleri oluşturan gaz baloncukları oluşur. Daha sonra CO 2 ortamdan uzaklaştırılır. Gözeneklilik ve gözenek yapısı polimer içerisinde çözünen gaz miktarına, gaz baloncuklarının oluşma hızına bağlıdır Dondurarak kurutma (liyofilizasyon) yöntemi Uygun çözücüde hazırlanmış polimer çözeltisi dondurulur ve daha sonra donmuş haldeki çözücü yapıdan uzaklaştırılır. Sonuçta gözenekli polimerik yapı oluşur (Whang vd. 1995). Çözeltinin dondurulması ile çözücü molekülleri kristaller şeklinde donar ve böylelikle polimerik yapı içerisinde gözeneklerin oluşmasına neden olur. Kristaller dondurulmuş polimer çözeltisinin liyofilize edilmesiyle uzaklaştırılmaktadır. Gözenek boyutu dondurma hızı, ph ve polimer konsantrasyonunun değiştirilmesi ile kontrol edilebilir. Dondurma hızının yüksek olması daha küçük gözenek oluşmasına yol açar. 37

51 Faz ayrımı Polimer fenol ya da naftalin gibi bir çözücüde çözünür. Sıcaklık düşürülerek sıvı-sıvı faz ayrımı oluşturulur ve su ilave edilerek iki fazlı bir katı oluşturulur (Schugens vd. 1996). Yöntem homojen polimer-çözücü karışımının polimerce zengin faz ve polimerce fakir faz olarak termodinamik olarak ayrılmasına dayanmaktadır. Bu ayrım polimer çözeltisine, çözücüyle karışmayan başka bir çözücünün ilave edilmesi ya da polimer çözeltisinin çözünürlük eğrisinin denge faz sınırı altında kalan bir sıcaklığa soğutulması ile gerçekleştirilir. Çözelti dondurarak kurutma ile uzaklaştırılır ve geriye gözenekli polimerik yapı kalır Çözücü döküm/ tanecik uzaklaştırma yöntemi Bu yöntemde polimerin organik bir çözücüde hazırlanmış çözeltisine belirli çapta tuz partikülleri ilave edilerek homojen bir süspansiyon hazırlanır (Mikos vd. 1994, 1996). Daha sonra çözücü buharlaştırılır ve geriye tuz partiküllerini içeren polimer matris kalır. Kompozit yapı suya bekletilir ve böylelikle yapıdaki tuz uzaklaştırılır, geriye ise gözenekli polimerik yapı kalır. Bu yöntemde genellikle suda çözünen tuz ve karbohidratlar gibi partiküller kullanılmaktadır. Gözenekler kullanılan partiküllerin özellikleri ve miktarı ile kolaylıkla kontrol edilebilmektedir (Sachlos ve Czernuszka 2003) Lif (fiber) bağlama Yöntem Mikos ve arkadaşları tarafında geliştirilmiştir (Mikos vd. 1993). Sentetik polimer (örneğin PLLA) kloroformda çözünür ve dokunmamış PGA ağları eklenir. Daha sonra çözelti buharlaştırılarak uzaklaştırılır ve içine bağlanmamış PGA lifler yerleşmiş PLLA matristen oluşan kompozit bir yapı oluşur. Liflerin PGA nın erime noktasından yüksek sıcaklıkta yapılan ısıtma işlemi ile birbirine bağlanması sağlanıır. 38

52 PLLA matris ise hibrit yapının metilen klorürde çözünmesi ile uzaklaştırılır. Çünkü PGA bu çözücüde çözünmemektedir Elektroeğirme Yöntemde elektrostatik kuvvet kullanılarak nanodan mikro ölçeğe polimerik lifler elde edilmektedir. Karşıt yükteki iki elektrot arasındaki elektrik alanın yoğunluğu ile yöntem kontrol edilir. Elektrotlardan biri polimer çözeltisine diğeri ise toplayıcıya yerleştirilir. Polimer çözeltisi pompalanarak gönderildiği için çözelti damlaları oluşur. Daha sonra elektrik alan oluşturulur ve oluşan kuvvet ile damlalardaki yüzey geriliminin üstesinden gelinir. Polimer çözeltisi damla damla değil, sürekli bir şekilde akar. Aynı anda çözelti buharlaşır ve oluşan polimerik lif toplayıcı üzerinde toplanır Kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılan hücreler Kıkırdak doku mühendisliği için en uygun hücre tipi hala araştırılmaktadır. Şimdiye kadar kondrositlerin, fibroblastların ve kök hücrelerin kıkırdak tedavisindeki potansiyelleri üzerine çalışılmıştır. Kıkırdak doku mühendisliğinde doğal olarak ilk akla gelen hücre tipi kondrositler ve kondroblastlardır. Ancak farklılaşmış dokudan üretildiklerinden yeterli çoğalma ve yeniden farklılaşmayı sağlamada yetersiz kalabilmektedirler. Ayrıca hasarlı dokudan hücrelerin izolasyonunda zorluklar olabilmektedir. Kondrositler eklem kıkırdağı (artiküler kıkırdak), kulak kıkırdağı (auriküler kıkırdak), kostal ve nasoseptal bölgelerden elde edilebilmektedir. Fakat kondrositler in vitro tek tabak kültürde, in vivo implantasyonda geri farklılaşmaya uğrayabilmekte yani karakteristik morfolojik özelliklerini kaybedebilmekte ve iğ şeklindeki fibroblast-benzeri hücrelere dönüşerek ağsı (fibröz) kıkırdak oluşturabilmektedir (Giannoni ve Cancedda 2006). Bunun yanı sıra kondrositler sınırlı çoğalma kapasitesine sahiptir. Bu nedenle diğer hücre kaynaklarının kullanımı araştırılmaktadır (Kessler ve Grande 2008). Fibroblastlar 39

53 kolayca yüksek miktarlarda elde edilebilmekte ve uygun koşullar altında kondrojenik fenotipe yönlendirilebilmektedir (French vd. 2004). Son dönemlerde kıkırdak doku mühendisliğinde kök hücreler otolog hücrelere alternatif olmaktadırlar. Doku mühendisliğinde kullanılacak hücreler sayısız bölünebilme yeteneğine sahip olmalıdır. Bu nedenle doku mühendisliğinde kullanılan bir diğer hücre türü de kök hücrelerdir. Kök hücreler kültür ortamında bölünme yetisine sahip farklılaşmamış hücrelerdir. Yetişkin ve embriyonik kök hücreler olmak üzere ikiye ayrılır. Yetişkin kök hücreler multipotenttir yani birden fazla farklı hücre veya doku tipine dönüşebilmektedirler. Embriyonik hücrelere göre biraz daha özelleşmiş olan bu hücreler ilgili organdaki her hücre tipine dönüşebilir. Göbek kordonu kanı/dokusu, beyin, kan, kornea, retina, kalp, yağ, deri, cilt, kemik iliği, iskelet kası, kan damarlarından elde edilebilmektedir. Kemik iliği stromasının multipotent öncül hücreler içerdiği bilinmektedir. Burada yer alan mezenkimal kök hücreler uygun mikroçevrede osteosit, kondrosit, adiposit veya miyosit gibi farklı hücrelere dönüşebilmektedir. Mezenkimal kök hücreler doku kültüründe hızlı çoğalabildikleri için daha az sayıda hücre yeterli olmaktadır. Kemik iliğinin elde edilmesi göreceli olarak daha kolaydır. Son dönemlerde ise adipoz dokusu kök hücre kaynağı olarak kullanılmaya başlamıştır (Zuk vd. 2001). Kıkırdak tamiri için kök hücrelerin elde edildiği dokulara kas (Adachi vd. 2002), sinovyum (Sakaguchi vd. 2005) ve periostu (Fukumoto 2003) örnek verebiliriz. Embriyonik kök hücreler, blastosist evresindeki embriyonun iç hücre kitlesinden elde edilen pluripotent hücrelerdir (Şekil 2.16). Pluripotent olmalarından dolayı gerekli ortam sağlandığında yaklaşık 200 hücre türüne dönüşebilmektedirler. Ancak tek başına tüm organizmayı oluşturamazlar. Vücuttaki herhangi bir farklılaşmış hücreyi oluşturma yeteneğindedirler. EKH ler, çekirdeği çıkartılmış bir ovumla kaynaştırılarak elde edilmiş olan (klonlanmış) bir embriyodan da elde edilebilir. Embriyonik kök hücreden elde edilen hücre kümeleri embriyoid cisimcikler olarak adlandırılmaktadır. Bunlar 40

54 plasenta dışında, ektoderm, mezoderm ve endoderm tabakalarından köken alan çeşitli hücre tiplerine farklılaşabilir. Ancak in vivo da farklılaşmalarının kontrolü oldukça zor olduğundan istenmeyen hücre tipine de dönüşebilmektedirler. Kullanımları etik, yasal ve finansal açıdan şüphelidir (Chung ve Burdick 2008). Şekil 2.16 Embriyonik kök hücreler ( 41

55 2.5.5 Hücre kültür yöntemleri İskelelere ekilmiş hücrelerin in vitro kültivasyonu için değişik yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemler arasında statik petri kapları, dinamik döner kap reaktörler, akış perfüzyon sistemleri ve döner duvarlı biyoreaktörleri sayılabilir. Statik kültür, doku mühendisliğinin erken zamanlarında sıkça kullanılan bir yöntem olmasına karşın besinlerin, büyüme faktörlerin ve gazların taşınmasında yetersizdir. Biyoreaktörler ise kendilerine özgü akış şekilleri ve bu akıştan kaynaklanan kontrol edilebilen belli seviyedeki bir mekanik uyarıya sahiptir. Ancak reaktörlerin temel avantajları besin ve atıkların taşınmalarını kolaylaştırmalarından kaynaklanmaktadır. Biyoreaktörlerden; mekansal olarak homojen bir hücre dağılımı sağlaması, istenilen konsantrasyonda gaz sağlaması, besin ve atıkların taşınmasını kolaylaştırması ve iskele yapısını mekanik bir uyarıya maruz bırakması gibi fonksiyonlardan en az birini yerine getirmesi beklenir (Vunjak-Novakovic, vd. 1998, Bancroft vd. 2003) Döner kap biyoreaktörleri Bu tür sistemlerde hücre ekilmiş iskeleler bir iğneye bağlanır ve döner kabın tıpasından asılır (Şekil 2.17). Kap içerisindeki besiyeri manyetik bir karıştırıcı tarafından karıştırılır. Besiyeri gerekli besin konsantrasyonunu korumak amacıyla birkaç günde bir değiştirilir (Wu vd. 1999). 42

56 Şekil 2.17 Döner kap biyoreaktörü. İskeleler manyetik bir karıştırıcı tarafından karıştırılan besiyeri içerisinde asılı olarak bulunmaktadır (Partap vd.2010 dan değiştirilerek alınmıştır) Döner duvarlı biyoreaktörler Bu biyoreaktör çeşidi NASA tarafından geliştirilmiştir (Schwarz vd. 1992). Reaktör Silindirik bir hazneden oluşan reaktörde iskeleler bir tüp içerisinde serbest olarak bulunur (Şekil 2.18). Bu hazne belirli açısal hızlarda dönebilen iç ve dış duvarlara sahiptir. Hazne duvar aşağıya doğru olan yerçekimi kuvveti ve her iskele üzerindeki yukarı doğru olan hidrodinamik sürtünme kuvveti arasında bir dengeye ulaşılan bir hızda döner. Kuvvetler arasındaki denge neticesinde iskeleler besiyeri içerisinde asılı kalır. Besiyeri döndürme işleminin durdurulması ve bir pompa vasıtasıyla sıvı değişiminin yapılmasıyla gerçekleştirilir. 43

57 Şekil 2.18 Döner duvarlı biyoreaktör sistemi (Partap vd dan değiştirilerek alınmıştır) Akış perfüzyon biyoreaktörleri Bu sistemde iskelelerin tutulduğu hazne bir peristaltik pompa ile bağlantılıdır (Şekil 2.19).. Peristaltik pompa taze ve kullanılmış besiyerinin değişimini gerçekleştirir. Perfüzyon sistemlerin kullanıldığı biyoreaktörler iskele içerisinde daha homojen bir hücre dağılımı sağlamaktadır. Şekil 2.19 Akış perfüzyon biyoreaktörü. Bir pompa vasıtasıyla besiyerinin iskeleden geçmesi sağlanır (Partap vd dan değiştirilerek alınmıştır) 44

58 2.5.5 Uyarıcı faktörler Doku mühendisliğinin bir diğer bileşeni uyarıcı faktörler olup kıkırdak oluşumunun uyarılması, hızlandırılması ya da arttırılması amacıyla kullanılmaktadırlar. Uyarıcı faktörlere gen tedavisi, mekanik sinyaller, büyüme faktörleri ve diğer katkı maddelerini saymak mümkündür. Gen tedavisi ile hücrelerin istenilen biyoaktif molekülleri daha fazla eksprese etmeleri sağlanabilmektedir. Hidrostatik basınç, dinamik sıkıştırma ya da daha önce verilen biyoreaktörler ile sağlanan mekanik sinyaller de kıkırdak doku mühendisliğinde kullanılmaktadır. Çünkü pek çok kıkırdak türünde sağlıklı fonksiyonun devam ettirilmesi için mekanik kuvvet gereklidir. Bu nedenle de hücrelerin farklılaşması ve doku üretimi için bu yaklaşım kullanılmaktadır. Büyüme faktörleri (BMPs, FGF-2, IGF-1, TGF-β vs.) ve diğer katkı maddeleri (hiyalüronik asit, kondroitin sülfat, insülin vb.) in vitro da besiyerine ilave edilerek, in vivo da ise iskelelere bağlanarak hücrelerin farklılaşması ve doku gelişimi kontrol edilmektedir (Chung ve Burdick 2008). Bu kısımda büyüme faktörlerinden kısaca bahsedilecektir Büyüme faktörleri Büyüme faktörleri in vitro ve in vivo da doku gelişimi ve rejenerasyonunu uyaran biyoaktif moleküllerdir. TGF-β süper ailesi insülin benzeri büyüme faktörü (IGF), fibroblast büyüme faktörü (FGF), platelet kökenli büyüme faktörü (PDGF), epidermal büyüme faktörü (EGF) ve kemik morfogenetik faktörü (BMP) gibi sinyal moleküllerini içerir. Bu moleküller hücre büyümesi, farklılaşması, hücredışı matriks üretimi, doku özelleşmesi gibi çeşitli hücresel süreçlerde etkilidir (Kingsley 1994, Ganan vd. 1996). BMPler (özellikle BMP -4, -6, ve -7) kondrojenik bir etkiye sahiptir. Kollajen tip II ve proteoglikan üretimini arttırırlar (Sekiya vd. 2001, Miljkovic vd. 2008). Fibroblast büyüme faktörü (FGF) ailesi 22 üyeden oluşur. FGF-2 hücre çoğalması ve kondrojenik farklılaşmayı uyarır (Cuevas vd. 1988). Platelet-kökenli büyüme faktörü platetlerin α- salgı granüllerinden salgılanır. Mezenkimal kök hücre farklılaşması ve hücredışı matriks üretimi için anahtar bir up-regülatördür (Haleem ve Chu 2010). 45

59 TGF-β ailesi mezenkimal kök hücrelerin kondrojenik ve osteojenik farklılaşmasını yönlendirir, miyogenez ve adipogenezi inhibe eder (Kingsley 1994). TGF-β ailesi, gelişimi çok yönlü kontrol eden hücredışısal büyüme faktörlerindendir. Çok sayıda birbirine benzer polipeptid büyüme faktörlerinden oluşan TGF-β ailesi, hücre büyümesi ve çoğalması, hücre farklılaşması, hücredışı matriks üretimi, anjiyogenez, doku onarımı, immün düzenleme, apoptosis gibi hücresel süreçlerde görev alırlar. Kıkırdak dokusunda bu uyarıcı moleküllerin bağlanarak fonksiyonlarını yapabilmesi ve matriks içerisinde depolanabilmesi için özel bölgeler vardır. TGF-β1 mezenkimal hücrelerin çoğalmasını ve kondrojenik farklılaşmasını, hücredışı matriks üretimini uyarır (Cassiede vd. 1996, Pagnotto vd. 2007). TGFβ sinyal yolağı, yetişkin organizmada ve embriyonik dönemde hücre büyümesi, farklılaşması, apoptosiz (programlı hücre ölümü), hücresel hemeostasiz ve diğer hücresel fonksiyonlarda görev alır. TGFβ ailesi ligandları serin/treonin protein kinaz tipi reseptörlere bağlanır (Şekil 2.20). TGFβ molekülünün bir tip II reseptöre bağlanması sonucu Tip II, Tip I reseptörü fosforile eder. Tip I, reseptör-kontrollü SMAD ı fosforiller. Fosforillenen RSMAD (SMAD 2 ya da 3) reseptörden ayrılır ve cosmad a bağlanır (SMAD4). R-SMAD/coSMAD oligomerleri transkripsiyon faktörleri olarak görev alacakları nükleus da birikir ve hedef genin ifadesinin kontrolünde düzenleyici olarak görev alırlar (Miyazono 2000). SMAD lar, hücre çekirdeği içine sinyal taşıyan ve DNA ya bağlanarak transkripsiyonel kompleks oluşturan orijinal bir protein ailesidir. Bu kompleksler çekirdek içinde yalnız veya DNA-bağlanma alt birimi ile birleşik halde bulunabilir ve spesifik promotor elemanlarına bağlanarak hedef genleri aktive ederler. 46

60 Şekil 2.20 TGFβ sinyal yolağı TGFβ süper ailesi üyeleri bir tip II reseptöre bağlanır. Bu bağlanma tip I reseptörü aktive eder. tip I reseptörün aktivasyonu ise RSMAD moleküllerinin fosforillenmesine yol açar. RSMAD Co-SMAD a bağlanır, oluşan kompleks çekirdeğe geçerek burada hedef gende transkripsiyon faktörleri olarak görev yaparlar 47

61 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1 Madde ve Malzeme İskelelerin hazırlanmasında hiyalüronik asit (Sigma, St. Louis, MO), kitosan (orta moleküler ağırlıklı, Mw ~ , %85 deasetilasyon, Fluka, ABD) ve elastin (Sigma) polimerleri kullanılmıştır. Hazırlanan polimer çözeltilerinin liyofilizasyonu için liyofilizatör (Christ Alpha 1-4 LD Plus, Almanya) kullanıldı. HA-C iskeleler NH 4 OH/metanol çözeltisi kullanılarak nötralize edilmiştir. HA-E iskeleler ise adipik asit dihidrazit (ADH) (Sigma) ve N-Etil-N -(3-dimetilaminopropil) karbodiimit hidroklorür, (EDAC ya da EDC hidroklorür) (Fluka) kullanılarak çapraz bağlandı. Hücre ekimi öncesinde iskeleler etanol içerisinden bekletilmek suretiyle steril edildi. Hücre kültürü çalışmalarında hücreler steril doku kültür kaplarında (Corning, NY, ABD), besiyeri α-mem (Modified Eagle s Medium) (Sigma) ve DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium) (Sigma), besiyeri katkısı olarak L-glutamin, penisilinstreptomisin (antibiyotik-antimikotik), askorbik asit (Sigma), deksametazon (Sigma), elzem olmayan amino asitler (Sigma), insülin-transferrin-selenöz asit (BD, Bioscience) fetal sığır serumu (FBS) (Sigma), tuzlu fosfat tamponu (PBS) (Sigma) ve hücrelerin pasajlanmasında tripsin/edta (Etilen diamin tetra asetik asit) çözeltisi (Sigma) kullanıldı. Kondrojenik indüksiyon için TGF-β1 (Sigma) kullanıldı. Çalışmalar laminer akışlı steril kabinde (Nuaire, Class II, Plymouth, Minnesota, ABD) yapılmış olup hücre kültürleri 37 C, % 5 CO 2, % 95 nem ortamını sağlayan bir karbondioksitli inkübatörde (Heracell 240, Waltham, Massachusetts, ABD) gerçekleştirildi. Işık mikroskopisi çalışmalarında örneklerin tespiti için ph 7,4 e tamponlanmış % 10 luk formalin çözeltisi kullanıldı. Histolojik çalışmalar için hematoksilin-eosin 48

62 (H&E), alsiyan mavisi (Sigma) boyaları kullanıldı. İmmünohistokimya çalışmaları için primer olarak monoklonal anti-agrekan antikoru kullanıldı. 3.2 Hiyalüronik asit-kitosan (HA-C) İskelelerin Hazırlanması Hiyalüronik asit-kitosan (HA-C) iskeleler polielektrolit komplekslerin oluşumundan kaçınarak liyofilizasyon yöntemi ile hazırlandı (Peniche vd. 2007). Kısaca, Hiyalüronik asitin (HA) % 1 lik (w/v) çözeltisi suda, kitosanın % 1 lik (w/v) çözeltisi ise %1 lik asetik asit içerisinde hazırlandı. Daha sonra negatif yüklü hiyalüronik asit ve pozitif yüklü kitosan çözeltisine değişik oranlarda ilave edilerek 1 saat boyunca karıştırıldı. Oluşan çökelti edilen 5000 rpm de yapılan santrifüjleme ile çözeltiden ayrıldı. Çökelti üzerine 0,66 M NaCl çözeltisi ilave edilip 0,1 N HCl kullanılarak çözelti ph ı yaklaşık 1 e getirilip ve polimer çözeltisi 1 gece boyunca manyetik karıştırıcıda karıştırılmak suretiyle çözünür hale getirildi. Tamamen homojen hale gelen HA ve C içeren polimer çözeltisi daha sonra liyofilize edilmek üzere 35 C da donduruldu. In vitro ve in vivo deneylerde kullanılacak olan liyofilize iskelelerdeki NaCl ü uzaklaştırmak için, iskeleler 70:30 etanol-su karışımında belirli sürelerde bekletildi. Daha sonra ise amonyum hidroksit in metanol içerisindeki çözeltisinde (% 10 luk (v/v)) 30 dakika bekletilmek suretiyle iskeleler nötralleştirildi. 49

63 3.3 Hiyalüronik asit-elastin (HA-El) İskelelerin Hazırlanması HA-El iskeleler suda hazırlanan %1 lik hiyalüronik asit ve %1 lik elastin çözeltilerinin karıştırılması ve karışımın dondurularak kurutulmasıyla elde edildi. HA çözeltisi ile elastin çözeltisi eşit oranda karıştırıldı ve son karışım tamamen homojen oluncaya kadar karıştırma işlemine devam edildi. HA-El polimer karışımı 35 C da donduruldu ve daha sonra liyofilize edildi (Şekil 3.1).. Elde edilen iskeleler için uygun çapraz bağlama yönteminin belirlenmesi için bir seri çapraz bağlama denemesi yapıldı. Şekil 3.1 HA-El iskelelerin hazırlanmasının şematik gösterimi 50

64 3.4 HA-C ve HA-El İskelelerin SEM analizi Hiyalüronik asit-kitosan (HA-C) ve hiyalüronik asit-elastin (HA-El) iskelelerin morfolojisi Taramalı Elektron Mikroskopisi (SEM) ile analiz edildi. SEM incelemeleri için örnekler sodyum kakodilat tamponunda (ph 7,4) hazırlanmış % 10 luk glutaraldehit ile tespit edildi. Tespit işleminin ardından örnekler fiksatifi ve diğer kirlilikleri uzaklaştırmak amacıyla PBS ile yıkandı. Yıkama işleminin ardından örnekler etanol serilerinden (%50, %70, %80, %90 ve %95) geçirilerek dehidrate edildi. Hazırlanan iskele örnekleri ince bir altın tabakası ile kaplandı ve Jeol-model (Tokyo, Japan) Taramalı Elektron Mikroskopu altında yüzeyin direkt analizi yapıldı. 3.5 HA-C ve HA-El İskelelerin FTIR Analizi HA, C polimer ile HA-C iskele örnekleri ile HA, El polimerleri ve HA-El iskele örnekleri vakum altında bir gece kurutuldu. ATR-FTIR spektrum ölçümleri Perkin Elmer-Spectrum 100 model cihazı (Waltham, MA, U.S.A.) kullanılarak gerçekleştirildi. Örnek ATR kristal yüzeyine yerleştirildi ve üzerine bir basınç uygulandı. Spektrumlar cm -1 aralığında ölçüldü. 3.6 Hiyalüronik asit-kitosan (HA-C) ve Hiyalüronik asit-elastin (HA-El) İskelelerin Su Tutma Kapasitelerinin Tayini Hiyalüronik asit-kitosan (HA-C) kompozit iskelelerin su tutma kapasiteleri hiyalüronik asit (HA) ve Kitosan (C) iskelelerle, hiyalüronik asit-elastin (HA-El) kompozit iskelelerin su tutma kapasiteleri ise hiyalüronik asit (HA) iskeleler ile karşılaştırmalı olarak olarak analiz edildi. Bunun için çapraz bağlanmış iskelelerin kuru kütleleri ölçüldü ve iskeleler PBS (ph 7,4; 0.1 M) içerisinde 37 C da 48 saat süresince inkübe edildi. Su tutma miktarını belirlemek amacıyla belirli zaman noktalarında (1., 4., 24. ve 48. saatlerde) ıslak kütle ölçümü yapıldı. Islak kütleyi belirlemek için tartım yapılmadan önce iskelelerin yüzeyinde adsorplanmış su, süzgeç kağıdına emdirilerek uzaklaştırıldı. 51

65 Su absorpsiyonundan kaynaklanan kütle artışı yüzdesi aşağıdaki formüle göre hesaplandı. E ş = [(W w -W d ) \ Wd] x100 Formülde E ş şişme oranı, W w ve W d sırayla iskelelerin ıslak ve kuru kütleleridir. 3.7 Hiyalüronik asit-kitosan (HA-C) ve Hiyalüronik asit-elastin (HA-El) İskelelerin In Vitro Kütle Kaybı Tayini Hiyalüronik asit-kitosan (HA-C) kompozit iskelelerin in vitro da kütle kaybı analizi hiyalüronik asit (HA) ve Kitosan (C) iskelelerle, hiyalüronik asit-elastin (HA-El) kompozit iskelelerin ise hiyalüronik asit (HA) iskeleler ile karşılaştırmalı olarak in vitro da iskelelerin % 0.1 Sodyum azit içeren PBS (ph 7,4) içerisinde inkübasyonu ile gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla öncelikle iskelelerin çapraz bağlanma sonrası ıslak kütleleri ölçüldü. Ardından iskeleler PBS (ph 7,4; 0.1M) içerisinde 37ºC da inkübe edildi. Hidrate iskelelerin bozunma (degradasyon) miktarı HA-C iskeleler için 16 haftalık bir süre içerisinde belirli zaman noktalarında (14., 28., 42., 56., 70., 84., 98. ve 112. günlerde), HA-El iskeleler için 9 haftalık bir süre içerisinde belirli zaman noktalarında (14., 28., 42., 56 ve 70. gün) alınan örneklerin kütlelerinin tartılması ile belirlendi. İskelelerin bozunma oranı (D) ise aşağıdaki formülle belirlendi. D =(W o -W t ) \W o x 100 Formülde Wo başlangıçtaki kütleyi gösterirken, Wt ise t anındaki kütleyi göstermektedir. Şişme ve degradasyon deneyleri her iskele için 2 kez tekrarlandı. 52

66 3.8 In Vitro Hücre Kültürü ve Kondrojenik İndüksiyon Çalışmaları Çalışmanın bu aşamasında HA-C iskelelere sıçan artiküler kıkırdak hücreleri ile sıçan kemik iliği mezenkimal kök hücreleri, HA-El iskelelere ise sıçan kemik iliği mezenkimal kök hücreleri ekilip, bu hücrelerin kondrojenik farklılaşma potansiyelleri araştırıldı Sıçan artiküler kıkırdak hücrelerinin HA-C iskelelere tohumlanması ve kondrojenik farklılaşması Genç yaştaki (6 haftalık) wistar sıçanının diz ekleminden elde edilen kıkırdak dokusu, kollejenaz (1 mg/ml) ve hiyalüronidaz ( 0.1 mg/ml) içeren enzim çözeltisinde, inkübatör (37 o C da, % 5 CO 2, %95 hava, %90 ortamda) içerisine yerleştirilmiş bir aksiyal karıştırıcı üzerinde 1 gece boyunca tutuldu. Sürenin sonunda doku karışımı pipetleme ile karıştırılıp ve 10 dk boyunca 1000 rpm hızla santrifüj edildi. Süpernatant atıldı. Pellet üzerine enzimi inaktive etmek için % 20 fetal sığır serumu ilave edilerek santrifüj işlemi tekrar edildi. Bu şekilde yapılan iki yıkamanın ardından hücreler % 20 serum, 10-7 M deksametazon, % 1 insulin transferrin selenöz asit (ITS), askorbik asit (50µg/ml), elzem olmayan aminoasit, L-glutamin, serum ve 100 U/ml penisilin, 100 µg/m1 streptomisin içeren DMEM içeren vasata alındı ve T75 kültür kabında yeterli bolluğa ulaşıncaya dek kültüre edildi. Hücreler kültür petrilerinin yüzeyini tamamen kapladığında tripsinizasyon ile pasajlandı. Bu amaçla, %0,25 tripsin ve 1 mm EDTA içeren çözelti kullanılarak hücreler kap yüzeyinden enzimatik olarak kaldırıldı (tripsinleme) ve pasajlama işlemi yapıldı. 3. pasajdaki hücreler yeterli bolluğa ulaştığında ise yine tripsinizasyonla kap yüzeyinden alındı ve elde edilen hücre süspansiyonu iskelelere hücre tohumlamasında kullanıldı. Bir gece önceden %70 lik etanol içerisinde bekletilen iskeleler (0,5x0,5 cm boyutlarında) steril gazlı bez yardımıyla mümkün olduğunca kurutularak 12 kuyucuklu kültür kabına alındı. Her bir iskele üzerine 100 µl hücre süspansiyonu (67.0 x10 5 hücre) yavaş yavaş ilave edildi. İskeleler hücresel adezyonun gerçekleşmesi için 1,5 saat karbondioksit inkübatör içerisinde aksiyel karıştırıcıda bekletildi. Hücre ekilmiş 53

67 iskeleler 10-7 M deksametazon, % 1 insulin transferrin selenöz asit (ITS), askorbik asit (50µg/ml), elzem olmayan aminoasitler, L-glutamin, 100 U/ml penisilin, 100 µg/m1 streptomisin, %10 fetal sığır serumu ve 10 ng/ml TGF-β1 içeren DMEM çerisinde kültüre edildi. Belirli zaman noktalarında (7, 14, 21 ve 28. günler) alınan örneklerin morfolojileri için SEM analizi gerçekleştirildi. Ayrıca örnekler histolojik (HE) ve immünhistokimyasal (anti-agrekan) olarak da analiz edildi Sıçan kemik iliği mezenkimal hücrelerinin HA-C iskelelere tohumlanması ve kondrojenik farklılaşması Sıçan kemik iliği mezenkimal hücrelerinin izolasyonu Kemik iliği mezenkimal hücreleri, g ağırlığındaki 12 haftalık erkek Wistar sıçanların femurlarından izole edildi. Kemiğin iki ucu kesildi ve α-mem içeren bir şırınga vasıtasıyla kemik iliği falkon tüpe alındı. Tüp içeriği santrifüj edildi (1100 rpm, 7 dk), süpernatant atıldı. Santrifüj işlemi bir kez daha tekrarlandı. Yeniden süspanse edilen hücreler 75 cm 2 lik doku kabına (T75) aktarıldı ve 37 o C da, % 5 CO 2, %95 hava, %90 nem içeren ortam şartlarında inkübe edildi. Üçüncü günde yapışmayan hücreler besiyeri değiştirilerek uzaklaştırıldı. Mezenkimal hücreler %10 fetal sığır serumu, 100 µl/ml penisilin-streptomisin, 2mM L-glutamin içeren α-mem besiyerinde 3 günde bir vasat değişimi yapılarak kültüre edildi. Hücreler kültür petrilerinin yüzeyini tamamen kapladığında tripsinizasyon ile pasajlandı. Bu amaçla, %0,25 tripsin ve 1 mm EDTA içeren çözelti kullanılarak hücreler kap yüzeyinden enzimatik olarak kaldırıldı (tripsinleme) ve pasajlama işlemi yapıldı. 2. pasajdaki hücreler yeterli bolluğa ulaştığında ise yine tripsinizasyonla kap yüzeyinden alındı ve elde edilen hücre süspansiyonu iskelelere hücre tohumlamasında kullanıldı. MKH ler sıçan kemik iliğinden laboratuarımızda rutin olarak kullanılan yöntemlerle izole edilip işlenmiştir. Bu yöntemle izole edilen hücrelerin dört nesile (adiposit, kardiyomiyosit, kondrosit ve osteosit hücrelerine) farklılaşma kapasiteleri oldukları gösterilmiştir (Çelebi vd. 2010). 54

68 Kemik iliği mezenkimal kök hücrelerin HA-C iskelelere tohumlanması ve kondrojenik farklılaşması Tohumlama işleminden önce 0,5x0,5 cm boyutlarında ve küp şeklinde kesilen HA-C iskeleler 1 gece % 70 lik etanolde bekletildi. Daha sonra sırasıyla PBS ve hücresel tutunmayı arttırılması için % 20 serum içeren besiyeri ile muamele edildi. Belirli bir pasaja (P2) kadar çoğaltılan hücreler, tripsine edilerek T75 kaplarından alındı ve hücre sayımı yapıldı. İskeleler steril gazlı bez yardımıyla mümkün olduğunca kurutularak 12 kuyucuklu kültür kabına alındı. Her bir iskele üzerine 100 µl hücre süspansiyonu (8,5x10 5 hücre/iskele) yavaş yavaş ilave edildi. İskeleler hücresel adezyonun gerçekleşmesi için 1,5 saat karbondioksit inkübatör içerisinde aksiyel karıştırıcıda bekletildi. Bekleme süresinin sonunda iskelelere % 10 serum içeren besiyeri ilave edildi. Hücre ekiminden 7 gün sonra 10-7 M deksametazon, % 1 insulin transferrin selenöz asit (ITS), askorbik asit (50µg/ml), elzem olmayan aminoasit, L-glutamin, 100 U/ml penisilin, 100 µg/m1 streptomisin, %10 fetal sığır serumu ve 10 ng/ml TGF-β1 içeren DMEM den oluşan kondrojenik vasat verilmeye başlandı. Mezenkimal hücrelerin kondrojenik farklılaşmasını uyarmak için TGF-β1 kullanılan bu çalışmada kondrojenik indüksiyon süresince belirli zaman noktalarında (7, 14, 21 ve 28. günler) alınan örnekler histokimyasal (Hematoksilin-eosin, Alsiyan Mavisi) ve immünhistokimyasal (anti agrekan boyaması) olarak analiz edildi MTT [3-(4,5-dimetildiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür] analizi HA-C iskelelerindeki hücre yaşayabilirliği ve çoğalmasına uygunluğu hücre kültürünün 7, 14, 21 ve 28. günlerinde yapılan MTT [3-(4,5-dimetildiyazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolyum bromür] testi ile belirlendi (Mossman 1983) (Şekil 3.2). Bu amaçla, kemik iliği mezenkimal hücre ekilmiş olan HA-C iskeleler 48 kuyucuklu kültür kabına alındı ve üzerine 270 µl serumsuz besiyeri ve ardından da 30 µl MTT çözeltisi ilave edilerek 4 saat süresince 37 C da %5 CO 2 inkübatörde inkübe edildi. Dört saatin sonunda besiyeri ortamdan uzaklaştırıldı ve oluşan formazan kristallerinin fotoğrafları çekildi. Hücre çoğalmasının kantitatif tayini için örnek üzerine, 300 µl MTT çözücüsü (izopropanol içerisinde 0,1 N HCl-Sigma) ilave edilerek MTT formazan kristalleri 55

69 çözüldü. Absorbans ölçümü 570 nm de, Shimadzu UV-mini 1240 spektrometre (Tokyo, Japan) kullanılarak gerçekleştirildi. Şekil 3.2 Formazan kristallerinin oluşum reaksiyonu ( Glikozaminoglikan (GAG) Tayini HA-C iskelelere ekilmiş mezenkimal hücrelerin kondrositlere farklılaşmasının tayini için dimetilmetilen mavisi (dimethylmethylene blue; DMMB) boya bağlanma esasına dayalı Blyscan Sülfatlanmış Glukozamin Test Kiti (Biocolor, UK) kullanıldı (Wagner vd. 1998). Bunun için kondrojenik kültür ortamında inkübe edilen hücre-iskele kompozit yapıları belirli zaman noktalarında kantitatif sgag tayini için fikse edildi. İskele-hücre yapıları 64 U/ml papain, 1 ml 0,1 M sodyum asetat (NaAC), 0,01 M L- sistein-hcl, 0,005 M Na 2 EDTA (ph 6,0), 0,2 M NaCl içeren papain tampon çözeltisinde 16 saat süresince ve 65 C da inkübe edilmek suretiyle sindirildi. Elde edilen ekstrakt santrifüjlendi ve süpernatant toplam sülfatlanmış glikozaminoglikan (sgag) içeriğinin tespiti için üreticinin yönergeleri doğrultusunda ölçüldü. Analizde sıçan artiküler kıkırdak dokusu pozitif kontrol olarak kullanıldı. 56

70 3.9 Kemik iliği mezenkimal kök hücrelerin HA-El iskelelere tohumlanması ve kondrojenik farklılaşması HA-El iskelelere tohumlama işlemi daha önce anlatıldığı gibi gerçekleştirildi. Kısaca HA-El iskeleler (0,5x0,5 cm) önce 1 gece etanolde, daha sonra sırasıyla PBS ve % 20 serum içeren besiyeri içerisinde bekletildi. Belirli bir pasaja (P2) kadar çoğaltılan hücreler, tripsine edilerek T75 kaplarından alındı ve hücre sayımının ardından her bir iskele üzerine 100 µl hücre süspansiyonu (1,0x10 6 hücre/iskele) ilave edildi. Hücre ekiminden 7 gün sonra kondrojenik vasat verilmeye başlandı. Çalışmada mezenkimal hücrelerin kondrojenik farklılaşmasını uyarmak için TGF-β1 kullanılmıştır. Kondrojenik indüksiyon süresince belirli zaman noktalarında (7, 14, 21 ve 28. günler) alınan örnekler histolojik olarak (Hematoksilin-eosin, Alsiyan Mavisi) analiz edildi MTT [3-(4,5-dimetildiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür] analizi HA-El iskelelerindeki hücre yaşayabilirliği ve çoğalmasına uygunluğu hücre kültürünün 7, 14, 21 ve 28. günlerinde yapılan MTT [3-(4,5-dimetildiyazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolyum bromür] analizi ile gerçekleştirilmiştir HA-C iskele hücre yapılarının in vivo deneyi Boş ve sıçan kemik iliği mezenkimal kök hücreler (MKH) ekilmiş HA-C iskelelerin doku uyumu ve in vivo bozunma davranışının analizi için iskeleler Wistar sıçanlarına implante edildi. Çalışmada toplamda ağırlıkları g (implantasyon sırasında) arasında değişen 4 Wistar sıçanı kullanıldı. Sıçanlar avertin enjekte edilerek bayıltıldı. Anestezi altında sıçanın abdominal bölgesi tıraşlandı, alkol ve iyot çözeltisi (Wescodyne R ) ile temizlendi. Ardından steril cerrahi aletler kullanılarak sağ ve sol tarafta olmak üzere yaklaşık 2 cm uzunluğunda iki kesi açıldı. Kondrojenik indüksiyonun 7. günündeki HA-C iskele/hücre örnekleri ile hücresiz HA-C iskeleleri (kontrol) sırasıyla sıçanın sol ve sağ epigastrik groin fasiya bölgesinde deri altına aseptik koşullarda yerleştirildi ve kesiler kapatıldı. Hayvanlar numaralandırıldı ve belirli 57

71 zaman noktalarında (7., 14., 28. ve 60. günler) yukarıda anlatıldığı gibi ameliyata hazırlandı. Örneklerin çıkarılmasının ardından sıçanların yaşamlarına son verildi. Örnekler ise PBS ile yıkanıp, standart histolojik analizler % 10 formaldehit içeren 0,1 M PBS içerisinde tespit edildi. Hayvanların kullanıldığı tüm deneysel protokoller uluslararası ve yerel etik kurul komitesinin standartlarına uygun olarak yürütülmüştür Histolojik Analizler Çalışma süresince histolojik analizler için in vitro ve in vivo çalışmalardaki örnekler belirli zaman noktalarında %10 luk formaldehit içeren fosfat tamponunda (ph 7,4, 0.1M) tesbit edildi. Örnekler dondurulup, kesitler alındıktan sonra hematoksilin-eosin (H&E) (Sigma), alsiyan mavisi (Sigma) ile boyanıp Nikon (Japonya) marka ışık mikroskobunda incelendi Hematoksilin-Eosin (H&E) boyaması H&E boyaması aşağıdaki işlemlerin yapılmasıyla gerçekleştirildi. Örnekler önce alkolle ıslatıldı. Ardından hematoksilin çözeltisi ile 5-8 dk muamele edildi. Hematoksilini uzaklaştırmak için alkolle yıkama yapıldı. Eosin ile 30 saniye muamele edildi. Alkolle yapılan yıkamanın ardından örnekler kurumaya bırakıldı. Daha sonra ise ışık mikroskopu altında görüntülendi ve fotoğrafları çekildi Alsiyan mavisi boyaması Alsiyan Mavisi boyaması aşağıdaki işlemlerin yapılmasıyla gerçekleştirildi. Örnekler önce alkolle ıslatıldı. Ardından %1 Alsiyan Mavisi çözeltisi ile 30 saniye muamele edildi. 58

72 0,1 N HCl ile yıkama yapıldı. Örnekler alkol serilerinden geçirelerek dehidrate edildi İmmünhistolojik Analizler Örneklerin immünhistokimyasal boyamaları için kesitler monoklonal anti-agrekan antikoru kullanılarak standart antikor boyama yöntemiyle aşağıdaki basamaklar takip edilerek boyandı. Örnekler PBS ile 5 dk süresince muamele edilerek ıslatıldı. Ardından 10 dk H 2 O 2 ile muamele edildi. PBS ile yıkama yapıldı. Ultra V Block ile 5 dk muamele edildi. PBS ile yıkama yapıldı. Primer antikor ile 60 dk oda sıcaklığında inkübe edildi. PBS ile yıkama yapıldı. Biotinlenmiş keçi anti fare sekonder antikoru ile 10 dk inkübe edildi. PBS ile yıkama yapıldı. Streptavidin-Peroksidaz ile 10 dk inkübe edildi. PBS ile yıkama yapıldı. AEC kromojen-aec substrat karışımı ile 15 dk inkübe edildi. Saf suyla yıkama yapıldı. Boyanmış örnekler ışık mikroskopu altında görüntülendi ve fotoğrafları çekildi. 59

73 4. BULGULAR 4.1 Hiyalüronik asit-kitosan (HA-C) İskelelerin Hazırlanması %1 lik hiyalüronik asit ve %1 lik kitosan çözeltilerinin farklı oranlarda karıştırılmasıyla farklı gözenek boyutlarına sahip iskeleler elde edilmiştir. Çizelge 4.1 de polimerlerin birbirleriyle karıştırıldığı oranlar (elde edilen iskelenin bileşimi) ve bu polimer oranlarının iskele homojenliği üzerine etkisi gösterilmiştir. HA nın kitosana göre düşük miktarda (HA:C; 1:3 ve 1:2) kullanıldığı iskelelerin yüzey özelliklerinin her bölgede aynı olmadığı görülmüştür. Bu gözlemlere dayanarak kompozit iskele üretimi için uygun polimer oranının 1:1olmasına karar verilmiştir (Şekil 4.1). İskele kalınlığı polimer çözeltilerinin hacmi değiştirilmek suretiyle kolayca kontrol edilmektedir. Çizelge 4.1 HA-C iskele yapımında kullanılan polimer oranlarının iskele homojenliği üzerine etkisi Hiyalüronik asit oranı Kitosan oranı İskele homojenliği * *İskele homojenliği: += (% 25), ++= (%25-50) ++++= (%75-100) 60

74 Şekil 4.1 HA-C C iskelelerin makroskopik görüntüsü Liyofilizasyon yöntemiyle hazırlanan HA-C HA iskelelerin morfolojisi taramalı elektron mikroskopisi ile karakterize edilmiştir. Şekil 4.2 de iskelelerin yüzey ve arakesit SEM mikrografları görülmektedir. HA-C HA iskeleler yüksek gözenekliliğe gözenekliliğ sahiptir. Gözenek çapı µm arasında ında değişmektedir. 61

75 Şekil 4.2 HA-C iskelelerin SEM mikrografları 62

76 4.2 HA-El El İskelelerin Hazırlanması A B C Şekil 4.3 HA-El El iskelelerin makroskopik görüntüsü (a) ( ) ve SEM mikrografları (b,c) ( %1 lik HA ve Elastin çözeltilerinin bire bir oranında karıştırılmasıyla hazırlanan HA-El iskelelerin morfolojisi taramalı elektron mikroskopisi ile karakterize edilmiştir. HA-El HA iskeleler ler oldukça gözenekli bir yapıya sahiptir ve gözenek boyutları µm arasında değişmektedir (Şekil 4.3). Dondurarak kurutma yöntemiyle hazırlanan HA-El El iskelelerin etkili olarak çapraz bağlanması için çeşitli yöntemler denendi. denen. Denemelerin ilkinde çapraz bağlayıcı ajan olarak 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) dimetilaminopropil) karbodimit (EDC) EDC) ve N-Hidroksisüksinimit N (NHS) kullanıldı. 33mM EDC ve 6mM 63 NHS 50 mm MES (2-(N-

77 morfolino)ethansülfonik asit) tamponunda çözüldü ve ph 5,5 e ayarlandı. İskeleler EDC-NHS içeren MES tamponunda 8 ve 24 saatlik sürelerde tutuldu. Diğer denemede ise çapraz bağlayıcı ajan olarak EDC ve Adipik asit dihidrazit kullanıldı. 0,12g EDC ve 0,10g ADH %80 lik etanol/su karışımında çözüldü. İskeler çözelti içerisine alındı, ph 4,75 e ayarlandı ve çapraz bağlanma reaksiyonunun gerçekleşmesi için iskeleler değişik sürelerde (8 ve 24 saat) inkübe edildi. Çapraz bağlanan iskeleler PBS (ph7,4 ve 0,1 M) içerisinde 37 C da belirli sürelerde inkübe edilerek iskele dayanıklılığı test edildi. Kullanılan çapraz bağlayıcı tipi ve çapraz bağlama süresinin iskele dayanıklılığı üzerine etkisi çizelge 4.2 de verilmiştir. Çizelge 4.2 Kullanılan çapraz bağlayıcı türü ve çapraz bağlanma süresinin iskele dayanıklılığı üzerine etkisi Çapraz bağlama reaktifi Çapraz bağlama süresi (saat) *İskele dayanıklılığı EDC-NHS 8 + EDC-ADH 8 + EDC-NHS EDC-ADH EDC-ADH *İskele bozunma yüzdesi += (% ), ++= (%50-75) +++= (%25-50) ++++= (%25) 64

78 Hem EDC-NHS hem de EDC-ADH çapraz bağlaması için 8 saatlik çapraz bağlanma süresinin yeterli olmadığı ve çapraz bağlanan iskelelerin ilk 1 saat içerisinde vasat ortamında dağıldığı görüldü. Her ne kadar 24 saatlik çapraz bağlama süresi, 8 saatlik çapraz bağlamaya göre daha fazla stabilite sağlasa da, EDC-NHS çapraz bağlama ajanı istenilen dayanıklılığı sağlayamadı. Buradan hareketle çapraz bağlayıcı olarak EDC- ADH ikilisi seçildi. In vitro kültür ortamında dayanımı daha da arttırmak için çapraz bağlama süresi 48 saate çıkarıldı. EDC-ADH ikilisi kullanılarak yapılan 48 saatlik çapraz bağlama ile kültür ortamında 2 aya kadar neredeyse kütle kaybına uğramadan stabilitesini koruyan iskeleler elde edildi. 4.3 HA-C ve HA-El İskelelerin FTIR Bulguları HA-C iskelelerin FTIR bulguları Şekil 4.4 Hiyalüronik Asit (HA), Kitosan (C) polimerleri ile HA-C iskeleye ait toplu FTIR spektrumları 65

79 Şekil 4.4 te Hiyalüronik asit, kitosan polimerleri ile HA-C iskelelere ait FTIR spektrumları verilmiştir. Yapılarının benzer olmasından dolayı HA ve kitosanın spektrumları büyük benzerlik göstermektedir cm -1 arasındaki geniş band OH gerilme titreşimleri ve kısmen de N-H gerilme (N-asetil kısımdaki) titreşimlerine aittir cm -1 deki C-H gerilme, 1607 cm -1 deki güçlü absorbsiyon bandı HA nın karboksil gruplarından (C=O gerilme) (amid I), 1558 cm -1 deki band ise (N-H) (amid II) eğilme titreşimlerinden kaynaklanmaktadır cm -1 C-O-H eğilme titreşimlerine ait banttır. ~1028 cm -1 karbonhidrat halkasındaki C-O bağına ait gerilme titreşimlerinden kaynaklanmaktadır. Kitosanın karakteristik pikleri; cm -1 OH gruplarının gerilme titreşimi (primer ve sekonder OH), ve N-H gerilme titreşimi (N-asetil zinciri), 2896 cm -1 deki C-H gerilme (C=O), 1648 ve 1594 cm -1, sırayla amid I and II bandlarıdır cm -1 karbonhidrat halkasındaki C-O bağına ait gerilme titreşimleridir cm -1 arasındaki band glukozamine bağlı serbest NH 2 grubuna ait eğilme titreşimidir. HA-C iskelelere ait spektruma bakıldığında hem hiyalüronik asite hem de kitosana ait pikleri görmek mümkündür HA-El iskelelerin FTIR bulguları Şekil 4.5 te HA, El polimerleri ile HA-El iskelelere ait FTIR spektrumları verilmiştir cm -1 arasındaki geniş band OH gerilme titreşimleri ve kısmen de N-H gerilme (N-asetil kısımdaki) titreşimlerine aittir cm -1 deki C-H gerilme, 1607 cm -1 deki güçlü absorbsiyon bandı HA nın karboksil gruplarından (C=O gerilme) (amid I), 1558 cm -1 deki band ise (N-H) (amid II)eğilme titreşimlerinden kaynaklanmaktadır cm -1 C-O-H eğilme titreşimlerine ait banttır. ~1028 cm -1 karbonhidrat halkasındaki C-O bağına ait gerilme titreşimlerinden kaynaklanmaktadır. Elastinin FTIR spektrumunda cm -1 deki bant OH, NH ve CH gruplarına ait titreşimleri içermektedir. Amid I, amid II ve amid III bandlarına ait pikler ise sırasıyla 1644, 1518 ve 1231cm -1 görülmektedir. Amid A bandı 3293 cm -1 de ve 1448 cm -1 de 66

80 ise C=O ya ait titreşim bandı görülmektedir. HA-El kompozit iskeleleri hem hiyalüronik aside hem de elastine ait pikleri göstermektedir. Bu sonuç ise kompozit iskele yapısında HA ve El in bulunduğunu desteklemektedir. Şekil 4.5 Hiyalüronik Asit (HA), Elastin (El) polimerleri ile HA-El iskeleye ait toplu FTIR spektrumları. 67

81 4.4 In Vitro Şişme Oranı ve Biyobozunma Deneyi Hiyalüronik asit (HA), kitosan (C) ve hiyalüronik asit-kitosan (HA-C) iskelelerin su tutma kapasitesi 37 C da PBS de inkübe etmek suretiyle analiz edildi. 48 saatlik inkübasyonun ardından kütle ölçümleri yapıldı. İskelelerin PBS içerisine alınmasının her iskele için ilk 1 saatten itibaren kütle artışına neden olduğu görüldü. HA-C (%120) iskelenin, HA iskeleye (%300) göre daha az, C iskeleye (%110) göre ise daha fazla su tutma kapasitesine sahip olduğu görüldü (Şekil 4.6). şişme yüzdesi zaman (saat) Şekil 4.6 İskelelerin şişme oranları HA ( ), HA-C ( ) ve C ( ) 68

82 Şekil 4.7 İskelelerdeki % kütle kaybının zamanla değişimi: HA ( C ( ) ), HA-C ( ) ve HA, C ve HA-C iskelelerin bozunma davranışları 37 C da PBS de inkübe edilen iskelelerin belirli zaman noktalarında kurutulup tartılmasıyla belirlenmiştir. İskelelerde meydana gelen kütle kaybının zamanla değişimi şekil 4.7 de verilmiştir. Hiyalüronik asit iskeleler hem C hem de HA-C iskelelere göre daha hızlı ve daha fazla madde kaybına uğramaktadırlar. HA-C iskeleler ile C iskeleler in vitro kültür koşullarındaki dayanıklılıkları açısından büyük fark göstermemektedirler. HA-C iskeleler 42. Gün itibariyle % 16,2 ve 70.gün itibariyle ise % 27 lik bir bozunma göstererek kültür ortamında iyi bir dayanıma sahip olduğunu göstermiştir. HA ve HA-El iskelelerin bozunma davranışları da 37 C da PBS de inkübe edilen iskelelerin belirli zaman noktalarında kurutulup tartılmasıyla belirlenmiştir. İskelelerde meydana gelen kütle kaybının zamanla değişimi şekil 4.8 de verilmiştir. HA-El iskele (% 13,5) kültürün 28.gününde HA iskeleye (% 32,4) göre daha düşük bir kütle kaybı göstermiştir. HA-El iskele başlangıç kütlesinin yarısını 60. günde kaybetmiştir. Ancak burada da sadece HA dan oluşan iskelenin kütle kaybı yüzdesi HA-El kompozit iskeleden daha yüksektir. Bu durum hiyalüronik asitin yüksek hidrofilliğine bağlanabilir. 69

83 Kütle kaybı (%) zaman (günler) Şekil 4.8 HA ( ), ve HA-El ( ) iskelelerdeki % kütle kaybının zamanla değişimi HA, HA-C ve HA-El iskelelerinin su tutma kapasiteleri çalışmanın bu kısmında karşılaştırılmıştır. Her üç iskele de belirli oranda kütle artışı meydana gelmiştir. Ancak en büyük artışı HA iskele göstermiştir (%300). HA-C ve HA-El iskeleler ise sırasıyla % 120 ve 68 lik kütle artışı oranları göstermiştir (Şekil 4.9). Şişme Oranı HA HA-C HA-El iskele türü Şekil 4.9 HA, HA-C ve HA-El iskelelerin su tutma oranları 70

84 4.5 Hiyalüronik Asit-Kitosan (HA-C) İskelelere Sıçan Artiküler Kondrosit Tohumlanması ve Kondrojenik İndüksiyon In vitro çalışmaların ilk aşamasında HA-C iskelelerin biyolojik davranışlarının tayini için ilk olarak artiküler kondrositler kullanılmıştır. Kondrosit ekilmiş HA-C iskelelere ait SEM görüntüleri hücrelerin iskelelere yapıştığını ve yuvarlak kondrosit morfolojilerini kültür süresince koruduklarını göstermektedir (Şekil 4.10). A B Şekil 4.10.a,b Kondrosit tohumlanmış HA-C iskelelerin 26.gün SEM mikrografları In vitro kültürün belirli zaman noktalarında alınan örneklerin histolojik olarak analizi için Hemotoksilin-Eosin ve Alsiyan Mavisi boyamaları gerçekleştirilmiştir. Boyamalar HA-C iskelelere ekilmiş olan kondrositlerin kondrojenik kültür ortamında geri farklılaşmaya uğramadan kondrojenik morfolojilerini koruduklarını göstermiştir. 26. ve 32. güne ait boyamalar hücrelerin kondrosit fenotipini sürdürdüklerini ve zengin bir hücredışı matriks ile çevrili olarak kıkırdağımsı bir doku oluşturduklarını göstermiştir (Şekil 4.11.a,b,c,d). Ayrıca monoklonal antikor agrekan kullanılarak yapılan immünhistokimyasal analizlerdeki pozitif agrekan boyaması da kondrositlerin kondrojenik özelliklerini kaybetmeyerek proteoglikan sentezlemeye devam ettiklerini göstermiştir (Şekil 4.11.e). 71

85 A B C D E Şekil 4.11.a,b. Kondrosit tohumlanmış HA-C iskelelerin 26. ve c,d. 32.gün Hematoksilin-Eosin boyamaları ve e. 26.günde agrekan için yapılan IHC boyamaları (ölçü çubukları: 100 µm) 72

86 4.6 Hiyalüronik Asit-Kitosan (HA-C) İskelelere Ekilmiş Sıçan Mezenkimal Hücrelerinin Kondrojenik Farklılaşması Kondrojenik indüksiyon süresince belirli zaman noktalarında alınan örneklerin histolojik olarak analizi için Hematoksilin-Eosin ve Alsiyan Mavisi boyamaları gerçekleştirilmiştir. Kesitlerin histolojik incelemesi, HA-C iskelelere ekilmiş olan MKH lerin TGF-β1 içeren kondrojenik kültür ortamında kondrojenik farklılaşmaya uğradığını göstermiştir. 21. güne ait histolojik boyamalardan görüldüğü üzere hücreler iskele yapısında homojen olarak dağılmıştır. Büyük, yuvarlak ve kondrosit morfolojisine uygun hücrelerin zengin bir ekstaraselüler matriks ile çevrili olarak bulunduğu görülmektedir (Şekil 4.12.a,b). Benzer şekilde Alsiyan mavisi boyamaları da H&E boyamasını destekler biçimde sonuç vermiş olup; pozitif Alsiyan boyaması iskele yapısındaki proteoglikan yapılarını göstermektedir (Şekil 4.12.c,d). Ayrıca örneklerin immünhistolojik incelemesi için yapılan agrekan boyamasının pozitif olması HA-C iskelelere ekilen MKH lerin TGF-β1 içeren kondrojenik kültür ortamında kondrojenik farklılaşmaya uğradığını göstermektedir. Örneklerde dikkate değer miktarda ve homojen bir agrekan birikimine rastlanmıştır (Şekil 4.12.e). 73

87 A B C D E Şekil 4.12 a,b.sıçan MKH leri tohumlanmış HA-C iskelelerin kondrojenik farklılaşmanın 21.günündeki Hematoksilin-Eosin, c,d. Alsiyan mavisi ve e. agrekan için yapılan IHC boyamaları (ölçü çubukları: 100 µm) 74

88 In vitro kültürün belirli aşamalarında çekilen faz kontrast görüntüleri de iskelelere ekilen mezenkimal nkimal kök hücrelerin kondrojenik farklılaşmaya uğradıklarını ve kazandıkları yuvarlak kondrositik morfolojilerini kültür süresince koruduklarını göstermektedir (Şekil 4.13). Şekil 4.13 a. Sıçan MSC leri tohumlanmış HA-C HA C iskelelerin in vitro kondrojenik farklılaşmanın rklılaşmanın 7. ve b,c. 21. günlerindeki inversiyon mikroskop görüntüleri (ölçü çubukları: 150 µm) 75

89 4.6.1 Glikozaminoglikan (GAG) tayini Kondrojenik indüksiyon ortamında 7,14,21 ve 28 gün boyunca kültüre edilen HA-C- MKH yapılarındaki sgag miktarı, Blyscan Sulfated Glycosaminoglycan Assay (Biocolor, UK) test kiti ile belirlenmiştir. Standart GAG miktarlarının 650 nm deki absorbans değerlerine karşı çizilen standart grafiği şekil 4.14 te verilmiştir. absorbans 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 y = 0,1023x R² = 0, GAG miktarı (mikrogram/ml) Şekil 4.14 sgag standart grafiği (Blyscan, Biocolor) Standart grafikiğnden faydalanılarak, örneklerin absorbans değerlerinden 1 ml kültür sıvısı içerisindeki miktarları bulunmuş ve zaman noktalarına karşı grafiğe geçirilmiştir. HA-C iskelelerdeki farkılaşmış sıçan mezenkimal kök hücreleri tarafından salınan toplam sülfatlanmış glikozaminoglikan (sgag) miktarına ait grafik Şekil 4.15 de verilmiştir. 76

90 total GAG (microgram/ml) 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, kontrol günler Şekil 4.15 HA-C iskele- hücre kompozitlerinden salınan toplam sgag miktarının kültüre etme süresiyle değişimi Kültüre etme süresince hücrelerden salınan sgag miktarında belirgin bir artışın meydana geldiği görülmüştür. Bu da HA-C iskelelere tohumlanmış sıçan mezenkimal hücrelerinin kültür süresince farklılaşmaya ve çoğalmaya devam ettiğine işaret etmektedir. Çalışmada sıçan artiküler kıkırdak dokusu pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. 77

91 4.7 Hiyalüronik Asit-Elastin (HA-El) İskelelere Ekilmiş Sıçan Mezenkimal Hücrelerinin Kondrojenik Farklılaşması Çalışmanın bu kısmında HA-El iskelelerin biyolojik potansiyelleri sıçan mezenkimal hücreleri kullanılarak analiz edilmiştir. Hücreler HA-El iskelelere ekilmiş ve in vitro da kondrojenik koşullarda kültüre edilmiştir. Belirli zaman noktalarında tespit edilen örneklerin Hematoksilin-Eosin ve Alsiyan Mavisi boyamalarına ait fotoğraflar Şekil 4.16 verilmiştir. A B C D Şekil 4.16 a.sıçan MKH leri tohumlanmış HA-El iskelelerin kondrojenik farklılaşmanın 21. ve b. 28. günündeki Hematoksilin-Eosin ve c. 7. ve d 14. günlerdeki Alsiyan boyamaları (ölçü çubukları: 150 µm) Hücrelerin zamanla artan homojen bir HDM yapısı içerisinde bulunduğu görülmektedir. Pozitif Alsiyan boyaması, kondrojenik farklılaşmayı doğrulamakta, iskele-hücre yapısındaki proteoglikan yapılarını göstermektedir. 78

92 4.8 MTT Analizi Bulguları HA-C iskelelerde hücre yaşayabilirliğinin tayinine ait MTT bulguları Hücrelerin HA-C iskelelerdeki yaşayabilirliği MTT analizi ile 7,14, 21 ve 28. günlerde 4 saatlik inkübasyon süresinin ardından mikroskop altında gözlenmiştir. İskelelerdeki yaşayan hücreler MTT yi (sarı renkli) mitokondriyal dehidrogenaz enziminin katalizörlüğünde formazana (mor) indirger. Formazan kristallerinin oluşması, iskele yüzeyine bağlanmış olan hücrelerin canlılıklarını deneysel çalışmalar boyunca sürdürdüğünü göstermektedir. Ayrıca, faz kontrast görüntülerinden de görülebileceği gibi mezenkimal kök hücreler HA-C iskelelerde homojen bir hücresel dağılıma sahiptir (Şekil 4.17). A B Şekil 4.17 Mezenkimal kök hücre tohumlanmış HA-C iskelelerin MTT boyaması; tohumlamadan sonraki a.14.gün ve b. 28.gün faz-kontrast görüntüleri 79

93 1,2 1 absorbans 0,8 0,6 0,4 0, zaman (günler) Şekil 4.18 HA-C iskelelerde hücre çoğalması ve yaşayabilirliği (MTT analizi ile belirlenmiştir) Hücrelerin iskelelerde çoğalmasının kantitatif tayini için ise 570 nm de absorbans ölçümü yapıldı ve absorbans değerleri zamana karşı grafiğe geçirildi. Grafikte absorbans değerinin 21. güne kadar arttığı ve daha sonra ise neredeyse sabit kaldığı görüldü. Bu da kültürün belirli aşamasına kadar hücre artışının olduğu daha sonra ise belirli seviyelerde kaldığını gösterdi (Şekil 4.18). 80

94 4.8.2 HA-El iskelelerde hücre yaşayabilirliğinin tayinine ait MTT bulguları HA-El iskelelerde hücre yaşayabilirliği MTT analizi ile 7,14, 21 ve 28. günlerde 4 saatlik inkübasyon süresinin ardından mikroskop altında gözlenmiş, hücrelerin iskelelerde çoğalmasının kantitatif tayini için ise 570 nm de absorbans ölçülmüştür. 4 saatlik inkübasyonun sonunda oluşan formazan kristalleri, iskelelere tohumlanmış hücrelerin deneysel çalışmalar boyunca canlılıklarını sürdürdüğünü göstermektedir. (Şekil 4.19). A B Şekil 4.19 Mezenkimal hücre tohumlanmış HA-El iskelelerin MTT boyaması; a. tohumlamadan sonraki 14.gün ve b. 21.gün faz-kontrast görüntüleri Grafikte ise kültivasyon süresince belirli zaman noktalarında yapılan MTT analizine ait absorbans ölçüm sonuçları verilmiştir. Absorbans ölçüm sonuçları hücrelerin çoğalmasında zaman noktaları arasında çok büyük bir fark olmasa bile, iskelelerin tohumlanmış olan hücrelerin yaşamasını ve çoğalmasını belli ölçüde desteklediğini göstermiştir (Şekil 4.20). 81