Western Blot (veya immünblot), protein ekspresyonunu doğrulamak için standart laboratuvar

Transkript

1 İçerik Giriş...2 Western Blot Yöntemi...2 Protein Örneklerinin Hazırlanması...2 Dikey Jel Sistemi Kullanımı...3 Kuru Transfer Sistem Kullanımı...4 Bloklama...6 Protein Tespiti...6 Kemilüminesans Tanımlama Görüntülenmesi...7 1

2 Giriş Western Blot (veya immünblot), protein ekspresyonunu doğrulamak için standart laboratuvar prosedürlerine göre, farklı örneklerdeki proteinin göreceli miktarlarının belirlenmesinde ve yardımcı immünopresipitasyon deney sonuçlarının analizinde kullanılmaktadır. Bu metod ile, homojenat doku ya da ekstresi örneğinde jel sistemi ve spesifik bir birincil antikor kullanarak protein belirlenir. Denatüre edici SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) kullanılarak proteinler molekül ağırlığına göre ayrılırlar. Proteinlerin membrana aktarılmasından sonra problu spesifik antikorun hedef proteine bağlanması sonucu kemilüminesans ile hedef protein belirlenir. Western Blot Yöntemi Protein Örneklerinin Hazırlanması Resim 1: Protein Örneği Hazırlanması - Hücre kültürü PBS (Phosphate buffered saline) ile birkaç kez yıkanır. * Sabit bir ph ayarlanır. - Kültür 2500 rpm de 5 dakika santrifüj edilir. * Hücreyi çöktürebilmek için. 2

3 -150 ul Protein Extraction Reagent eklenir. * Hücre veya doku örneğinden protein saflaştırılır. - Oda sıcaklığında 5 dakika beklenir rpm de 5 dakika santrifüj edilir. * Süpernatantdan protein almak için. - Protein, LDS (lithium dodecyl Sulfate) sample buffer ile karıştırılır. * Örnek ve buffer oranı en az,1:4 olmalıdır. * LDS Sample Buffer (4X), proteinlerin denatürasyonu için kullanılır C de 5 dakika tutulur. * Proteinin 3 boyutlu yapısını kırmak için. Resim 2: Proteinin 3 boyutlu yapısının kırılması Dikey Jel Sisteminin Kullanılması - Eşit miktarda protein yüklemesi için konsantrasyonlara bakılır. -1X MES veya 1XMOPS buffer, jel tankına yüklenir. - Örnekler jeldeki kuyucuklar içine yüklenir. Bir kuyucuk(genelde birinci) sadece ladder veya marker yüklemesi için kullanılır. * Bu ladder lar çeşidine göre renkli olmakla birlikte proteinin molekül ağırlığını göstermektedir. Her bir kuyucuğa ug lık proteinler yüklenir. Saflaştırılmış 1ug lık çok az proteinler silver stain yöntemi ile çalışılabilir. 3

4 Resim 3: Dikey Jel Sistemi - Jel 200 V da dakikada yürütmeye ayarlanır. * Voltaj uygulanmaya başlandığında farklı proteinler farklı hızlarda yürümeye başlarlar. * Jelin boyutuna göre voltaj değeri değiştirilebilir. * Blue Dye jelin ön yüzünden bakılarak jelin altından çıkmadan sistem sonlandırılır. Kuru Sistem ile Transfer - Elektroforez işlemi sonlanınca tank dan jel çıkarılır. * Jel elektroforezi sonrası herhangi bir hazırlığa gerek kalmadan çalışmaya devam edilebilir. *Deiyonize suda jel hızlı bir şekilde yıkanarak herhangi bir küçük jel parçası jelden uzaklaştırılmış olur. - Anot parçası Dry sistem cihazına yerleştirilir ve membran üzerine deiyonize su ile ıslatılarak üzerinden roller geçirilir ve tüm hava kabarcıkları sistemden uzaklaştırılır. - Jel membran üzerine yerleştirilir ve üzerine filtre kağıdı konularak tekrar bir roller ile hava kabarcıkları uzaklaştırılır. - Katot parçasında bakır yüzey yukarı gelecek şekilde sisteme yerleştirilir. * Sistemde hava kabarcığının olmadığından emin olunur. 4

5 Resim 4: Kuru sistem transferi - Tek kullanımlık sünger kapağın içine yerleştirilir. * Blotlama boyunca sistemdeki sıvıyı alması ve sisteme basınç uygulaması için kullanılır. - iblot cihazının kapağı kapatılır ve sistemdeki kırmızı ışık yanmaya başlar. Doğru programın seçildiğinden emin olunur. - Start/Stop düğmesine basılarak transfer işlemi başlatılmış olur. Kırmızı ışığın yeşile dönmesi beklenir. Tanımlanan program çalışmaya başlar. - iblot Gel Transfer Cihazı sinyal sesi ile işlemi sonlandırır ve yeşil ışık yanıp sönmeye başlar. Start/Stop butonuna basılarak ses susturulur ve yeşil ışık kırmızıya döner. * İşlem 7 dakikada tamamlanır. - Proteinler nitroselüloz membrana geçmiş olur. iblot cihazını kapağı açılır ve tüm materyaller toplanmaya başlanır. *En üstdeki sünger ve katot katman atılır. *Dikkatli bir şekilde jel ve filtre kağıdı kaldırılıp atılır. *Nitroselüloz membran alınır. *Deiyonize suya alınır. *En alttaki anot katman alınıp atılır. 5

6 Bloklama - Membran ve antikor kullanılarak proteinin tanımlanmasına başlanılır. - Memebran bloklama buffer ile 10 dakikadan fazla oda sıcaklığında inkübasyona bırakılır. * Membrandaki non-spesifik bağlanmaları kapatmak için yağsız süt tozu, Tris- Buffered Saline (TBS) ve Tween 20 veya Triton X-100 gibi bir deterjan kullanarak hazırlanır. - Membran deiyonize sudan Yağsız süt tozlu PBS-T solüsyonuna alınır. Karıştırıcıda 30 dakika beklenir. Resim 5: Memebran Bloklama Tanımlama - Dilüe edilmiş bir primer antikor (1:250 to 1:1000 in blocking buffer) eklenmesi, bloklama bufferı ile 1 saatlik oda sıcaklığındaki karıştırıcıda gerçekleştirilir. - Membran üç kez buffer ile yıkanarak 10 dakika karıştırıcıda bekletilir. - Memebran, ikincil antikor (anti IgG-HRP conjugate) (bloklama bufferındaki dilüe oranı 1:10,000-1:2,000) ile 1 saat bloklama bufferında oda sıcaklığındaki karıştırıcıda bekletilir. 6

7 * Membranın önceki yıkanmasından sonra bağlanmayan antikorlar ortamdan uzaklaşmıştı ve ikincil antikor ile ortam hazırlanıp bağlanmalar gerçekleşir. - Membran üç kez buffer ile yıkanarak 10 dakika karıştırıcıda bekletilir. * Ortamdaki bağlanma yapmaya antikorlar böylece uzaklaştırılır. Western blot artık probların bağlanmasıyla birlikte tanımlama ya hazır hale geldi. Resim 6: Membran Yıkanması Kemilüminesan Tanımlama - Bundan sonraki çalışmalar karanlık ortamda gerçekleşir. - Chemiluminescence Blotting Substrate reagent setinden çıkan ikili paketten 10ml lik detection solüsyonları karıştırılır ve membran ile 20 saniye muamele edilir. - Membran plastik bir malzemeye sarılır. Film kaseti içindeki x-ray filminin üzerine proteinler gelecek şekilde yerleştirir. * Membranın proteini kapsadığı yüzün x-ray filmi üzerine denk geldiğinden emin olunmalı. - Kasetin kapağı kapatılır ve 20 saniye bekletilir. * Protein bantlarının hassaslığına karşın inkübasyon süresi değiştirilebilir. 7

8 - X-ray filmi kasetten çıkarılır ve piyasadaki belli developer ve fixer solüsyonları ile sırasıyla 20 saniye kadar muamele edilir. * Eğer film çok koyu ise zaman şu şekilde azaltılabilir; saniye. * Eğer film çok açık ise zaman şu şekilde artırılabilir; saniye. Resim 7: Western Blot X-ray filmi 8