Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TB101 Çiğdem Yamaner (Yrd. Doç. Dr.) 3. Hafta ( )

Transkript

1 Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TB101 Çiğdem Yamaner (Yrd. Doç. Dr.) 3. Hafta ( ) ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 1

2 DNA moleküllerinin analizinde çok çeşitli yöntemler kullanılmakla beraber tüm laboratuvarlarda rutin olarak yararlanılan en basit yöntemlerden biri jel elektroforezidir. Yöntemin avantajları basit ve hızlı olması, ayrıca diğer yöntemlerle yeterli düzeyde ayrılamayan DNA fragmentlerinin ayrılmasını sağlamaktır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 2

3 DNA nın elektroforetik analizinin temeli, bu molekülün elektriksel bir alanda, jel üzerindeki göçüne dayanır. Bu göç hızı, molekülün büyüklüğüne, yapısına, jelde kullanılan maddenin konsantrasyonuna, iyonik kuvvete ve uygulanan akıma bağlı olarak değişmektedir. Jel elektroforezinde kullanılan destekleyici madde (matriks) mekaniksel etkiyi engellemek ve molekülleri büyüklüklerine göre ayırmak için kullanılır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 3

4 Matriks nişasta, poliakrilamid, agaroz veya agaroz akrilamid karışımı olabilir. Poliakrilamid jeller genellikle küçük DNA fragmentleri ve RNA moleküllerinin ayırımında kullanılır. Ancak poliakrilamid jelleri hazırlamak zordur ve uzun süre alır. Ayrıca uygulanacak DNA nın yüksek konsantrasyonda olması gerektiğinden bu tip jellerin kullanılması pratik değildir. Bu nedenle rutin olarak en fazla kullanılan yöntem agaroz jel elektroforezidir. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 4

5 AGAROZ JEL ELEKTROFOREZİ - Agaroz kırmızı bir alg türü olan Agar agar dan izole edilen doğrusal bir polisakkarittir. - Agaroz sıcak suda çözünür ve soğutulduğu zaman polimerde karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu ile jel yapısı oluşur. Bu oluşum geri dönüşümlüdür. Şekil 1: Agaroz moleküllünün tekrarlayan monomer yapısı (A) ve jel yapısının oluşumu (B) ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 5

6 Ticari olarak üretilen agarozların saflık dereceleri farklı olabilmektedir. Bu durum DNA nın göç hızını etkiler. Ayrıca kimyasal yapısı değiştirilerek düşük sıcaklıkta eriyebilen agaroz tipleride geliştirilmiştir. Bu agarozların ayırım gücü çok fazladır. DNA jelden geri kazanılacaksa bu tip agaroz uygun olur. Agaroz konsantrasyonu %0,5-1,5 arasında değiştirilerek jelin por çapı ayarlanabilir. Böylece küçük DNA fragmentleri için yüksek büyük DNA fragmentleri için ise düşük agaroz konsantrasyonu kullanılarak DNA nın jelde en uygun şekilde yürümesi sağlanır. DNA nın jelde görünür hale gelebilmesi etidyum bromürün DNA bağları arasına bağlanarak 300 veya 360 nm de ışığı absorblaması sonucu fluerosan etki göstermesi ile olur. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 6

7 Şekil 3: Aynı özelliğe sahip DNA moleküllerinin farklı konsantrasyonlardaki agaroz miktarındaki görüntüsü. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 7

8 ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 8

9 SDS ( Sodyum dodesil sülfat) anyonik bir deterjan olup iki amino asitte bir peptit zincirine bağlanarak protein moleküllerini denatüre eder. Ayrıca (-) yük taşıdığından peptitlerede yüksek oranda '(-) yük kazandırır. Böylece elektrik yükü açısından karışım içerisindeki bütün protein molekülleri eşit duruma getirilir. Jel konsantrasyonu arttırılarak protein moleküllerinin molekül ağırlıklarına göre ayrışmaları sağlanır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 9

10 ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 10

11 SDS PAGE yöntemi proteinlerin saflığının kontrolü, molekül ağırlıklarının saptanması Konsantrasyon çeşitliliğinin belirlenmesi amacıyla kullanılmaktadır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 11

12 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), her biri hedef DNA sekansının bir ucuna tamamlayıcı oligonükleotit primer çifti kullanılarak bir DNA sekansının çoğaltılması için kullanılan bir in vitro sentez reaksiyonudur. Bir başka deyişle, DNA polimeraz tarafından birbirlerine doğru uzatılabilir bir çift oligonükleotit primeri hedef DNA molekülüne tamamlayıcı olacak şekilde tasarlanabilirse denatürasyon, primer annealing ve polimerizasyon; döngülerinin çalıştırılmasıyla primerlerin bağlandığı kalıp DNA bölgesinin çok fazla sayıda çoğaltılması mümkün olur. İşte bu hipotezden yola çıkan, K. Mullis 1985 te PCR tekniğini bulmuştur. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), mucidine Nobel ödülü kazandırmakla kalmamış, Dünya üzerinde yürütülen binlerce projenin en önemli yapı taşı halini almıştır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 12

13 Polimeraz zincir reaksiyonu çift iplikli bir DNA molekülünde hedef dizilere iki oligonükleotid primerin bağlanması ve uzaması esasına dayanır. Amplimer olarak da adlandırılan oligonükleotid primerler, kalıp DNA molekülü yüksek sıcaklık derecelerinde denatüre edildikten sonra, tek iplikli DNA molekülleri üzerinde kendilerine tamamlayıcı olan bölgelerle melezlenirler. Primerlerin spesifik olarak hedef dizilere bağlanması düşük sıcaklık derecelerinde gerçekleşir. DNA polimeraz enzimi, uygun tampon ve dört çeşit deoksiribonükleozid trifosfat (dntp) varlığında primerin 3' hidroksil ucundan uzamasını sağlar. Böylece kalıp DNA ipliğine tamamlayıcı olan yeni DNA molekülü sentezlenmiş olur. Bir PCR döngüsü denatürasyon, primerlerin bağlanması ("annealing") ve uzama ("extension") olarak adlandırılan üç aşamadan oluşur. Ardı ardına tekrarlanan denatürasyon, primerin bağlanması ve primerin uzaması evreleriyle DNA fragmentleri üssel olarak artar. Bu üssel artışın nedeni, bir döngü sonucu sentezlenen ürünün, ardışık döngüde diğer primer için kalıp görevi yapmasıdır. Böylece her PCR döngüsü DNA molekülü üzerinde istenilen bölgenin iki katına çıkması ile sonuçlanır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 13

14 ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 14

15 PCR verimini etkileyen önemli bir faktör, DNA polimeraz enzimidir. Normalde enzim miktarı, PCR döngüsü sonucunda hedef dizi artışı ve termal denatürasyon nedeniyle sınırlayıcı bir etken haline gelir. Verimliliği azaltan bir diğer faktör de konsantrasyonu artan hedef dizilerin primer ile bağlanma yarışıdır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 15

16 Birinci döngüde, tipik olarak 95 o C'de yaklaşık 60 saniye yüksek sıcaklık uygulaması ile hedef DNA iki ipliğe ayrılır. Primerlerin kalıp DNA'ya tutunması için sıcaklık 55 o C (yak1aşık 30 sn için) civarına düşürülür. Gerçek sıcaklık primer uzunluklarına ve sekanslarına bağlıdır. Annealing den sonra, Mg +2 'a gereksinim duyan ve reaksiyon karışımındaki dntp'leri kullanan optimal polimerizasyon için sıcaklık 72 o C'ye (60-90 sn için) çıkarılır. İlk polimerizasyon basamağında, her bir hedef molekül primer bölgelerinden farklı uzunluklarda kopyalanır. Bu işlem, reaksiyon sıcaklığını tekrar 95 o C'ye çıkarılıp, yeni sentezlenmiş molekülleri denatüre eden ikinci döngü başına kadar devam eder. Eğer PCR % 100 etkin ise bir hedef molekül n döngü sonrası 2 n olur. Pratikte döngü yaygın olarak kullanılır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 16

17 ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 17

18 DNA polimeraz enzimleri, kalıp ipliğe tamamlayıcı bir DNA ipliği meydana getirmek üzere, orjinal kalıp iplikteki baz bilgisini kullanarak dört çeşit deoksiribonükleozid trifosfattan uzun polinükleotid zincirin sentezini kataliz ederler. Bu enzimler, sentezi başlatmak için kalıp moleküldeki tamamlayıcı diziye bağlanan kısa DNA parçalarına (primerlere) gerek duyarlar. Sentezin yönü 5' uçtan 3' uca doğru olup, primerin serbest 3' hidroksil ucuna ortamdaki dntp'lerin nükleofilik etki yapmalarıyla, fosfodiester bağlarının katalizi ve yeni DNA ipliğinin polimerizasyonu sağlanır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 18

19 DNA Polimeraz Taq Amplitaq Hot Tub Pyrostase Vent Deep Vent Tth Pfu ULTma Kaynak Mikroorganizma Thermus aquaticus Thermus aquaticus Thermus flavis Thermus flavis Thermococcus litoralis Pyrococcus GB-D Thermus thermophilus Pyrococcus furiosus Thermotoga maritima ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 19

20 Bir çift PCR primerinin her biri yaklaşık nt uzunluğa ve benzer G+C içeriğine sahip olması gereklidir. Böylece primerler benzer sıcaklıklarda tamamlayıcı sekanslara tutunabilir. Kısa oligonükleotitler ( 25 nt) için annealing sıcaklığı ( o C), Tm= 2(A+T) + 4(G+C) formülü kullanılarak hesaplanabilir. Primerler hedef sekansın zıt zincirlere tutunması amacıyla tasarlanır; dolayısıyla 3'-uçlarına nükleotidlerin eklenmesiyle birbirlerine doğru uzatılırlar. Genelde 500 bp'den kısa olan hedef sekanslar kolayca çoğaltılabilir; fakat optimizasyon yapılarak 10 kb'den daha uzun olan fragmentler PCR'da çoğaltılabilir. Eğer çoğaltılacak olan DNA nın sekansı biliniyorsa, primer tasarımı nispeten kolaydır. Çoğaltılacak bölgenin her iki ucundan benzer G+C içerikli yaklaşık 20 nt uzunluğunda iki uygun sekans iyice araştırılabilir (örneğin, belli kanserlerdeki mutasyon bölgesi). Eğer PCR ürünü klonlanacaksa, primerlerin 5'-uçlarına tek restriksiyon enzim sekansı dahil etmek akla uygundur. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 20

21 dntp Karışımı Deoksiribonükleozid trifosfatlar (datp, dgtp, dttp, dctp) yüksek saflıkta ya tek tek ya da dörtlü karışım halinde ticari olarak sağlanır. Tamponlar ve MgCI 2 PCR için tavsiye edilen tampon 20 o C de ölçüldüğünde mm Tris-HCI'dir (ph: ), Tris; 20 o C de pka'sı 8.3 olan dipolar iyonik bir tampondur. 20 mm Tris için (ph:8.3) 20 o C deki gerçek ph, PCR döngü şartları boyunca 7.8 ve 6.8 arasında değişir. MgCI 2 'ün reaksiyon karışımındaki final konsantrasyonu değişebilmekle birlikte genellikle mm'lik değerler arasında çalışılır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 21

22 Multipleks PCR: Reaksiyon ortamına birçok primer çifti eklenirse, aynı reaksiyonda birden fazla fragmentin üretimi için kullanılabilir ve eğer bu fragmentler farklı uzunluklarda ise jel üzerinde kolayca ayrıştırılabilir. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 22

23 Bu birçok primer çifti setinin kullanıldığı multipleks PCR: Dokuları infekte eden patojen mikroorganizmaları belirlemek, Su veya gıda kontaminasyonuna neden olabilen mikroorganizmaların varlığını belirlemek Mutasyon analizleri Gen delesyon analizi vb. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 23

24 Temel PCR'de yapılan düzenlemeler temel primer çifti ile çoğaltılan bölgenin downstreamine ve upstreamine doğru ilerleyen sekansları çoğaltmayı mümkün kılar. Açıklayacak olursak bilinen bir diziye primerlerin bağlandığını düşünürsek bu primerlerin 5'- bölgesinin dışında kalan bölgelerdeki sekansların bulunması için genomik DNA, gen bölgesini ve bilinmeyen dış bölge sekansını içine alan bir restriksiyon ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji enzimi Bölümü ile kesilir. 24

25 Bu DNA fragmentine halkasal bir yapı kazandırılır (tıpkı plazmid gibi) böylece primerlerin bağlanacağı noktalar artık içte kalmıştır. Daha sonraki işlem ise bilinen gen bölgesindeki bir restriksiyon enzimi ile tekrar kesim yapılmasıdır. Böylece primerlere ekleme yapıldığında gen bölgesi ile birlikte dış bölgelerde (flanking region) amplifiye edilmiş olur. İşte bu ters PCR olarak bilinir (invers PCR). ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 25

26 Reverse Transcriptase tarafından bir cdna fragmenti üretildiğinde, cdna'nin ilk ipliğine kuyruğu [örneğin, oligo(dc)] eklemek için, önce terminal transferaz kullanarak 5'-uç sekansını çoğaltmak mümkündür. Bu oligo(dg) primeri ile spesifik bir gen primerinin kombinasyonu, 5'-bölgesinin çoğaltılmasına imkan tanır. Bu teknik cdna uçlarının hızlı amplifikasyonu (RACE) olarak adlandırılır. 3'-RACE için ökaryotik mrna'ların 3'-uç sekansını çoğaltmak amacıyla gen spesifik primeri ve mrna'nın 3'-ucundaki poli(a) kuyruğuna tutunacak oligo(dt) primeri kullanılır. PCR kütüphaneleri taramak veya blotlama deneylerini gerçekleştirmek için reaksiyonun ilerleyen safhalarında radyoaktif veya modifiye edilmiş nükleotidlerin eklenmesiyle, prob üretimi amacıyla PCR ürününü etiketlemek için PCR kullanılır. PCR aynı zamanda, verilen DNA fragmenti içine spesifik mutasyonların sokulmasında da kullanılır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 26

27 ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 27

28 Geleneksel PCR yöntemlerinde oluşan ürünler, PCR sonrasında gerçekleştirilen ikincil yöntemler (Agaroz jel, PAGE v.b.) ile kontrol edilmektedir. Real Time PCR da ise primerler ile birlikte amplifikasyonu yapılacak kalıp bölgesine spesifik işaretli problar (üzerinde işaretli gruplar bulunduran oigonükleotidler) kullanılmaktadır. Bu problar tıpkı primerler gibi kalıp ile bağlanır (işaret verir: SYBER GREEN problar), bağlanma sonrasında polimeraz sentezine devam ederken bu poblar ile karşılaşır ve 5' - 3' ekzonükleaz aktivitesi ile probu uzaklaştırır (işaret verir: TagMAN problar). Bu yöntem sayesinde reaksiyon devam ederken oluşan ürün miktarı hakkında bilgi sahibi olmak mümkün hale gelmiştir. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 28

29 ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 29

30 Bu yöntemde ise spesifik primerler yerine spesifik olmayan primerler kullanılır. Bu yöntemdeki amaç ise farklı kaynaklardan elde edilen kalıp DNA ların birbirine benzerliklerinin araştırılmasıdır. ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü 30