Türkiye Maternal Fetal Tıp ve Perinatoloji Derneği VIII.Kongresi Ekim 2012, İstanbul

Transkript

1 İstanbul Üniversitesi Fetal Nükleik Asit Araştırma Grubu Sonuçları Türkiye Maternal Fetal Tıp ve Perinatoloji Derneği VIII.Kongresi Ekim 2012, İstanbul

2 sfetal DNA Lo ve ark yılında anne plazma ve serumunda erkek fetusa ait DNA yı saptadığını yayınladı. Lo YM ve ark. Lancet 350, 485, 1997

3 GENOM DNA GEN DNA molekülü üzerinde protein kodlayan özgül bir nukleotid dizisidir. TRANSKRİPTOM RNA (mrna, rrna, trna, mirna, sirna, snorna ) PROTEOM Hastalıklar genetik koddaki hata veya kodun proteine çevrilmesi sırasında oluşan düzensizlikler nedeniyle olabilir.

4 Genomik DNA.Spektral analiz. Elektroforetik analiz. PCR.Real-time PCR. Dijital PCR. Southern Blot Analiz.Q-PCR. Array-CGH. Dizileme. Kopya sayısı değişiklikleri Yöntemler Anlatım Miktar Dizi analizi esasına dayanmaktadır. Transkriptomik RNA.Elektroforetik Analiz. cdna ile PCR.cDNA ile Dijital PCR.Northen Blot Analiz.Dizileme. Mikroarray ile gen anlatımı Proteomik Protein.Western Blot Analiz.Poliakrilamid jel elektroforezi.kromotografik yöntemler

5 sfetal DNA RT-PCR Dijital PCR QF-PCR Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (Array CGH) Tüm genom mikrodizin (microarray) MPSS (Masif paralel rastgele dizileme) Cinsiyet RhD Tek gen hastalıkları Kromozom sayısı Kromozom yapısı Preeklampsi IUGG Fetal Fizyoloji Fetal Gelişim

6 İstanbul Üniversitesi Fetal Nükleik Asit Araştırma Grubu İstanbul Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum ABD Prof.Dr. Hayri Ermiş Dr. İbrahim Kalelioğlu Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum ABD Prof.Dr.Kılıç Aydınlı Prof.Dr.Semih Kaleli Doç.Dr.Ali Benian Dr. Görkem Yosun Zeybek Dr. Hayrettin Şahin İÜ Fen Fakültesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü Y.Doç.Dr. Tuba Günel Mohammad Hosseini (Doktora öğr) Ece Gümüşoğlu Didem Altındirek

7 sfetal DNA Cinsiyet Tayini Kuşkulu Genitalia KAH X Kromozomu geçişli hastalıklar

8 Maternal kanda cinsiyet tayini yapılan GH arasındaki 24 olgunun analiz sonuçları İ.Ü. Fetal Nükleik Asit Çalışma Grubu Marker gen olarak Y kromozomu üzerinde bulunan DYS14 geni kullanıldı 5.GH 10 olgu 6.GH 7 olgu 7.GH 3 olgu 9.GH 3 olgu 10.GH 1 olgu RT-PCR ile 15 erkek (pozitif ) 9 kız ( negatif ) sonuç elde edildi ve bütün sonuçlar doğumdan sonra doğrulandı ( % 100 )

9 sfetal DNA RhD Tayini Rh sisteminin antijenleri 1. kromozom da taşınan bir çift paralog gen (RHD-RHCE) tarafından kodlanır. RHD RHCE RHD RHCE D+ veya D-

10 Maternal kanda RHD geni açısından analiz edilen GH arasındaki immunize olmamış 60 olgunun analiz sonuçları İ.Ü. Fetal Nükleik Asit Çalışma Grubu Örnek Exon 7 CT Exon 10 CT Fetal RHD (34,11 37,21) (34,45 37,35) 40 (%66.7) pozitif pozitif pozitif 17 (%28,3) negatif negatif negatif 2 (% 3.3) negatif pozitif RhDΨ RHD variant psödogen 1 (% 1.6) pozitif negatif pozitif Exon 7 daha güvenilir

11 SERBEST FETAL DNA ile RHD TANISI Detection of fetal RHD pseudogene (RHDΨ) and hybrid RHD-CE-Ds from RHD-negative pregnant women with a free DNA fetal kit T. Gunel, I. Kalelioglu, A. Gedikbasi, H. Ermis and K. Aydinli Genet. Mol. Res. 10 (4): (2011)

12 İ.Ü. Fetal Nükleik Asit Çalışma Grubu sfetal DNA Preeklampsi Sonuçları İntervillöz aralık Desidua Spiral arter Fizyolojik değişiklikler çap 500 mm Spiral arter 1/3 miyometriyum Bazal arter Radial arter Daralmış damar Elastik müsküler duvar çap mm Bazal arter Radial arter Normal Preeklampsi Yetersiz trofoblastik invazyon Oksidatif stres artışı Sitokin salınımında bozukluk Maternal dolaşıma trofoblast salınımında artış Apoptosis artışı Endotel hasarı Akut aterozis Tromboz veya luminal obliterasyon Trombofili Antifosfolipid sendromu

13 REAL TIME PCR ARACILIĞI İLE ANNE KANINDA FETAL DNA MİKTARININ SAPTANMASI VE PREEKLAMPSİ GELİŞİMİ İLE İLİŞKİSİNİN ORTAYA KOYULMASI Zeybek YG 1, Gunel T 2, Kaleli S 1 Benian A 1,Aydınlı K 1 1: İstanbul Üniversitesi, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Kadın Hastalıkları ve Doğum Ana Bilim Dalı 2: İstanbul Üniversitesi, Fen Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı Zeybek YG ve ark : Clinical evaluations of cell-free fetal DNA quantities in pre-eclamptic pregnancies, J. Obstet. Gynaecol. Res (baskıda)

14 MATERYAL VE YÖNTEM gebelik haftaları arasında klinik olarak tanı koyulmuş 30 preeklamptik hasta 18 kontrol hastası ile eşleştirildi. Anne kanındaki serbest fetal DNA düzeyi SRY (Y kromozomu üzerinde cinsiyet belirleyici bölge) ve GAPDH (gliseraldehid fosfat dehidrogenaz) gen dizileri kullanılarak Real Time PCR yöntemi ile karşılaştırıldı. Zeybek ve ark 2012

15 SONUÇLAR Zeybek ve ark, 2012

16 SONUÇLAR 30 preeklamptik hastada aynı haftadaki kontrol hastalarına göre anne kanındaki serbest DNA düzeyinde 3,06 kat ikinci trimestrede 1,5 üçüncü trimestrede 3,5 Erken başlangıçlı preeklampside 4,6 Geç başlangıçlı preeklampside 3,2 kat artış saptanmıştır. Zeybek ve ark,2012

17 Real Time PCR ile Gebelik Haftasında CD34 ve CD 133 Geninin Maternal Kanda Düzey Analizi ve Gebelik Prognozu ile İlişkisi Dr. Hayrettin Şahin Uzmanlık Tezi GH ları arasında 65 gebe rastgele seçildi. 6 hastada preeklampsi gelişti. CD34+ ve CD133+ kodlayan serbest fetal DNA analiz edildi.

18 Fetal Anöploidilerin Noninvaziv Prenatal Tanısı

19 Maternal kanda çalışılan sfetal DNA ile trizomi 21 sonuçlarımız İ.Ü. Fetal Nükleik Asit Çalışma Grubu 40 örnek çalışıldı. 20 tanesi Trizomi olgularına 20 tanesi normal gebelere ait DNA örnekleri incelendi.

20 Yukarıdada görülen grafik 2.trimestrede sitogenetik olarak trizomi saptanan 10 gebenin tıbbi tahliye öncesi alınan maternal kan örneklerinde DSCR3 (Down Syndrome Critical Region ) geninin anlatımına göre normal fetal DNA ile karşılaştırılmasından elde edilen değerleri gösteriyor. Tüm örneklerde artan gen anlatım miktarları görülüyor.

21 Yukarıda ise 15 gebede çalışılan DSCR3 (Down Syndrome Critical Region ) genine ait miktar belirleme grafiği. Yedinci ve 11. örnekler trizomi 21 olgularına diğerleri normal olgulara ait. Alta doğru olan çizgi grafikleri trizomili örneklere göre genin miktarının az olduğunu gösteriyor (normal olgular).

22 Maternal kanda çalışılan sfetal RNA / microrna İ.Ü. Fetal Nükleik Asit Çalışma Grubu RT-PCR Dijital PCR QF-PCR Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (Array CGH) Tüm genom mikrodizin (microarray) Preeklampsi IUGG Fetal Gelişim Fetal Fizyoloji MPSS (Masif paralel rastgele dizileme)

23 PLASENTAL micro RNA Maternal plazmadaki plasental microrna lar küçük (19-25 nt), tek sıra, kodlamayan ve daha stabil RNA lardır. Hedef mrna nın 3 ucuna (kopyalama yapmayan ) bağlanır ve protein kopyalamasını baskılar. Bir veya birden fazla hedef genin anlatımını değiştirerek gelişim, farklılaşma, çoğalma, hücre ölümü gibi süreçlerde rol oynarlar. micro RNA lar bir çok genin anlatımının anlaşılmasında etkili olabilir. Bu nedenle yeni bir belirteç bulmak için en uygun nükleik asittir.

24 Maternal kanda çalışılan sfetal RNA / microrna sonuçları İ.Ü. Fetal Nükleik Asit Çalışma Grubu 20 normotensif 20 preklamptik hasta incelendi mir-152 ( HLA-G yi suprese eder, NK-cell kökenli sitolizi indükler, immuniteyi arttırır ) Çalışmada değişmediği bulundu. mir-210 ( sinsisyotrofoblastlardan eksprese edilir. İmmunite, apoptozis ve lipid metabolizmasından sorumludur) Çalışmada 2x arttığı saptandı Mir-152 ve mir-210 u VEGF geninin düzenlenmesinde rol oynadıkları için araştırmayı tercih ettik.

25 Serum microrna expression in pregnancies with preeclampsia T. Gunel1, Y.G. Zeybek2, P. Akçakaya1, I. Kalelioğlu3, A. Benian4,H. Ermis3 and K. Aydınlı 5 1Department of Molecular Biology and Genetics, Faculty of Science, Istanbul University, Vezneciler, Istanbul, Turkey 2Siverek State Hospital, Sanlıurfa, Turkey 3Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Istanbul University, Istanbul, Turkey 4Department of Obstetrics and Gynecology, Cerrahpasa Medical Faculty, Istanbul University, Istanbul, Turkey 5Medicus Health Center, Istanbul, Turkey Corresponding author: T. Gunel gunel@istanbul.edu.tr Genet. Mol. Res. (2011) Ahead of Print Received October 4, 2011 Accepted November 1, 2011 Published November 8, 2011 DOI Preeklampsi ile bağlantılı olarak farklı metabolik yollarda seçtiğimiz özel genler ile belirteç arayışlarımız sürmektedir.

26 sfetal DNA, sfetal RNA,miRNA ve Fetal Tıp RT-PCR Dijital PCR QF-PCR Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (Array CGH) Tüm genom mikrodizin (microarray) MPSS (Masif paralel rastgele dizileme) Cinsiyet RhD Tek gen hastalıkları Kromozom sayısı Kromozom yapısı Preeklampsi IUGG Fetal Fizyoloji Fetal Gelişim

27 PRENATAL TANININ GELECEĞİ Serum tarama testleri ve/veya sfetal DNA nın / sfetal RNA nın analizi, bireysel fetal tıp, tedavi? İnvaziv girişim daha az yapılacak, sitogenetik analizde patolojik bulgu > % 99 ULTRASONOGRAFİ

28 Teşekkür ederim...

29

30 sfetal microrna Plasental microrna transkriptleri maternal plazmada 4.GH sından itibaren saptanabilir. Ortalama yarılanma yaşamı 14 dakikadır. Doğumdan sonra hızla anne kanından temizlenir. Chiu RW ve ark. Clin Chem, 52, 313, 2006

31 sfetal DNA RhD Tayini RT-PCR ile ilk trimestrede sensivite % 100. Yanlış pozitif olgular genellikle RhD psödogeninden (nonfonksiyonel) kaynaklanıyor. Özel primer ler ile bu hata büyük oranda giderilebiliyor. Costa MJ ve ark. Br J Haematol, 119, 255, 2002 Finning KM ve ark. Transfusion, 42, 1079, 2002 Günel T ve ark. Genet Mol Res, 10, 2653, 2011