Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri. Bölüm 4. DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması. M. Somma

Transkript

1 Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 4 DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması M. Somma WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR E UROPA ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО

2 DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması 2 İçindekiler Bölüm 4 DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması Giriş 3 Ekstraksiyon yöntemleri 4 Saflaştırma yöntemleri 4 CTAB ekstraksiyon ve pürifikasyon yöntemi 6 Spektrofotometre ile DNA miktar tayini 9 DNA nın spektrofotometrik olarak belirlenme ilkeleri 9 Nükleik asit konsantrasyonunun belirlenmesi 11 Deneysel 13 Kaynaklar 17

3 DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması 3 Giriş Nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırılması çoğu moleküler biyolojik çalışmada ve rekombinant DNA tekniklerinin tümünde ilk adımdır. Nükleik asit ekstraksiyon yöntemlerinin buradaki amacı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) kullanarak bir GD spesifik analiz için farklı kaynaklardan nükleik asit saflaştırılmasını sağlamaktır. Nükleik asitlerin kalitesi ve saflığı PCR analizleri için en önemli faktörlerden bazılarıdır. Yüksek saflıkta, inhibisyon bulaşanlarından arındırılmış nükleik asitleri elde etmek için, uygun ekstraksiyon yöntemleri uygulanmalıdır. PCR analiz performansını inhibe eden olası bulaşanlar Tablo 1 de listelenmiştir. Örnekteki PCR inhibitorlerinin varlığından kaynaklanan yanlış (negatif) bir sonucun ortaya çıkmasını engellemek için PCR inhibisyonu test edilerek kontrollü bir deney gerçekleştirilmesi önemlidir. Bu amaçla, bir bitki-spesifik (ökaryot veya kloroplast) veya türe spesifik PCR analizi sıklıkla kullanılır. Tablo 1. PCR işleminin bazı inhibitörleri İnhibitör İnhibisyon Konsantrasyonu SDS >%0,005 Fenol >%0,2 Etanol >%1 İzopropanol >%1 Sodyum asetat >5 mm Sodyum klorit >25 mm EDTA >0,5 mm Hemoglabin >1 mg/ml Heparin >0,15 i.u./ml Üre >20 mm Reaksiyon karışımı >%15 Nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve pürifikasyonu için çok çeşitli yöntemler vardır, en uygun tekniğin seçimi genellikle asağıdaki kriterlere bağlıdır: Hedef nükleik asit Kaynak organizma Başlangıç materyali (doku, yaprak, tohum, işlenmiş materyal vb.) İstenen sonuçlar (verim, saflık, pürifikasyon için gerekli süre) Bir sonraki uygulama (PCR, klonlama, işaretleme, blotlama, RT-PCR, cdna sentezi),vs Nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve saflaştırılması için günümüzde en yaygın olarak kullanılan bazı yöntemlerin ilkeleri aşağıdaki bölümlerde açıklanacaktır.

4 DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması 4 Ekstraksiyon yöntemleri Biyolojik materyalden nükleik asitlerin ekstraksiyonu hücre parçalanması, hücre nükleazların inaktivasyonu ve nükleik asitlerin parçalanmış hücreden ayrımını gerektirir. Genellikle ideal parçalama prosedürü birtakım tekniklerin bileşiminden oluşur. Bu süreç karmaşık baslangıç materyalini (doku gibi) parçalayacak kadar sert, ancak hedef nükleik asidi koruyacak kadar da yumuşak olmalıdır. Temel parçalama prosedürü aşağıdaki yöntemlerle gerçekleştirilebilir: Mekanik parçalama (öğütme, hipotonik parçalama gibi) Kimyasal uygulama (deterjanlarla parçalama, tıol ile redükleme, kaotropik katkı madeleri,vs gibi) Enzimatik parçalama (Proteinaz K gibi) Hücre içi nükleazların inaktivasyonu ve hücre membranının parçalanması işlemleri birleştirilebilir. Örneğin, tek bir çözelti hücre membranını parçalamak için deterjanlar, hücre içi enzimleri inaktive etmek için de güçlü kaotropik tuzlar içerebilir. Hücre lizizi ve nükleaz inaktivasyonundan sonra hücre içi diğer faktörlerin uzaklaştırılması filtrasyon veya presipitasyon(çökeltme) gibi işlemlerle kolayca yapılabilir. Saflaştırma yöntemleri Hücre ekstraktlarından nükleik asitlerin saflaştırılması yöntemleri genellikle aşağıdaki tekniklerden iki veya daha fazlasının birlikte kullanımını gerektirir: Ekstraksiyon / presipitasyon Kromatografi Santrifügasyon Afinite kolon ayrımı Bu tekniklerin kısa açıklamaları takip eden paragraflarda verilecektir (Zimmermann ve ark., 1998). Ekstraksiyon / Presipitasyon Çözücü ekstraksiyonu nükleik asitlerden kontaminantları uzaklaştırmak için sıklıkla kullanılır. Örneğin, fenol ve kloroform kombinasyonu proteinleri uzaklaştırmak için, izopropanol ve etanol ile presipitasyon genellikle nükleik asitleri konsantre etmek için kullanılır. Hedef nükleik asitlerin miktarı düşük olduğunda, presipitasyonun etkisini artırmak için karışıma bir inert taşıyıcı (glikojen gibi) ilave edilebilir. Nükleik asitlerin diğer presipitasyon yöntemleri yüksek konsantrasyonlu tuz (salting out) kullanılarak

5 DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması 5 yapılan seçici presipitasyon ve ph daki değişiklikler kullanılarak yapılan protein presipitasyonunu içerir. Kromatografi Kromatografi yöntemleri jel filtrasyonu, iyon değişimi, seçici adsorpsiyon veya affinite ile bağlanma gibi farklı ayrıştırma tekniklerinden oluşabilir. Jel filtrasyonu, jel partikülleri porlarının moleküler eleme özelliği ile işler. Belirli por çapına sahip bir matriks daha küçük moleküllerin difüzyon yolu ile porlara girişine izin verir, daha büyük moleküller porlar tarafından içeri alınmaz ve boş hacimle ayrıştırılılar. Böylece moleküller molekül büyüklüğü azalışına bağlı olarak sırayla elüye edilir. İyon değişimi kromatografisinde, bir hedef molekül ve kolon matrisindeki fonksiyonel gruplar arasındaki elektrostatik interaksiyondan yararlanılır. Nükleik asitler (yüksek negatif yüklü, lineer polianyonlar) iyon değişimi kolonundan basit tuz tamponları ile ayrıştırılır. Adsorpsiyon kromatografisinde, nükleik asitler diğer biyolojik moleküllerin aksine, belirli tuzlar varlığında (örn. kaotropik tuzlar vb.) seçici olarak silika veya cam yüzeyler üzerine tutunur. Daha sonra düşük konsantrasyonlu bir tuz tamponu veya su ile nükleik asitleri, bir sonraki uygulamada direkt olarak kullanabilen bir örnek oluşturacak biçimde, ayrıştırmak mümkündür. Santrifügasyon Seçici santrifüj güçlü bir saflaştırma yöntemidir. Örneğin yüksek g-gücünde kendi kendine oluşan CsCl gradientlerdeki ultrasantrifügasyon, plazmit saflaştıması için uzun süredir kullanılmaktadır. Genellikle, santrifüj bir başka yöntemle kombine edilerek kullanılır. DNA ve RNA yi daha küçük kontaminantlardan (tuzlar, nükleotidler, vb) tampon degişimi veya büyüklük tespiti amacıyla saflaştırmak için jel filtrasyonla santrifügasyonu birleştiren spin kolon kromatografisi buna bir örnektir. Bazı prosedürler, kromatografik bir matriks ( bknz. Bir üst paragraf) üzerindeki selektif adsorpsiyon ile santrifugal elüsyonu bir nükleik asit çeşidinin seçici saflaştırılmasi için kombine eder. Afinite kolon ayrımı Son yıllarda bir çok saflaştırma yöntemi nükleik asitlerin afinite immobilizasyonunu manyetik ayrıştırmayla birleştirmiştir. Örneğin, poly(a)+mrna, biyotin işaretli oligo(dt) ile streptavidin kaplı manyetik partiküllere bağlanabilir. Bu bağlanmış partiküller solusyondan ve bağlanmamış kontaminantlatdan bir mıknatıs yardımı ile ayrıştırabilir. Bu katı faz tekniği, santrifugasyon, organik ekstrasyon ve faz

6 DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması 6 ayrıştırmanın bazı aşamalarını basit, hızlı bir manyetik ayrıştırma ile yaptığı için nükleik asit saflaştırma olayını basitleştirir. CTAB ekstraksiyon ve pürifikasyon yöntemi İlk kez Murray ve Thompson tarafından 1980 de geliştirilen CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide) protokolü Wagner ve arkadaşları tarafından 1987 de yayınlanmıştır (Wagner ve ark., 1987). Bu yöntem bitki ve bitki kaynaklı gıda maddelerinden DNA ekstraksiyonu ve pürifikasyonu için kullanılır. Yöntem özellikle polisakkaritlerin ve polifenolik bileşenlerin elimine edilmesine uygundur; diğer bir deyişle saf DNA eldesi ve dolayısıyla da DNA kalitesinde etkilidir. Bu prosedür bitki moleküler genetiğinde yaygın bir biçimde kullanılmakadır ve GDO ların saptanabilmesi için yapılan validasyon denemelerinde test edilmiştir (Lipp ve ark., 1999; 2001). Birkaç değişiklik tekniğin birçok ham ve işlenmiş gıda matriksinde kullanılabilmesi için geliştirilmiştir (Hupfer ve ark., 1998; Hotzel ve ark., 1999; Meyer ve ark., 1997; Poms ve ark., 2001). CTAB yönteminin ilkeleri: Liziz, ekstraksiyon ve presipitasyon Bitki hücreleri, az tuzlu bir ortamda nükleik asitlerle birlikte çözünmez bir kompleks oluşturan, iyonik bir deterjan olan CTAB ile lize olabilir. Bu koşullarda, polisakkaritler, fenolik bileşenler ve diğer kontaminantlar süpernatantta kalır ve ortamdan yıkama ile uzaklaştırılabilir. DNA kompleksi tuz konsantrasyonu arttırılarak çözünülür ve etanol ve izopraponal ile presipite edilir. Bu bölümde, bu üç temel aşamanın ilkeleri, hücre duvarı lizizi, genomik DNA ekstraksiyonu ve presipitasyonu açıklanacaktır. Hücre duvarı lizizi: Daha önce açıklandığı gibi, DNA ekstraksiyonunun ilk aşaması hücre ve çekirdek duvarlarının parçalanmasıdır. Bu amaçla, homojenize örnek ilk aşamada EDTA Tris/HCl ve CTAB içeren ekstraksiyon tamponu ile muamele edilir. Bütün biyolojik membranlar kovalent olmayan bağlarla birbirine bağlı lipit ve protein moleküllerinden oluşan temel bir yapıya sahiptir.

7 DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması 7 Şekil 1. Hücre membranlarının basit gösterimi (Şekil 1, 2, 3 Genetic Science Learning Center, University of Utah Şekil 1 de gösterildiği gibi, lipit molekülleri, içinde protein moleküllerinin bulunduğu, süreklilik gösteren bir çift tabaka biçiminde dizilmiştir. Lipit molekülleri baş olarak isimlendirilen hidrofilik uçlar ve kuyruk olarak isimlendirilen hidrofobik uçlardan oluşur. CTAB yönteminde membran lizizi, ekstraksiyon tamponu içinde bulunan bir deterjan (CTAB) ile yapılır. Lipitler ve deterjan benzer kompozisyonlara sahip olduğu icin, ekstraksiyon tamponunun CTAB bileşeni hücre ve çekirdek membranını oluşturan lipitleri tutma özelliğine sahiptir. Bir deterjan kullanılarak çözünen lipitlerin mekanizmasi Şekil 2 de gösterilmektedir. Şekil 2. Lipit çözünmesi Şekil 3, hücre membranının CTAB ekstrasyon tamponuna maruz kaldığında deterjanın genomik DNA yı çıkararak lipitleri ve proteinleri nasıl yakaladığını göstermektedir. Spesifik bir tuz (NaCl) konsantrasyonunda, deterjan nükleik asitlerle çözünmez bir kompleks oluşturur. EDTA magnezyum dahil farklı metallere bağlanabilen kelatlayıcı bir bileşendir. Magnezyum DNAaz enziminin kofaktörüdür. Mg ve EDTA bağlanması ile, varolan DNAaz ın aktivitesi azalır. Tris/HCl ph yı tamponlama kapasitesine sahip bir çözeltidir (düşük veya yüksek ph DNA ya zarar verir). Nükleik asitler saflaştırmanın bu aşamasında kolayca degrade olabildiği için örneğin homojenizasyonu ve CTAB tampon çözeltisinin eklenmesi arasındaki zamanın en aza indirilmesi önemli bir noktadır. Hücre ve organel membranları

8 DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması 8 (mitokondri ve kloroplast gibi) parçalandıktan sonra DNA pürifikasyonu gerçekleştirilir. Şekil 3. Hücre membranının parçalanması ve genomik DNA nın ekstrasyonu Ekstraksiyon: Bu aşamada polisakkaritler, fenolik bileşikler, proteinler ve sıvı çözeltide bulunan diğer hücre lizatları, CTAB nükleik asit kompleksinden ayrılır. Çok sayıda enzimatik reaksiyonu inhibe etme yetenekleri nedeniyle fenolik bileşiklerin olduğu gibi polisakkaritlerin de yok edilmesi özelikle önemlidir. Düşük tuz konsantrasyonlarında ( 0,5 M NaCl), nükleik asit kompleksi kontaminantları çökmez ve solüsyonun klorofomr ile ekstraksiyonu sırasında uzaklaştırlıbailir. Kloroform proteinleri denatüre eder ve sıvı ile organik fazların ayrılmasını kolaylaştırır. Normal olarak, sıvı faz formu üstteki fazdır. Ancak, sıvı faz tuz konsantrasyonu nedeniyle yoğun ise alt fazı oluşturacaktır. Buna ek olarak, sıvı çözeltinin ph sı 7,8-8,0 değerlerine yeteri kadar denkleştirilmemiş ise nükleik asitler organik faza dağılacaktır. Gerektiğinde sıvı fazdaki kirleticileri tamamen ortadan kaldırabilmek için kloroform ekstraksiyonu iki veya üç kez uygulanır. Nükleik asitleri en iyi şekilde geri kazanabilmek için organik faz geri özütlenerek bir önceki ekstrakta eklenebilir. Nükleik asit kompleksi bir kez saflaştırıldığında, prosedürün son aşaması olan presipitasyon gerçekleştirilebilir. Presipitasyon: Son aşamada, nükleik asitler deterjandan ayrılır. Bu amaçla, ilk olarak sıvı solusyon yüksek konsantrasyonlu NaCl ( 0,8 M NaCl) ve CTAB karışımından oluşan bir presipitasyon çözeltisi ile muamele edilir. Tuz nükleik asit presipitatı oluşumu için gereklidir. Sodyum asetat tamponlama kapasitesi nedeniyle NaCl yerine tercih edilebilir. Bu koşullar altında, alkol içerisinde suda olduğundan daha çözünür olan deterjanlar, nükleik asitler presipite olurken yıkanıp atılabilirler. Takip eden %70 alkol ile muamele, nükleik asitlerin geri kalan tuzdan arındırılarak ek bir saflaştırma yapılmasını sağlar.

9 DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması 9 Spektrofotometre ile DNA miktar tayini DNA, RNA, oligonükleotidler ve hatta mononükleotidler seyreltilmiş veya seyreltilmemiş sıvı solusyonlar içinde, ultraviyole ışığı altında (aynı zamanda görünür dalga boylarında) sahip oldukları absorbsiyon A (optik yoğunluk, OD) üzerinden direkt olarak ölçülebilir. Örnek saf olduğunda (örneğin proteinler, fenol veya agaroz gibi kontaminantlar çok düşük miktarlda mevcut yahut yoksa) nükleotid bazları tarafından absorbe olan ultraviyole radasyonun miktarı spektrofotometrik olarak basit ve doğru biçimde ölçülebilir. Bu yöntem için, düşük iyon konsantrasyonlu sıvı tamponlar (örneğin TE tamponu) idealdir. Nüklek asitlerin konsantrasyonu genellikle bir köre (boş örnek) karşı 260 nm de A ölçülerek belirlenir. Kontaminantların varlığı, oran hesaplaması ile ayırt edilebilir. Proteinler 280 nm de absorbladığı için A 260 /A 280 oranı nükleik asitin saflığını hesaplamak için kullanılır. Saf DNA yaklaşık 1,8, saf RNA ise yaklaşık 2,0 değerini vermelidir. 230 nm de görülen absorpsiyon, örneğin karbonhidratlar, peptitler, fenoller veya aromatik bileşenler gibi maddelerle kontaminasyonu gösterir. Saf örneklerde A 260 /A 230 oranı yaklaşık 2,2 olmalıdır. Alternatif bir yöntem olan etidiyum bromidli agaroz yöntemi, nükleik asitlerin düşük miktarlarda mevcut olduğu durumlarda kullanışlıdır. Nükleik asit miktarı, bir seri konsantrasyon standardıyla karşılaştırılarak, UV ışığına maruz bırakıldığında etidiyum bromid tarafindan ışınan floresanın yoğunluğundan hesaplanabilir. DNA nın spektrofotometrik olarak belirlenme ilkeleri Spektrofotometrik ölçümde, bir çözeltideki çözüntü konsantrasyonunu belirlemek için ışığın çözeltide iletilme oranını kullanır. Cihaz, belirli bir dalga boyunda bir ışık hüzmesinin bir örnekten geçtiği ve iletilen ışık enerjisi miktarının örneğin diğer tarafında bir fotosel ile ölçüldüğü basit bir ilkeyle çalışır. Şekil 4 te gösterildiği gibi tek ışık yolu olan bir spektrometre, ışık kaynağı, prizma, örnek kuyucuğu ve fotoselden oluşur. Bunların her birine aydınlatma yoğunluğunu ve dalga boyunu kontrol etmek ve fotoseldeki enerjiyi voltaj dalgalanmasına dönüştürmek için uygun elektrik ya da mekanik sistemler bağlanmıştır. Oluşan voltaj dalgalanması daha sonra metre ölçeğinde görüntülenir veya daha sonraki incelemeler için bir bilgisayara kaydedilir.

10 DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması 10 Şekil 4. Işık iletimi şeması Bütün moleküller ışık enerjisini belirli bir dalga boyunda emerler. Böylece bir çözelti içindeki çözüntünün konsantrasyonunu bulmak olasıdır. Beer-Lambert kuralına göre absorsiyon (emilim, soğurma) A (optik yoğunluk, OD olarak da adlandırılır) ile makro molekülün konsantrasyonu (c) arasında aşağıdaki denklemde verilen doğrusal bir ilişki vardır: A=OD= ε.i.c ε molar sönüm katsayısı (molar extinction coefficient), c konsantrasyon ve l küvetin ışık yolu uzunluğudur. Proteinler ve nükleik asitler, ultraviyole alanda ışığı 210 ve 300 nm arasında emerler. Daha önce açıklandığı gibi DNA ve RNA çözeltilerinin maksimum emilimi 260 nm de, protein çözeltilerinin ise 280 nm de olmaktadır. DNA ve RNA çözeltileri ışığı kısmen 280 nm de ve protein çözeltileri 260 nm de soğurduğundan 260 ve 280 nm (A 260 /A 280 ) ölçüm aralığındaki bir oran, nukleik asitlerin saflık değerini verir. DNA ve RNA yaklaşık olarak 1,8 ve 2,0 değerlerinde A 260 /A 280 e sahiptir. 10 mm lik bir ışık yolu ve 260 nm lik bir dalga boyu için A=1 absorpsiyon, yaklaşık 50 µg/ml dsdna, 37 µg/ml ssdna, 40 µg/ml RNA veya 30 µg/ml oligonükleotidlere denk gelmektedir. Eğer proteinden kaynaklanan bir kontaminasyon varsa A 260 /A 280 yukarıda verilen değerlerden daha az olacaktır ve nükleik asit miktarının doğru ölçümü mümkün olmayacaktır. Burada, DNA çözeltilerinde RNA dan kaynaklanan kirlenmelerin spektrofometre ile sağlıklı bir şekilde tespit edilemeyeceğinin altını çizmek gerekir. 325 nm de A ölçümü, çözeltideki çöküntü varlığını ya da küvetin kirli olduğunu göstermede kullanılır.

11 DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması 11 Nükleik asit konsantrasyonunun belirlenmesi Küvet seçimi: Absorbans (A) ölçümü için kullanılan nükleik asit miktarı küvet kapasitesine bağlıdır. Örnek konsantrasyonuna, seyreltme faktörüne ve mevcut örnek hacmine bağlı olarak uygun bir küvet, seçilmelidir. GDO saptaması için kullanılan birçok prosedürde elde edilen genomik DNA nın hacmi 50 ile 100 µl arasındadır. Düşük hacimli nükleik asitlerin spektroskopik ölçümü için 5 ile 70 µl kapasitede, mikro hacimli küvet çeşitleri kullanılır. Kurulum : Spektrofotometrenin kalibrasyonu şu nedenlerle önemlidir : Doğru ışık yolu uzunluğunu ayarlamak, dsdna, ssdna veya RNA için doğru faktörü belirlemek, Su ya da bir tampon solüsyonundan (A 260 =0) oluşan boş bir solüsyonu ölçmek (kör), Kurulum referansını belirli aralıklarla yenilemek, Kurulum referansının güvenilirliliğini kontrol etmek için saf nükleik asitten belirli bir miktar ölçmek Bilinmeyen örneklerin ölçümü : Kullanılan küvetin kapasitesine bağlı olarak belirli miktarda DNA çözeltisi konsantrasyon değerlendirmesi için kullanılır (örneğin 0,2 ml nin altında kapasitesi olan bir küvet için 5 µl DNA 195 µl su ile seyreltilir). Spektrofotometre ayarlandıktan ve nükleik asit çözeltisi eklendikten sonra küvetin kapağı kapatılır, çözelti karıştırılır ve absorbans ölçülür. Pipetten kaynaklanan hataları aza indirmek için ölçüm en az iki kere tekrarlanmalı ve her zaman en az 5 µl DNA çözeltisi kullanılmalıdır. 0,02 den az veya 1 ile 1,5 (kullanılan cihaza bağlı olarak) arasındaki A 260 ölçümleri, yüksek hata payı olasılığı nedeniyle tavsiye edilmemektedir. Bir çözeltide bulunan belirli bir nükleik asitin c konsantrasyonu A 260 ın 260 nm de ölçülen absorbans olduğu düşünülerek aşağıdaki denklemler kullanılarak hesaplanır. Tek zincirli DNA c(pmol/µl) = A 260 /0,027 Çift zincirli DNA c(pmol/µl) = A 260 /0,020 Tek zincirli RNA c(pmol/µl) = A 260 /0,025 Oligonükleotid c(pmol/µl) = A /1,5N A +0,71N C +1,20N G +0,84N T

12 DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması 12 Referans DNA nın, 50 µg/ml icin A 260 =1 olduğu dsdna olduğu düşünülerek, 10 mm duvar kalınlığı olan bir küvette 1x TNE tamponunda çözülmüş saf calf thymus DNA nın absorbans ölçümleri Tablo 2 de örneklenmiştir. DNA konsantrasyonu 25 µg/ml dir. Tablo 2. 1x TNE tamponundaki çok saf calf thymus DNA nın absorbans ölçümleri Dalga boyu Absorbans A 260 /A 280 c (µg/ml) 325 0, , ,56 2, ,30 - -

13 DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması 13 Deneysel Ekipman NOT Ekipmanların tamamı kullanımdan önce sterilize edilmeli ve herhangi bir olası DNA kalıntısı uzaklaştırılmalıdır. Kontaminasyondan kaçınmak için, aerosoldan korunmuş filtreli pipet uçları kullanılmalıdır. Steril bir jilet, veya bir havan gibi, örneğin boyutlarını küçültmede kullanılacak aletler Su banyosu veya ısıtıcı blok Mikrosantrifüj Mikropipetler Vorteks karıştırıcı 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri Tartım kapları veya eşdeğeri Spatüller Terazi (0.01 g tartabilen) Looplar Mikrosantrifüj tüpleri için taşıyıcı raf Opsiyonel : DNA peletlerini kurutmak için vakum desikatör Çözeltiler NOT Kimyasalların tümü moleküler biyolojide kullanılabilir saflıkta olmalıdır. Deiyonize su ve tamponlar kullanımdan önce otoklavlanmalıdır. Ayrıca, hiçbir kimyasal, DNA ve DNaz içermemelidir. Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) CAS Kloroform İsopropanol Na 2 EDTA CAS

14 DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması 14 Etanol NaCl Proteinaz K RNaz A Tris(hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride (Tris-HCl) Steril deiyonize su CTAB tampon çözeltisi 20 g/l CTAB 4 g 1,4 M NaCl 16,4 g 0,1 M Tris HCl 3,15 g 20 mm Na 2 EDTA 1,5 g 100 ml deiyonize suya eklenir. 1 M NaOH ile ph 8 e ayarlanır. Deiyonize su ile 200 ml ye tamamlanır ve otoklavlanır. 4 C de maksimum 6 ay depolanır. CTAB presipitasyon çözeltisi 5 g/l CTAB 1 g 0,04 M NaCl 0,5 g Deiyonize su ile 100 ml ye tamamlanır. Çözeltinin ph sı 1 M NaOH ile 8 e ayarlanır. Deiyonize su ile 200 ml ye tamamlanır ve otoklavlanır. Çözelti 4 C de maksimum 6 ay saklanır. 1,2 M NaCl 7 g NaCl deiyonize suda çözülerek 100 ml ye tamamlanır. Otoklavlanır ve oda sıcaklığında saklanır. %70 (v/v) Etanol çözeltisi 70 ml saf etanol 30 ml steril deiyonize su ile karıştırılır.

15 DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması 15 RNAaz A 10 mg/ml -20 C de saklanır. Proteinaz K 20 mg/ml -20 C de saklanır. Prosedür Bu prosedür steril koşullar gerektirir. Kontaminasyon, örnek hazırlama sırasında tek kullanımlık ekipman ve dekontaminasyon çözeltileri kullanılarak ve toz oluşturmaktan kaçınılarak engellenebilir. Homojenize örnekten 100 mg steril bir 1,5 ml lik mikrosantrifüj tüpe aktarılır. 300 µl steril deiyonize su eklenir, bir loop ile karıştırılır. 500 µl CTAB-tampon çözeltisi eklenir, bir loop ile karıştırılır. 20 µl Proteinaz K (20 mg/ml) eklenir, sallayıcı karıştırıcıda 65 C dakika inkübe edilir. 20 µl RNaz A (10 mg/ml) eklenir, sallayıcı karıştırıcıda 5-10 dakika inkübe edilir. Yaklaşık 16000x g de 10 dakika santrifüjlenir. Süpernatant 500 µl kloroform içeren bir mikro santrifüj tüpüne eklenir, 30 saniye karıştırılır. Faz ayrılana kadar 16000x g de 10 dakika santrifüjlenir. Üst tabakanın 500 µl si, 500 µl kloroform içeren yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır ve karıştırılır x g de 5 dakika santrifüjlenir. Üst tabaka yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır. 2 hacim (çektiğimiz üst tabaka çözeltinin 2 katı) CTAB presipitasyon çözeltisi eklenir, pipet ile karıştırılır. 60 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir x g de 5 dakika santrifüjlenir. Süpernatant atılır. Pelet 350 µl NaCI (1,2 M) de çözündürülür. 350 µl kloroform eklenir ve 30 saniye çalkalanır. Faz ayrılana kadar 16000x g de 10 dakika santrifüjlenir. Üst tabaka yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır. 0,6 hacim izopropanol eklenir ve çalkalanır x g de 10 dakika santrifüjlenir. Süpernatant atılır. %70 lik Etanol çözeltisinden 500 µl eklenir ve dikkatlice karıştırılır.

16 DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması x g de 10 dakika santrifüjlenir. Süpernatant atılır. Pelet kurutulur ve 100 µl steril deiyonize suda DNA tekrar çözündürülür. DNA çözeltisi buzdolabında maksimum iki hafta, veya dondurucuda -20 C de daha uzun bir süre saklanabilir.

17 DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması 17 Kaynaklar Hotzel, H., Müller, W. and Sachse, K. (1999). Recovery and characterization of residual DNA from beer as a prerequisite for the detection of genetically modified ingredients. European Food Research Technology 209, Hupfer, C., Hotzel, H., Sachse, K. and Engel, K.H. (1998). Detection of the genetic modification in heat-treated products of Bt maize by polymerase chain reaction. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 206, Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. and Anklam, E. (2001). Validation of a method based on polymerase chain reaction for the detection of genetically modified organisms in various processed foodstuffs. European Food Research Technology 212, Lipp, M., Brodmann, P., Pietsch, K., Pauwels, J. and Anklam, E. (1999). IUPAC collaborative trial study of a method to detect genetically modified soy beans and maize in dried powder. Journal of AOAC International 82, Meyer, R. and Jaccaud, E. (1997). Detection of genetically modified soya in processed food products: development and validation of PCR assay for the specific detection of glyphosate-tolerant soybeans. In Amadò, R. Battaglia (Eds.). Proceedings of the ninth European conference on food chemistry (Vol. 1). Authenticity and adulteration of food-the analytical approach September Interlaken 1, ISBN: Murray, M.G. and Thompson, W.F. (1980). Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research 8, Poms, R.E., Glössl, J. and Foissy, H. (2001). Increased sensitivity for detection of specific target DNA in milk by concentration in milk fat. European Food Research Technology 213, Wagner, D.B., Furnier, G.R., Saghay-Maroof, M.A., Williams, S.M., Dancik, B.P. and Allard, R.W. (1987). Chloroplast DNA polymorphisms in lodgepole and jack pines

18 DNA Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması 18 and their hybrids. Proceedings of the National Academy of Science USA 84, Zimmermann, A., Lüthy, J. and Pauli, U. (1998). Quantitative and qualitative evaluation of nine different extraction methods for nucleic acids on soya bean food samples. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 207,