MEME KARSİNOMUNDA HER2/NEU DURUMUNU DEĞERLENDİRMEDE ALTERNATİF YÖNTEM: REAL TİME-PCR

Transkript

1 MEME KARSİNOMUNDA HER2/NEU DURUMUNU DEĞERLENDİRMEDE ALTERNATİF YÖNTEM: REAL TİME-PCR Nuket Eliyatkın Hakan Özgür Pınar Erçetin Safiye Aktaş Ali Küpelioğlu

2 Sunum Planı Meme Kanserinde HER2 nin yeri HER2 değerlendirme yöntemleri Çalışma Modeli Bulgular Sonuç

3 Meme Kanserinde HER2 nin yeri Klinik onkolojide hedefe yönelik tedavi Meme kanseri hastalarında trastuzumab kullanımı (HER2 ye karşı monoklonal ab) Trastuzumab, HER2+ ilerlemiş ve erken evre meme kanserinin tedavisinde monoterapi yada kombine uygulamada sağkalımda belirgin artış

4 HER2 değerlendirme yöntemleri Trastuzumab tedavisinden yarar görecek hastaların predikte edilmesi HER2 testinin doğruluğunun sağlanması American Society of Clinical Oncology (ASCO) ve College of American Pathologists (CAP), 2007, İHK ve İSH sonuçlarını tanımlayan algoritma

5 HER2 değerlendirme yöntemleri ASCO/CAP panelistlerinin bir kısmı İHK yetersiz İHK yada hem İHK hem de FİSH ile lokal ve merkezi uyumsuzluk oranları İSH yöntemi olarak öncü ve uzun süre FİSH Şimdilerde FİSH yerine CİSH veya SİSH CİSH ve SİSH avantajlı (solmayan kromojenik sinyal, daha az zaman, ışık mikroskobu, tekrar değerlendirilebilir, arşivlenebilir özellikte)

6 HER2 değerlendirme yöntemleri ASCO/CAP, geçerli HER2 testlerinin %20 kadarı preanalitik ve analitik değişkenlere göre doğru olmayabilir (protokoller, antikorlar veya problar) HER2 durumunu belirlemede gold standard yok Laboratuvarlar arasında HER2 testinin tekrarlanabilirliğinin sağlanması önemli Yeni HER2 test teknolojilerine gereksinim

7 RealTime PCR ın yeri FFPG dokuda, HER2 mrna seviyesinin Real Time PCR ile ölçülebilirliği Kişiler arası değişkenlik yok, standardize ve otomatize Hızlı, kolay, duyarlı, sensitif, spesifik ve kantitatif Gerekli doku örneği küçük (kalın iğne/insizyon)

8 ÇALIŞMANIN AMACI Meme ca da PCR temelli teknolojinin uygulanımını değerlendirmek amacıyla, HER2 durumunun öncelikle RealTime-PCR ile belirlenmesini ve İHK ve CİSH yöntemleri ile uyumunu değerlendirdik. Ayrıca özellikle, İHK 2+ ( kuşkulu) olgularda olmak üzere, RT-PCR ile değerlendirmenin, diğer yöntemlere göre güvenilir bir alternatif olabilirliğini saptamaya çalıştık.

9 Çalışma Modeli İnvaziv meme karsinomu tanısı almış altmış üç olgu H&E boyalı preparatlarda en tanıtıcı tümör içeren blok İHK ve CİSH için kesit RealTime-PCR değerlendirilmesi için bloktan tümör dokusu extrakte

10 Çalışma Modeli / İHK-CİSH İHK (Bioss) ile manuel, kontroller, ASCO/CAP önerilerine göre skorlama CİSH (İnvitrogen kiti), manuel, üretici firma protokolü, skorlama sistemi: Amplifikasyon yok (AN) Amplifikasyon pozitif, düşük (AP-D) Amplifikasyon negatif, yüksek (AP-Y)

11 Çalışma Modeli / Real Time-PCR RNA izolasyonunda Qiagen mirneasy FFPE Kiti, Parafinden uzaklaştırma, proteinaz K ile DNA nın ortaya çıkması, DNA az ilavesi ile DNA nın parçalanması, RNA ların üzerine RBC Buffer (RNA binding C buffer) ilavesi, yıkama aşaması

12 Çalışma Modeli / RT-PCR RNA ların parçalanmasını önlemek için RNaz-free water m-rna ları, c-dna ya dönüştürme c-dna yeterliliği (beta-aktin) HER2 prob uygulama c-dna larda Her2/referans gen konsantrasyonu oransal değeri 2 ve üzerinde RealTime-PCR pozitif 2 nin altı Real Time-PCR negatif

13 Bulgular Çalışmamıza alınan 63 olgu, İHK; tüm olgularda değerlendirme CİSH; 2 olgu (# 1 ve 30) değerlendirme dışı, biri (# 30) kalın iğne biopsisi niteliğinde, RT-PCR ile 3 olgu (# 26, 43 ve 45) sonuç alınamadı, biri (# 43) kalın iğne biopsisi, ikisi eksizyon materyali,

14 Olgu-H&E İnvaziv duktal ca İnvaziv kribriform ca

15 Olgu-H&E DCIS İnvaziv lobüler ca-lcis

16 Bulgular İHK: 24 ü 3+, 25 i 2+, 14 ü 0/1+ CİSH: 2 olgu (# 1 ve 30) değerlendirme dışı, ikisi İHK 2+, değerlendirilen 61 olgu; 25 olgu AP, 14 ü AP-Y, 11 i AP-D, 36 olgu AN,

17 Bulgular RT-PCR ile 3 olgu (#26,43 ve 45) değerlendirme dışı, İHK 2+ (#26 ve 43), biri İHK 1+ (#45), tümü CİSH negatif, Değerlendirilen 60 olgunun 33 ü RT-PCR pozitif, 27 si RT-PCR negatif, RT-PCR en düşük oran 0,08 (# 51), en yüksek oran 155,38 (# 36) # 51, İHK 0 ve CİSH te AN # 36, İHK +3 ve CİSH AP-Y

18 İHK ile CİSH sonuçlarının karşılaştırılması Ekspresyon 0/1+ (n=14 ) 2+ (n=25 ) 3+ (n=24 ) Amplifikasyon negatif Amplifikasyon pozitif 0 7 (5D/2Y) 18 (6D/12Y) İHK 3+ subgrup için % 75 (18 pozitif CİSH/24 İHK 3+: % 75) İHK 0/1+ subgrup için % 100 (14 negatif CİSH / 14 İHK 0/1+ : %100) İHK 2+ subgrup için % 69,56 (16 negatif CİSH/23 İHK2 +: %69,56) CİSH pozitif ve İHK olgu (# 8,14,16,17,18,19,20,21,22,27,29,31,34,35,36,49,53,57) AP (# 8, 20, 27, 29, 49, 53) AP-D CİSH pozitif ve İHK 2+ 7 olgu (# 4, 10, 33, 38, 54, 56, 62) AP (#33 ve 38) AP-Y

19 #39, İHK 2+, AN, RT-PCR (1,91), #39, İHK 20x2+, AN, RT-PCR (1,91), 20x

20 #39, İHK 2+, AN, RT-PCR (1,91), 40x #39, İHK 2+, AN, RT-PCR (1,91), 20x

21 #16, İHK 3+, AP-Y, RT-PCR + (6,15), 20x #16, İHK 3+, AP-Y, RT-PCR + (6,15), 20x

22 #16, İHK 3+, AP-Y, RT-PCR + (6,15), 4Ox

23 #18, İHK 3+, AP-Y, RT-PCR + (2,27), 20x

24 #18, İHK 3+, AP-Y, RT-PCR + (2,27), 40x

25 #18, İHK 3+, AP-Y, RT-PCR + (2,27), 40x

26 #54, İHK 2+,AP-D, RT-PCR (1,61), 20x

27 #54, İHK 2+, AP-D, RT-PCR (1,61), 40x

28 İHK ile PCR sonuçlarının karşılaştırılması Ekspresyon 0/1+ (n=14 ) 2+ (n=25 ) 3+ (n=24 ) Normal 13 (13AN) 13 (9AN/3LA/1HA) 1 (1AN) Artmış 0 10 (5AN/2LA/1HA) 23(5AN/6LA/12HA) İHK 3+ subgrup % 95,8 (23 pozitif RT-PCR/ 24 İHK 3+: % 95,8) (# 7) dışında tam bir uyum İHK 0/1+ subgrup % 100 (13 negatif RT-PCR / 13 İHK 0/1+ : %100) (#45 çalışılamadı) İHK 2+ subgrup % 56,5 (13 negatif RT-PCR/23 İHK 2+: %56,5) (#26 ve 43 RT-PCR çalışılamadı)

29 İHK2+ /RT-PCR+ **İHK 2+ ve RT-PCR + toplam 10 olgu genelde Her2/referans gen konsantrasyonu 2 ye çok yakın (# 33 için 13,62 ve CİSH YA) 5 olgu CİSH (#2, 9, 28, 42 ve 60) 3 olgu CİSH + (#4, 10 ve 33) (#1 ve 30) CİSH değerlendirilemedi

30 #33, İHK2+,YA,RT-PCR + (13,62)

31 #33,YA, RT-PCR (13,62)

32 CİSH ile PCR sonuçlarının karşılaştırılması Ekspresyon CISH+ (n=25) CISH - (n=36 ) Normal 4 (1YA/3DLA) 23 (1 İHK 3+/10 İHK2+/12 İHK 0/1+) (İHK 2+) Artmış 21 (13 YA/8DA) 10 (5 İHK 3+/5 İHK2+) (18 İHK 3+/3 İHK2+) CİSH + ve RT-PCR + olguların uyumu % 84 (21 RT-PCR +/25 CİSH +: % 84) CİSH+ ve RT-PCR+ 21 olgu 13 YA/8DA 3 (# 4, 10, 33) İHK 2+, RT-PCR sonucu 2 ye yakın 18 İHK 3+, RT-PCR sonucu genelde 3 ün üstü CİSH - ve RT-PCR olguların uyumu % 69,9 (23 RT-PCR -/33 CİSH - : % 69,69) 3 olgu (# 26, 43 ve 45) RT-PCR ile değerlendirilemedi 1 i İHK 3+, 10 u İHK 2+, 12 si İHK 0/1+

33 CİSH ile PCR sonuçlarının karşılaştırılması Ekspresyon CISH+ (n=25) CISH - (n=36 ) Normal 4 (1YA/3DA) 23 (1 İHK 3+/10 İHK2+/12 İHK 0/1+) (İHK 2+) Artmış 21 (13 YA/8DA) 10 (5 İHK 3+/5 İHK2+) (18 İHK 3+/3 İHK2+) CİSH + ve RT-PCR olan 4 olgu (# 38, 54, 56 ve 62) İHK 2+, bir olgu dışında (# 38) diğerleri düşük amplifikasyon 4 olgunun tümünde RT-PCR 1,31 in üzerinde CİSH ve RT-PCR + olan 10 olgunun (#2, 5, 9, 25, 28, 32, 42, 48, 55 ve 60), 5 İHK 3+ (# 5, 25, 32, 48, 55), 5 İHK 2+ (# 2, 9, 28, 42, 60) İHK 2+ olgularda RT-PCR biri dışında (# 42 için 4,93) 2 ye çok yakın (2,01-2,29). İHK 3+ olgularda RT-PCR sonuçları biri dışında (#5 için 2,02) 3 ün üzerinde (3,39-7,53)

34 SONUÇ Çalışmamızda, İHK ve RT-PCR değerlendirmeleri arasında, İHK 0/1+ % 100 (13 negatif RT-PCR / 13 İHK 0/1+ : %100) (#45 RT-PCR çalışılamadı) İHK 3+ % 95,8 (23 pozitif RT-PCR/ 24 İHK 3+: % 95,8) (# 7) dışında tam bir uyum İHK 2+ % 56,5 (13 negatif RT-PCR/23 İHK 2+: %56,5) (#26 ve 43 RT-PCR çalışılamadı)

35 #7,İHK 3+,AN, RT-PCR (1,65)

36 #7,İHK 3+,AN, RT-PCR (1,65)

37 #7,İHK 3+,AN, RT-PCR (1,65)

38 #7,İHK 3+,AN, RT-PCR (1,65)

39 SONUÇ İHK3+, CİSH 6 olgu (#5, 7, 25, 32, 48, 55) #7, RT-PCR -, diğerleri RT-PCR + RT-PCR ile pozitif ve İHK 2+ olgularda değer 2 ye çok yakın Çalışmamızda, İHK 2+ olgularda ve uyumsuz olgularda, CİSH ve RT- PCR yanı sıra ek değerlendirmeler yok Ek yöntem gerekli

40 SONUÇ İHK 0/1+ subgrup % 100 (14 negatif CİSH / 14 İHK 0/1+ : %100) İHK 3+ subgrup % 75 (18 pozitif CİSH/24 İHK 3+: % 75) İHK 2+ subgrup % 69,56 (16 negatif CİSH/23 İHK2 +: %69,56) İHK olgunun 18 i CİSH +, daha çok YA şeklinde (12 olgu) İHK olgunun 7 si CİSH +, daha çok DA şeklinde (5 olgu) İHK 3+ subgrupta; İHK ile CİSH uyumu % 75, İHK ile RT-PCR uyumu %95,8 Olasılıklar: CİSH uygulama hassas, kitin içeriğindeki reaktif ve ortam sıcaklığından yada ortam neminden etkilenme, nispeten subjektif, manuel uygulama

41 SONUÇ RT-PCR ın spesifik, yüksek duyarlılıkta, güvenilir, objektif ve tekrarlanabilir sonuçlar, uygun maliyet Maliyet analiz çalışmaları ile gelecekte ilk sırada yer alabilir Çok merkezli, valide edilmiş RT-PCR çalışmalarının gerekliliği unutulmamalı

42 KISITLILIKLAR Uygunsuz fiksasyon; uyumsuz olgularımızda mümkün, CİSH uygulama; manuel, hibridizasyon fırını kullanılmadı, Gerçek borderline HER2 durumu; uyumsuz olgularımızda mümkün, yalnızca hafif teknik duyarlılık değişiklikleri negatif yada pozitif olarak sonuçlandırabilir, İntratümör heterojenitesi; uyumsuz olguların bir kısmında mümkün, birbirine çok yakın tümör dokusunda yapılsa bile Polizomi; Dual CİSH ve FİSH uygulama yapılmadı

43 17 polizomi #32,İHK3+,RT-PCR +(4,51 )

44 17 polizomi #32,İHK3+,RT-PCR +(4,51

45 17 polizomi #32,İHK3+,RT-PCR +(4,51 )

46 KISITLILIKLAR (RT-PCR) RT-PCR çalışma prensiplerine göre nükleik asitlerin optimal nitelikte olması (uygun miktar ve sürede formalin fiksasyonu, doku enzimleri, depolanma süresi ve sıcaklığı) Tümör hücre komponentinin dilüe olması (stromal, inflamatuvar, normal epitelyal hücreler); HER2 mrna seviyeleri düşük seviyede (İHK 2 + ise RT-PCR değeri genelde 1,5 a çok yakın, İHK 0/1+ ise 1,5 un altında ve RT-PCR değeri 1 in altında olan olguların çoğu İHK 0/1+ olgulardan oluşmakta)

47 KISITLILIKLAR İHK 2+ olgularımız, diğer çalışmalarda da olduğu gibi diğer subgruplardan daha heterojen nitelik göstermekte Özellikle İHK 2+ subgrup olmak üzere uyumsuz tüm olgularda dual CİSH, FİSH, SİSH yanı sıra alternatif İHK değerlendirmeler de yapılması uygun olacak Biz de tüm İHK 2+ olgularımızı ve uyumsuz tüm olgularımızı ek bütçe bularak bu gibi ek değerlendirmeleri yapmak niyetindeyiz.