İSHALLİ DIŞKI ÖRNEKLERİNDE CRYPTOSPORIDIUM SP. ANTİJENİNİN ELISA YÖNTEMİ İLE ARAŞTIRILMASI

Ebat: px
Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "İSHALLİ DIŞKI ÖRNEKLERİNDE CRYPTOSPORIDIUM SP. ANTİJENİNİN ELISA YÖNTEMİ İLE ARAŞTIRILMASI"

Transkript

1 T.C ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ PARAZİTOLOJİ ANABİLİM DALI İSHALLİ DIŞKI ÖRNEKLERİNDE CRYPTOSPORIDIUM SP. ANTİJENİNİN ELISA YÖNTEMİ İLE ARAŞTIRILMASI YÜKSEK LİSANS TEZİ Güllü ELGÜN DANIŞMANI Prof. Dr. İsmail Soner KOLTAŞ ADANA-2009

2 T.C ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ PARAZİTOLOJİ ANABİLİM DALI İSHALLİ DIŞKI ÖRNEKLERİNDE CRYPTOSPORIDIUM SP. ANTİJENİNİN ELISA YÖNTEMİ İLE ARAŞTIRILMASI YÜKSEK LİSANS TEZİ Güllü ELGÜN DANIŞMANI Prof. Dr. İsmail Soner KOLTAŞ Bu tez, Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından TF.2007.YL.7 nolu proje ile desteklenmiştir. ADANA-2009

3 TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim süresince bilgi ve tecrübelerini esirgemeyen, tez konumun seçimi ve yürütülmesinde teorik ve pratik deneyimlerinden faydalandığım tez danışmanım Parazitoloji Anabilim Dalı Başkanı Prof.Dr. İsmail Soner KOLTAŞ a teşekkür ederim. Bu tezin oluşumunda ve örneklerin toplanmasında bana yardımcı olan Adana Numune Hastanesi, Mikrobiyoloji Laboratuarı sorumlusu Uz.Dr. Pamir CANPOLAT a ve diğer laboratuar çalışanlarına teşekkür ederim. Ayrıca yüksek lisans eğitimim boyunca beni destekleyen ve çalışmalarıma katkısı bulunan Parazitoloji Anabilim Dalı çalışanlarına teşekkür ederim. Tez çalışmasını TF.2007.YL.7 no lu proje ile destekleyen Ç.Ü.Rektörlüğü Bilimsel Araştırma Projeleri Birimine de teşekkür erdim. Biyolog Güllü ELGÜN ii

4 İÇİNDEKİLER Sayfa No KABUL VE ONAY...i TEŞEKKÜR.. ii İÇİNDEKİLER.....iii ŞEKİLLER DİZİNİ...v ÇİZELGELER DİZİNİ.... vi ÖZET...vii ABSTRACT.. viii 1.GİRİŞ..1 2.GENEL BİLGİLER Cryptosporidium sp Cryptosporidium un Sınıflaması Cryptosporidium un Yapısı ve Yaşam Döngüsü Ekskistasyon Dönemi MerogoniDönemi Gametogoni Dönemi DöllenmeDönemi Ookist Dönemi Sporogoni Dönemi Epidemiyolojisi Bulaşma Yolları Patogenez İmmünolojisi Kriptosporidyoz Olgularında Klinik Tanısı Enterik Kriptosporidyoz Kolesistit Solunum Sistemi Enfeksiyonu Kriptosporidyoz Olgularında Laboratuar Tanısı Doğrudan Mikroskobi Modifiye Asit-Fast Boyama Lugollü Preparat İnceleme Giemsa Boyama Serolojik Yöntemler iii

5 DFA(Direkt Immunfloresans Tekniği) EIA (Enzim Immunassay) Hızlı Immunokromatografik Yöntemler Moleküler Yöntemler Kültür Yöntemleri Tedavisi İmmun Sistemi Sağlam Kişilerde Tedavi İmmun Sistemi Baskılanmış Kişilerde Tedavi Korunma GEREÇ VE YÖNTEM Gereçler Örneklerin Toplanması Yöntemler Modifiye Asit-Fast Boyama Yöntemi Gerekli Eriyikler BoyamaYöntemi Parazitolojik İnceleme Yöntemi ELISA Testi Örneklerin Hazırlanması Yıkama Solüsyonunun Hazırlanması Yöntemi BULGULAR TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ.. 37 iv

6 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil.1.Ookistlerin Parçalanmasıyla Serbest Kalan Enfektif Sporozoitler...5 Şekil.2.Cryptosporidium un Ookisti. 6 Şekil.3.Cryptosporidium un Yaşam Döngüsü..7 Şekil.4.Cryptosporidium un evrimi ve evrim şekilleri.8 Şekil.5.Modifiye Asit-Fast Boyama Sonucu Ookistlerin Mikroskobik Görüntüsü...20 Şekil.6.Cryptosporidium Microwell ELISA kiti. 21 Şekil.7.Cryptosporidium sp. nin Ookistlerinin modifiye Asit-Fast Boyamadaki Görünümü..23 Şekil.8.ELISA Plağında pozitif ve negatif kuyuların görünümü (İlk 96 Hastanın Sonucu) Şekil.9.ELISA Plağında pozitif ve negatif kuyuların görünümü (Son 58 Hastanın Sonucu)...26 v

7 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge.1.Çalışma Gruplarındaki Kadın ve Erkek Oranı Çizelge.2.Modifiye Asit-Fast Boyama Yöntemi ile Cryptosporidium Ookistlerinin Saptandığı Hastaların Gruplara Göre Dağılımı.. 23 Çizelge.3.Lugollü Preparatlarda Görülen Parazit Türlerinin Dağılımı...24 Çizelge.4.Cryptosporidium sp. ELISA Antijen Testinin Pozitifliğinin Yaş Gruplarına Göre Dağılımı Çizelge.5.Mikroskobi ile ELISA Sonuçlarının Karşılaştırılması...27 Çizelge.6.Bazı Ülkelerde Cryptosporidium ile ilgili Yapılan Çalışmalar...31 Çizelge.7.Ülkemizde Cryptosporidium ile ilgili Yapılan Bazı Çalışmalar...32 vi

8 ÖZET İSHALLİ DIŞKI ÖRNEKLERİNDE CRYPTOSPORIDIUM SP. ANTİJENİNİN ELISA YÖNTEMİ İLE ARAŞTIRILMASI Cryptosporidium türleri gelişmekte olan ve gelişmiş ülkelerde ishale neden olan parazitler arasında önemli bir yere sahiptir. Özellikle bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerde ölümcül ishallere neden olabilmektedir. Ayrıca içme sularıyla bulaşma olduğu için halk sağlığını tehdit edebilmektedir. Bu çalışmada Cryptosporidium sp. nin saptanması için iki yöntem kullanıldı. Mikroskobi ile elde edilen sonuçlar dışkıda özgül antijen arama yöntemi ile karşılaştırılarak ELISA yönteminin etkensel tanıya katkı sağlayıp sağlamadığı araştırılmıştır. Bu çalışmada, Ekim 2007 ve Temmuz 2008 tarihleri arasında Adana Numune Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı na ve Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi ne bağlı kliniklerden Parazitoloji Anabilim Dalına ishal şikayetiyle başvuran yaşları 0-86 arasında değişen toplam 154 dışkı örneklerinde ELISA yöntemi ile Cryptosporidium sp. antijeni ve modifiye asit-fast boyama yöntemi ile ookistlerin varlığı araştırıldı. Toplam 8 örnekte modifiye asit-fast ile pozitiflik saptanırken, ELISA ile 37 örnekte pozitiflik saptanmıştır. Sonuç olarak, dışkıda özgül antijen arayan ELISA nın maliyeti yüksek olmasına rağmen etkensel tanı yöntemlerindeki zorluklara yardımcı olduğu görülmektedir. Anahtar sözcükler: Cryptosporidium sp. ELISA, ishal, modifiye asit-fast. vii

9 ABSTRACT INVESTIGATION OF CRYPTOSPORIDIUM SP. ANTIGEN BY ELISA METHOD IN STOOL SPECIMENS WITH DIARRHEA Cryptosporidium sp. are important agents causing diarrhea in developing and developed countries. The agent causes severe life-threatening diarrhea especially in immunocompromised hosts. Furthermore, transmission of Cryptosporidium sp. by of drinking water threats public health. In this study, two methods are used for determining Cryptosporidium sp. Microscopy and specific antigen detection methods are compared. Investigation of specific antigen by ELISA method in stool is investigated for contributing or not diagnosis of Cryptosporidium sp. In this study, 154 stool specimens taken from patients- between 0 to 86 ages with diarrhea applied to Microbiology Laboratory, Adana Numune Research Hospital and Department of Parasitology, Balcalı Hospital of Çukurova University in Adana were investigated for Cryptosporidium sp. antigen by ELISA and oocysts via modified acid-fast staining, between October 2007 and July Eight specimens were found to be positive by modified acid-fast staining; but thirty seven specimens were found to be positif by ELISA method. In conclusion, although ELISA which investigates specific antigen in stool samples is a costly method, it has been seen that it helps to methods for diagnosis of agents. Key words: Cryptosporidium spp. diarrhea, ELISA, modified acid-fast. viii

10 1.GİRİŞ Cryptosporidium cinsi protozoonlar, dünyada yaygın olan küçük koksidya parazitlerdir. Omurgalıların sindirim ve solunum yollarını kaplayan epitel hücrelerinin mikrovillus bölgesine yerleşerek infeksiyona neden olurlar. Özellikle gelişmekte olan ülkelerde çocuklar, beslenme yetersizliği olanlar ve immun sistemi baskılanmış kişiler bu parazit ile infeksiyona duyarlıdır. Sağlıklı kişilerde asemptomatik infeksiyona veya kendiliğinden geçen ishallere neden olurken, immun yetmezliği olan kişilerde ağır seyirli kronik ishal, karın ağrısı, bulantı, kusma, subfebril ateş, halsizlik, kilo kaybı, pankreas, safra, mide, özefagus ve solunum yolu infeksiyonlarına neden olabilmekte ve hastalık ölümle sonlanabilmektedir. Bugüne kadar bu cinse ait, memeli omurgalılardan, kuşlardan, sürüngenlerden ve balıkların değişik türlerinden 20 ayrı tür izole edilmiştir. En çok tanınanları C.parvum, C.baileyi ve C. muris tir 1-5, 8-11, 13-15, 25. İnsanlardaki infeksiyonlardan genellikle Cryptosporidium parvum sorumlu olup, bu tür diğer omurgalı hayvanlarda da infeksiyon oluşturmaktadır. Cryptosporidium parvum. dışında C.felis (kedi türü), C. canis (köpek türü), C. meleagridis (kuş türü) ve C. muris (fare türü) immun sistemi baskılanmış insanlarda infeksiyon oluşturduğu bildirilmiştir 3,8,10,13,18,25. C.parvum, tüm yaşam döngüsünü tek bir konakta geçirme yeteneğine sahiptir. C. parvum, 4-6 µm büyüklüğündeki infektif şekil ookistlerin insandan insana fekal-oral yolla, hayvandan insana (özellikle evcil hayvanlar birincil konaklardır) ve dışkı ile kirlenmiş yüzme havuzları, yiyecekler, eşyalar, olası hava yoluyla, toprak ve taşıyıcı konaklarla (arthropodlar, kuşlar) dolaylı yollardan alınması sonucu bulaşmaktadır 5,6,8, Hastaneler, huzurevleri ve çocuk yuvaları gibi kalabalık ortamlarda bulaşmanın daha sık olduğu ve infeksiyonun çocuklarda yetişkinlere göre daha fazla görüldüğü belirtilmektedir 9. Cryptosporidium infeksiyonlarında etiyolojik tanı dışkı, balgam ve safra örneklerinde parazitin ookistlerinin veya biyopsi materyalinde değişik gelişim dönemlerinden birinin görülmesiyle konabilmektedir. Bu incelemelerde yoğunlaştırma veya boyama yöntemleri (Modifiye Asit-Fast, Safranin, Auramin, İyot, Metilen Mavisi veya Giemsa) ile ookistler araştırılabilir. Serolojik testlerden İndirekt Fluoresan Antikor (İFA) testi ve dışkıdaki antijenleri saptamak için Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) veya Direct Immunofluorescent Assay (DFA) gibi yöntemler de kullanılmaktadır 5, 15-18, 26. 1

11 Bu çalışmada, Cryptosporidium için epidemiyolojik koşulların uygun olduğunu düşündüğümüz Adana da, Sağlık Bakanlığına bağlı Numune Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı na ve Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi ne bağlı kliniklerden Parazitoloji Anabilim Dalı Laboratuvarı na ishal şikayeti nedeniyle gönderilen farklı yaş grubundaki hastalarda Cryptosporidium sp. antijenlerinin ELISA yöntemiyle araştırılması ve modifiye asit-fast ile boyanmış preparatların mikroskobi sonuçlarının ELISA sonuçlarıyla karşılaştırılması amaçlanmıştır. 2

12 2. GENEL BİLGİLER Cryptosporidium sp. özellikle bağışık yanıtı baskı altında olan insanlarda sindirim ve solunum yolları infeksiyonu yapması ile dikkati çekmektedir 10, CRYPTOSPORIDIUM SP. Cryptosporidium, dünyada yaygın olan, 4-6 µm çapında, küçük koksidian protozoonlarındandır. Parazitin; memeli omurgalılardan, kuşlardan, sürüngenlerden ve balıkların değişik türlerinden 20 kadar türü izole edilmiştir. Son yıllarda AIDS li hastalarda yaygın olarak tespit edilmesiyle birlikte Cryptosporidium un insan sağlığı açısından önemi ortaya konmaya başlamıştır. İnsanlardan ve birçok memelilerden izole edilen Cryptosporidium türü Cryptosporidium parvum dur 4, 24. Cryptosporidium ilk kez 1895 yılında Clarke tarafından fark edilerek fare mide epiteli üzerinde yer alan spor kümeleri şeklinde tarif edilmiş ve bundan yaklaşık 12 yıl sonra 1907 yılında Tyzzer tanımlamış ve 1910 yılında Cryptosporidium muris adı ile hem cinsi hem de türünü tarif etmiş ve evrimini açıklamıştır de Cryptosporidium parvum u bildirmiştir. Önceden bilinen koksidia parazitlerinin aksine ookistlerin içindeki sporozoitleri çevreleyen sporokistlerin olmaması nedeni ile Cryptosporidium (gizli sporokistler) olarak isimlendirilmiştir 8,19, 20, 25. İlk insan olguları 1976 yılında, gastroenteritli 3 yaşındaki bir kızda ve daha sonra da immun sistemi baskılayıcı ilaç kullanan bir çiftçide görülmüş olup, bu olgu bir çiftlikte yaşayan hayvanlarda saptanan infeksiyonla aynı zamanda ortaya çıkmıştır. Bu nedenle Kriptosporidyoz un bir zoonoz olabileceği düşünülmüştür yıllarında ise AIDS li hastalarda Cryptosporidium infeksiyonları saptanmış ve şiddetli enterite neden olduğu bildirilmiştir. Bu kişilerde görülen uzun süreli, sıklıkla bol sulu dışkı, zayıflama gibi belirtiler infeksiyonun fırsatçı patojen olabileceğini düşündürmüştür. Daha sonraki yıllarda yayımlanan araştırmalarda hayvan bakıcılarında, turistlerde ve bağışıklığı sağlam kişilerde de salgınlara neden olduğu bildirilmiştir 1,8,12,18,

13 2.2. CRYPTOSPORIDIUM UN SINIFLAMASI Dünya Sağlık Örgütünce Cryptosporidium un sınıflaması şöyledir 8. Alem: Protista Altalem: Protozoa Şube: Apicomplexa Sınıf: Sporozoasida Altsınıf: Coccidiosina Takım: Eucoccidiorida Alttakım: Eimeriorina Aile: Cryptosporidiidae Cins: Cryptosporidium 2.3. CRYPTOSPORIDIUM UN YAPISI VE YAŞAM DÖNGÜSÜ Cryptosporidium un gelişmesi, mide ve bağırsak mukoza epiteli hücrelerinin fırça kenarları içinde olur. Yerleşim yeri nedeniyle diğer hücre içi parazitlerden ayrılır. Çünkü, onlar hücrenin sitoplazması içinde yerleşirken, Cryptosporidium hücrenin ekzositoplazmik alanında yerleşir ve birbirini izleyen eşeyli ve eşeysiz üremeyle çoğalır. Yaşam döngüsünü tek bir konakta tamamlar. Parazitin yerleştiği ve konak hücre orjinli bölgeye parazitoforoz vaküol denir 4, 8, 16, 20, 25. Cryptosporidium türlerinin yapısı evrim şekillerine göre değişmektedir. Bunun evriminde merogoni, gametogoni, döllenme, ookistli duvar oluşumu, sporogoni ve sporozoitlerin bağırsakta serbest kalması (ekskistasyon) gibi altı farklı olay vardır 8, 19, Ekskistasyon Dönemi: Ağız yoluyla alınan kalın duvarlı sporlanmış ookistlerin çeperlerinin ince bağırsakta safra tuzları ve pankreans enzimlerin yardımıyla parçalanması (ekskistasyon) sonucunda sporozoitler serbest kalmakta ve bağırsak boşluğuna dökülmektedir 8. 4

14 Şekil.1.Ookistlerin parçalanmasıyla serbest kalan enfektif sporozoitler Merogoni Dönemi: Serbest kalan sporozoitler konağın epitel hücreleri (enterosit) içine girmektedirler. Bu hücrelerin mikrovillus bölgesinde parazitofor vakuoller içinde trofozoitlere (tek nukleuslu merontlara ) dönüşmekte ve daha sonra eşeysiz olarak (merogoni) çoğalarak Tip 1 merontları oluşturmaktadırlar. Tip 1 merontlar 6-8 çekirdeklidir ve her birinden 6-8 meozoit oluşur. Bu merozoitler yeni hücrelere girerek tekrar eşeysiz çoğalama ile Tip 1 merontları veya Tip2 merontları oluşturmaktadırlar 5,8, Gametogoni Dönemi: Tip 2 merontlardan oluşan merozoitler ise yeni bir döngü oluşturmazlar. Bunlardan oluşan merozoitler mikrogametosite, sonra mikrogamete, bazı merozoitler ise makrogametosite sonra makrogamete dönüşürler 8, 18, Döllenme Dönemi: Kamçısız, fakat hareketli mikrogamet, makrogameti döller ve sonucunda zigot oluşur 5, Ookist Dönemi: Zigot duvarının kalınlaşmasıyla parazitin bir konaktan diğerine bulaşmasını sağlayacak olan, dış çevre koşullarına dayanıklı ookist oluşmaktadır. Ookistler, 4-6 µm büyüklüğünde oval yapılardır. Ookistlerin %80 i kalın duvarlı, %20 si ince duvarlıdır 4, 8, 18, 27. 5

15 Şekil.2. Cryptosporidium un. Ookisti (1000 büyütme, modifiye asit-fast boyama) Sporogoni Dönemi: Ookist içinde sporlanma ile 4 infektif sporozoit (4.9 x 1.2 µm büyüklüğünde, çekirdekleri 1/3 arka kısımdadır ve hücre çeperi 50 nm kalınlığında olup düz ve renksizdir) oluşur 8, 19. Kalın duvarlı ookistler dışkı ile dışarı atılır ve yeni konaklarda infeksiyonun bulaşmasını sağlarlar. İnce duvarlı olanlar ise konak hücreden ayrılmalarından hemen sonra içlerindeki sporozoitler bağırsak boşluğunda serbest kalır ve diğer enterositlere girerler ve yeni bir yaşam döngüsü başlatırlar. Bu otoinfektif ookistlerin ve Tip 1 merontların az sayıda ookistle infekte olan kişilerde, şiddetli enfeksiyonların gelişiminden sorumlu olmaktadırlar. Bağışıklığı baskılanmış kişilerde ise etken dışarıdan yeniden alınmasa da, uzun süren ve hastanın yaşamını tehlikeye düşürebilen tabloların ortaya çıkmasına neden olabilecekleri düşünülmektedir 8, 18, 19, 27. 6

16 Şekil.3. Crptosporidium un yaşam döngüsü 43 7

17 Şekil.4. Cryptosporidium un evrimi ve evrim şekilleri 43 Vücuda ookist alındıktan sonra dışkıda ookistlerin görülmeye başlama süresi insanlarda 5-21, sığırlarda 2-7, kedilerde 5-10 gündür KRİPTOSPORİDYOZ UN EPİDEMİYOLOJİSİ Kriptosporidyoz, evcil hayvanlardan insana bulaşabilen dünyada yaygın olan bir zoonoz hastalıktır. İnsandan insana da bulaşma olmaktadır. Su kaynaklı epidemiler de görülmektedir. Su kaynaklı epidemilere neden olarak; parazitin kaynak sularındaki prevalansının yüksek olması, klora dirençli olması, içme suyu süzgeçlerinden lerinden geçebilmesi ve çok az sayıda parazitin bile infeksiyona neden olabilmesi ile gösterilmektedir. Sessiz infeksiyonlular ve hastalık bittikten sonra hala ookist saçanlar bulaştırıcıdırlar. Bu parazitoza çocukların, erişkinlerden; anne sütü ile beslenmeyenlerin, anne sütü ile beslenenlerden daha sık yakalandıkları saptanmıştır. Ayrıca, ookistlerle pislenen çiğ süt, immun sistemin yetersizliği, yaş, meslek, beslenme 8

18 bozukluğu ve infekte kişilerle yakın temas, risk faktörlerini oluşturmaktadır. İnfeksiyon yaz ve sonbaharda daha sık görülmektedir 4, 5, 17, 19, 24. Endüstrileşmiş toplumlarda seroprevalans <%35, gelişmekte olan ülkelerde ise <%100 olarak bildirilmektedir. Adana da Ç.Ü. Parazitoloji Anabilim Dalımızda yapılan ülkemizdeki ilk çalışmada; ishalli çocuklarda %8.20, normal çocuklarda %4.08 olarak bulunmuştur. Mersin de dört ilköğretim okulunda, yaşları 8-12 olan çocuklardan toplanan 72 dışkı örneğinin 4 ünde (%5.5) Cryptosporidium ookistleri görülmüştür. Yine Elazığ da yapılan bir çalışmada, 0-5 yaş grubu immün yetmezliği olmayan 417 ishalli olgu ele alınmış ve 19 unda (%4.55) Cryptosporidium ookistleri saptanmıştır. Hindistanda yapılan çalışmada 89 dışkı örneğinin 11 inde (%12.35) görülmüştür. Mısır da yapılan çalışmada ise 1050 dışkı örneğinin 100 ünde (%9.5), Amerika Birleşik Devleti, Milwaukee de 129 dışkı örneğinin 55 inde (%42.63), Florida da 84 çocuğun 33 ünde (%39.28), Minnesota da 296 dışkı örneğinin 100 ünde (%33.78), Santiago da 105 dışkı örneğinin 58 inde (%55.23) görülmüştür 4, 16, 28-33, 36, BULAŞMA YOLLARI 1. İnsandan insana (Risk altındaki kişilerle aynı evde yaşayanlar, cinsel temasta bulunduğu kişiler, sağlık çalışanları, zirai ve veteriner çalışanları, endemik bölgelere seyahat ve kreş çocuklarıdır) 8, 25, 36, Hayvandan hayvana. 3.Ev hayvanları, laboratuar hayvanları ve çiftlik hayvanlarının hepsinden insanlara bulaşma olmaktadır 8, Oookistlerin işlenmemiş atık sular, yer altı suları ve içme suyunda, yüzey suları ve işlenmiş içme suyunda bulunması. Havuz sularıyla bulaş özellikle küçük çocuk havuzlarının dışkı ile kontaminasyonu sonucunda görülür. 5.Temizliğine dikkat edilmeyerek hazırlanan sosis, sucuk, sakatat ve çiğ süt gibi tüketilen belirli gıdalarla bulaşın görülebileceği bildirilmiştir. 6. İmmun yetmezliği olan hastalarda ve AIDS lilerde solunum yoluyla bulaşma olmaktadır. 7. Toprak ve arthropodlar, kuşlar gibi taşıyıcı konaklarla bulaşma olabilmektedir 8,18, 37, 43. 9

19 2.6. PATOGENEZİ Kriptosporidyoz, bir zoonoz hastalıktır. Parazit bağırsak epitel hücrelerini tutmakta ve en çok jejunumda yerleşmektedir. Ancak, bazı hastalarda Cryptosporidium; yutak, mide ve kalın bağırsakta da gösterilmiştir. Otuzdan az sayıda ookistin bile sağlıklı gönüllülerde infeksiyona neden olduğu bulunmuş olup, ortalama infektif doz 132 ookisttir. Safra kesesini tutarsa; tıkanma, kolenjit veya kolesistit gelişebilmektedir. Kript ve villöz yapıda histolojik bozukluklar ortaya çıkar. Villöz atrofi, kriptlerin uzaması ve lamina propriada tek çekirdekli hücre birikimi görülür. Solunum sistemini de tutabilmektedir 4, 25, 36, 37. İshalin patofizyolojisi tam olarak açıklanamamıştır. Sonuçta oluşan ishalin hem tanımlanamayan bir toksin nedeni ile hem de bağırsak villuslarında hasar ile oluşan malabsorpsiyon nedeni ile olduğu var sayılmaktadır. Üç ana mekanizmanın etkili olduğu düşünülmektedir. 1. Doğrudan sitotoksik etkiyle bağırsak yapısının bozulması. 2-Konak immun yanıtının bir parçası olarak, inflamatuar metabolit ve hormonların salınımı. 3- Parazitin enterotoksik özellik göstermesi 15, 25, İMMÜNOLOJİSİ Kriptosporidyozda immun yanıt tam anlaşılamamıştır. Cryptosporidium ile infekte kişilerin serumlarında IgG, IgM ve IgA tipi antikorlar bulunur. Hem T hücre anormallikleri hem de γ-globülin eksikliklerini içeren, çeşitli immün yetmezlikleri olan hastalarda, uzamış ve daha ciddi infeksiyonlar vardır. Özellikle AIDS li hastalarda CD4+ hücre sayısı immun sistemin mukoza yüzeyinde Cryptosporidium infeksiyonunu temizleme yeteneği için en iyi göstergedir. CD4+ hücre sayısı 180 hücre mm³ ten yüksek olan kişilerde infeksiyon spontan temizlenebilirken, 180 den az olanlarda %87 oranında persistan hastalık oluşur. CD4+ hücre sayısının 50 hücre mm³ ün altında olduğu durumlarda ölüm riski vardır 25,36.Yaşlı hayvanların, gençlere oranla, kriptosporidyoza dirençli olduğu bilinmekte ve bu durumun önceden geçirilen infeksiyonun verdiği bağışıklıkla ilgili olduğu, fakat yaşlanma sonucu bu direncin de 10

20 gelişebildiği bildirilmektedir. Kazanılmış immünite, reinfeksiyonu önleyebilir ve primer infeksiyonu sınırlar ama koruma mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır 19, 34, 36. Cryptosporidium parvum ile süt emen fare, keme, pamuk kemesi, kobay ve hamsterlerde ağızdan ookist verilince ağır enfeksiyon olduğu halde bu hayvanların erişkinlerinde ya infeksiyon yerleşememekte veya hafif bir kriptosporidyoz olmaktadır. Timüssüz süt emen farelerde, Cryptosporidium parvum infeksiyonu sürgüne neden olmakta ve ölünceye kadar ookist saçtıkları halde normal kardeşleri sürgüne tutulmakta ve ancak gün ookist çıkarmaktadırlar. Bu durum insanda da vardır. AIDS olgularında infeksiyon süregen ve öldürücü mide-bağırsak, karaciğer ve solunum yolu hastalığına neden olduğu halde bağışık yanıtı normal olanlarda hastalık 1-2 hafta sürmektedir. Ayrıca, normal T lenfositli, fakat hipogammaglobülinlerde de öldürücü infeksiyon gelişebilmektedir. Bundan dolayı hastalıktan iyileşmede bağırsakta A ve G immunoglobulinleri ve hücre aracılığıyla olan bağışıklığın ortaklaşa etkisi kabul edilmektedir KRİPTOSPORİDYOZ OLGULARUNDA KLİNİK TANI Enterik kriptosporidyoz, hasta populasyonunda en sık rastlanan klinik görünümdür. Ayrıca immunkompromize hastalarda Cryptosporidium parvuma a bağlı kolesistit veya solunum sistemi infeksiyonlar olabilir. Belirtisiz infeksiyon da bildirilmiştir Enterik Kriptosporidyoz: Ookistlerin alımından bulguların başlamasına kadar ortalama 5-7 gün geçer. Bulgular immunkompetan ve immunkompromize hastalarda benzerdir ama kompromize hastalarda uzamakta ve daha ciddi olmaktadır. Hastalar, ciddi dehidrasyona yol açan, günde 17 litreye varabilen değişik miktarlarda sulu ishalden yakınırlar. Karında kramplar, kırıklık, hafif ateş ve iştahsızlık sıklıkla bildirilir. Bulantı, kusma, baş ağrısı, kilo kaybı ve kabızlık da gelişebilir. Normal konaklarda birkaç ayda sonlanan olgular bildirilmiş olmakla beraber, immunkompetan konaklarda semptomlar genellikle kendini sınırlar, 5-14 günde sonlanır. Ookistler, bulguların düzelmesinden sonra iki hafta daha dışkıda bulunabilir. Dışkı örneklerinde genellikle eritrosit, lökosit bulunmaz, mukus olabilir 5, 16, 19,

21 2.8.2.Kolesistit: Kriptosporidyozlu AIDS li hastaların %10 unda kolesistit ortaya çıkar. Kriptosporidya kolesistiti şimdiye kadar sadece AIDS li hastalarda tanımlanmıştır. Hastalarda ateş, sağ üst kadran ağrısı, ishal ile birlikte veya ishal olmaksızın bulantı ve kusma vardır Solunum Sistemi İnfeksiyonu: Süregen öksürük, nefes darlığı, bronş ve akciğer yangısı olarak kendini belli eder. Solunum sistemi bulgusu, Cryptosporidium parvum un ishalli hastalığı ile doğrudan ilişkilendirilememiştir 19, KRİPTOSPORİDYOZ OLGULARINDA LABORATUVAR TANISI Cryptosporidium infeksiyonun tanısı çoğunlukla dışkı örneklerinde ookistlerin tanımlanmasıyla yapılmaktadır. Ayrıca balgam, duodenum sıvısı ve bağırsak biyopsi örneklerinde de araştırılmalıdır. Dışkı taze iken veya %10 formalin veya polivynil alkol ile tesbit edildikten sonra incelenmelidir. Ookistler, modifiye çinko sülfat santrifüj veya Scheather s şeker yüzdürme yöntemleriyle yoğunlaştırılıp faz kontrast mikroskobu ile incelendiğinde iyi sonuçlar alınmaktadır. Boyama yöntemleri kullanılarak tanısı konabilmektedir 1, 4, 5, DOĞRUDAN MİKROSKOBİ Modifiye Asit-Fast Boyama: Örnekler modifiye asit-fast yöntemiyle boyanabilmektedir. Bu boya ile ookistler, kırmızı boyanırken dışkıdaki mayalar yeşil renkte boyanırlar. Karşıt boya olarak metilen mavisi kullanılırsa, Cryptosporidium ookistleri kırmızı, mayalar mavi renkte boyanır 1, Lugollü Preparat İnceleme: Lugollü preparatlarda ise ookist renksiz ve mayalar kahverengi boyanmış olarak görülür Giemsa Boyama: Cryptosporidium, havada kurutulduktan ve metanolde tesbit edildikten sonra, giemsa boyası ile boyanan dışkı preparatında da aranabilir. Mikroskobik inceleme deneyimli mikroskopist ve yoğun laboratuar çalışması gerektirmektedir 1,4. 12

22 SEROLOJİK YÖNTEMLER Alternatif olarak doğrudan floresan antikor (DFA), enzim immunassay (EIA) ve benzeri hızlı tanı testleri gibi antijen arama testleri geliştirilmiş ve kullanılmaktadır. Kriptosporidyoz tanısı için ticari olarak elde edilebilen ürünlerden DFA, IFA, EIA ve hızlı testler mevcuttur 7, DFA (Doğrudan Immunfloresans Tekniği): Dışkı örneklerindeki organizmaların yüzeyindeki antijenlerin immünolojik olarak saptanmasında kullanılan monoklonal antikor temeline dayalı DFA yöntemi Kriptosporidyoz un tanısında günümüzde seçkin bir yöntemdir. Bu yöntemde şüpheli materyaldeki antijenler lam üzerine yayılarak tesbit edilir ve antijenin üzerine özel işaretli antikorlar konulur. Şüpheli antijenlerin işaretli özel antikorların oluşmasına neden olmuş olan antijenler olup olmadığı araştırılır EIA (Enzim Immunassay): Serolojik tanı yöntemi olarak 1980 den sonra kullanılmaya başlanan ELISA yöntemi, bir hemaglutinasyon plağı çukuru içinde oluşturulan antijen antikor kompleksi üzerine, enzim ile işaretli anti insan IgG, IgM ve diğer antikorların konması ve substratın eklenmesiyle pozitif olgularda renk oluşmasının gözlenmesi esasına dayanan ve parazit hastalıklarının tanısında güvenilir ve klinik araştırmalar sonucu EIA kitlerinin duyarlılığı ve özgüllüğü % arasında bildirilmiştir. EIA testlerinin yalancı pozitif sonuçlar vermesi en önemli sorundur 7, Hızlı Immunokromatografik Yöntemler: Bu yöntemler kombine antijen taraması yapabilirler. Bu yöntemin en büyük avantajı, kısa test süresine sahip olması ve aynı reaksiyonda birden fazla sonuç vermesidir MOLEKÜLER YÖNTEMLER Moleküler tanı yöntemlerinden Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) analizinden de Cryptosporidium tanısında faydalanılır. Bunun için immun sistemi baskılanmış hastalar, yüksek riskli kişiler veya hayvanlardan ookist ile kontamine olmuş dışkı örnekleri seçilir. Bu örneklerden ookistler temizlenir ve onların DNA ları çıkartılır. Bu DNA lar, 13

23 PZR analizi kullanarak RNA nın 18s lik gen bölgesindeki Cryptosporidium türlerini tanımlamak için kullanılır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) tanıyı doğrulamak ve tür ayrımı yapılabilmesi için bir basamak olarak son yıllarda giderek daha fazla kullanılan bir yöntem olmuştur 36, 52, KÜLTÜR YÜNTEMLERİ Cryptosporidium un konak hücre ortamındaki gelişimi ilk olarak 2004 yılında tanımlanmıştır. Bu da Cryptosporidium araştırmalarında birçok görüşü kolaylaştırabilecek önemli bir adım olmuştur. Mevcut konak hücre kültürlerinde parazitin tüm evrim dönemlerini görmek mümkündür; ancak çok küçük boyutlarda olduğu için yapısının tanımlanması zordur. Kültürler, 37 C de ve %5 lik karbondioksitli ortamda inkübasyona bırakılır ve 48 veya 72 saat sonra alınır. Çeşitli floresan boyama yöntemleri işlemlerinde 37 C de 6 gün inkübe edilir TEDAVİSİ Cryptosporidium a karşı henüz etkili bir tedavi bulunmadığı için hastalardaki infeksiyon süregenleşerek yaşamı tehdit edebilmektedir 10, İmmun Sistemi Sağlam Kişilerde Tedavi İmmun sistemi sağlam kişilerde infeksiyon genellikle ağır seyretmez ve 1-2 hafta içerisinde kendiliğinden geçer. Dehidratasyon tablosu durumunda sıvı ve elektrolit kaybını karşılamak tedavi için yeterlidir. Bu grup olguların çoğunda başka bir tedaviye gerek yoktur 10, İmmun Sistemi Baskılanmışlarda Tedavi İmmun sistemi baskılanmış hastalarda daha fazla oranda sıvı, elektrolit, kalori, yağ, karbonhidrat ve amino asit replasmin yanı sıra ilaç tedavisine de başlanmalıdır. 14

24 İmmunsuprese ilaç uygulanan hastalarda (kanser, transplantasyon tedavileri) bu tedavilere ara verilmelidir. Özellikle AIDS li hastalarda CD4 hücre sayısı 200/mm³ ün altına düştüğünde Kriptosporidyoz yaşamı tehdit edebilmektedir. Bu gibi durumlarda Kriptosporidyoz için tedavi uygulanmadan önce antiretroviral tedavilerle CD4 sayısının yükseltilmesi gereklidir 10. İmmun supresif hasta grubunda temelde kullanılabilecek ilaçlar şunlardır: İmmun sistemi düzenleyiciler (İnterlökin 2, bovin transfer faktör, hiperimmun kolostrum), antimikrobikler (paramomisin, spiramisin, nitazoksanid, roksitromisin, letrazuril, azitromycin, lasalocid, maduramycin, aprinocid) ve antidiyareikler (morfin sülfat, somostain analogları, difenoksilat) tedavi amaçlı kullanılabilir KORUNMA İnsan ve hayvan dışkısındaki ookistlerin çevreye yayılması önlenmelidir. Ookistlerin oda sıcaklığında 2-6 ay kadar canlı kaldıkları ve 65 C nin üstündeki suda 30 dakikada, hangi yükseklikte olursa olsun kaynayan suda 1 dakikada öldükleri unutulmamalıdır. Her ne kadar 20 C nin altındaki sularda 30 dakikada ookistlerin öldüğü bildirilmişse de, son bilgiler ookistlerin donmaya zannedildiğinden daha dirençli olduğudur. %5.25 sodyum hipokloritli çamaşır suyunda 30 dakikada ölürler; fakat 5 misli sulandırılmış çamaşır suyu buz banyosunda 12 dakikada bozulmamaktadır. İçme sularının rutin klorlanması yeterli olmaz 4, 5, 19, 36. Hijyen koşullarını düzeltilmesi, en çok insandan insana bulaşmayı, aynı zamanda hayvandan insana bulaşmayı azaltmaktadır; çünkü ev içi bulaşma ikincil olguların %50 sinden sorumludur. Tuvaleti kullandıktan sonra ve ishalli hayvanlara dokunduktan sonra eller iyice yıkanmalıdır. İshalli kişiler herhangi bir eğlence suyuna girmemelidir. Kontamine olmuş suların yutulmasından kaçınılmalıdır. Yüzme havuzları güvenlik için sürekli kontrol edilmelidir. Uluslararası seyahat sırasında yiyecek ve içeceklerin güvenilirliğine dikkat edilmelidir. Besinler iyi pişirilmeli ve sular klorlandıktan sonra kullanılmalıdır. Immun sistemi baskılanmış kişilerin infeksiyona yakalanma riskini azaltmak için içme sularını kaynatmaları önerilir. Riskli cinsel ilişkiden kaçınılmalı veya önlem alınmalıdır 36, 38,

25 3.GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. GEREÇLER 1- Cihazlar: ELISA yıkayıcı ELISA okuyucu 2- İshalli dışkı örnekleri: Sağlık Bakanlığı Adana Numune Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı na ve Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi ne bağlı kliniklerden Parazitoloji Anabilim Dalı Laboratuvarı na başvuran hastalardan alındı. 3- Kimyasal maddeler: Sülfürik Asit Metil Alkol 4- Boyalar: Karbol fuksin Metilen mavisi Lugol 5- ELİSA Test Kiti 6- Diğerleri: Plastik kapaklı dışkı kapları Kürdan, lam, lamel 3.2. ÖRNEKLERİN TOPLANMASI Ekim 2007-Temmuz 2008 tarihleri arasında Sağlık Bakanlığı Adana Numune Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı na ishal şikayetiyle başvuran kişilerin dışkı örnekleri ağzı kapaklı kaplara alındı, Ç.Ü. Parazitoloji Anabilim Dalı laboratuvarına getirildi. Boyama için preparatlar hazırlandıktan sonra, kalan dışkı örnekleri ELISA çalışılması için ependorf tüplerine alındı ve -20 C de saklanması için derin dondurucuya kaldırıldı. Aynı işlemler, Ç.Ü. Tıp Fakültesi Balcalı 16

26 Hastanesi ne bağlı kliniklerden Parazitoloji Anabilim Dalı Laboratuvarı na ishal nedeni ile başvuran kişilerin ishalli dışkı örneklerine de uygulandı YÖNTEMLER Bu çalışma, Sağlık Bakanlığı Adana Numune Araştırma Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı ve Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesi ne bağlı kliniklerden Parazitoloji Anabilim Dalı laboratuvarına ishal şikayetiyle gelen üç farklı yaş grubundan oluşan toplam 154 ishalli kişiden alınan dışkı örnekleri üzerinde yapıldı. Çalışmadaki grupların kadın-erkek oranları ve yaş ortalamaları Çizelge-1 de verilmiştir. Çalışmada, 1. grup 0-12 yaş grubu, 2. grup yaş grubu ve 3. grup 30 yaş üstü kişilerden oluşturuldu. Çizelge 1. Çalışma gruplarındaki kadın ve erkek oranları Kadın Erkek Genel Toplam 0-12 yaş yaş yaş üstü Hastalar hakkında gerekli bilgiler (kimlik ve klinik bilgiler) alındıktan sonra ishalli dışkı örnekleri su sızdırmayan kapaklı plastik kaplara alınarak laboratuvara getirildi. Bekletilmeden her dışkı örneğinden; 1-Makroskobik inceleme (renk, koku, kıvam, kan, mukus) 2- Fizyolojik tuzlu su ve lugol kullanılarak lam lamel arası preparat yapılarak Parazitolojik olarak incelendi.. 3-Yayma preparat hazırlanarak havada kurutuldu, metil alkol ile tespit edildi, modifiye asit-fast boyası ile boyandı. 17

27 Modifiye Asit- Fast Boyama Yöntemi Gerekli Eriyikler: 1- Kinyoun Karbol fuksin eriyiği: Bazik fuksin 4 gr Fenol (kristalize) 8 gr Alkol (%95) 20 ml Damıtık su 100 ml 2- Asit Alkol eriyiği: Sülfürik asit 1 ml Etil alkol 99 ml 3-Malaşit Yeşili: Malaşit Yeşili 4 gr Alkol %90 50 ml 4-Metilen Mavisi: Metilen mavisi 0.3 gr Damıtık su 100 ml Boyama Yöntemi a. Yayma yapılan ve havada kurutulan preparatlar metil alkol ile 3 dakika tespit edildi. Sonra preparatların üzerini kaplayacak şekilde Kinyoun un Karbol fuksin eriyiği konuldu. Isıtılmaksızın 8-10 dakika boyandı. b. 3-5 saniye çeşme suyunda yıkandı. c. % 1 lik sülfürik asit ile dekolore edildi. Çeşme suyuyla yıkandı. d. Metilen mavisi ile 1 dakika boyandı. e. Çeşme suyu ile yıkandı ve kurutuldu. f. Mikroskopta X40, X100 büyütmeli objektiflerde incelendi. Cryptosporidium ookistleri mavi zemin üzerinde pembe-kırmızı renkte görüldü. 18

28 Şekil.5. Modifiye asit- fast boyama sonucu ookistlerin mikroskobik görüntüsü (X100) Parazitolojik İnceleme Yöntemi Su sızdırmayan kapaklı plastik kaplara alınan taze dışkı örneklerinden öncelik sırasıyla: 1-Makroskop incelemesi (renk, koku, kıvam, kan, mukus). 2- Fizyolojik tuzlu su ve lugollü lam lamel arası preparat yapılarak bağırsak parazitleri yönünden incelendi. 3- Aynı zamanda bir yayma preparat yapılarak metil alkol ile tespit edildi, modifiye asit-fast boyama yapılarak Cryptosporidium yönünden incelendi. 19

29 ELISA Testi Şekil.6. Cryptosporidim Microwell ELISA Kiti Örneklerin değerlendirilmesinde Cryptosporidium sp. antijenlerini belirlemeye yönelik Microwell ELISA kiti kullanıldı. ELISA çalışması üretici firmanın önerdiği biçimde uygulandı Örneğin Hazırlanması: Çalışma zamanına kadar -20 C de saklanan dışkı örnekleri oda ısısına getirildi. Bir ependorf tüpü içerisine yaklaşık 1:4 (1gr veya bezelye büyüklüğünde dışkı örneğine 3 ml dilusyon solüsyonu ) oranında olacak şekilde yeterli miktarda dilusyon solüsyonu eklendi ve vortekslenerek üstte toplanan sıvı kısım alındı ve ELISA testi için kullanıldı Yıkama Solüsyonunun Hazırlanması: Bir şişe (25 ml) konsantre yıkama solüsyonu, içerisinde 425 ml damıtık su bulunan dar bir şişeye eklendi. 20

30 Yöntemi 1-İstenilen sayıda kuyucuk hazırlandı (pozitif ve negatif kuyucuklar için fazladan iki kuyucuk) ve plağa yerleştirildi kuyucuğa 2 damla (yaklaşık 100 µl ) negatif kontrol, 2. kuyucuğa 2 damla pozitif kontrol eklendi. 3-Her test kuyucuğuna 2 şer damla hazırlanan dışkı örneğinden eklendi. 4- Oda sıcaklığında (15-25 C) 30 dakika inkübasyona bırakıldı ve sonra yıkama işlemi yapıldı (Yıkama işlemi 3 defa her bir kuyucuğun taşana kadar doldurulup boşaltılmasıyla yapıldı). 5- Her kuyucuğa 2 şer damla Reagent 1 (mavi solüsyon) eklendi. 6-5 dakika inkübasyona bırakıldı, sonra yıkandı. 7- Her kuyucuğa 2 şer damla Reagent 2 (kırmızı solüsyon) eklendi. 8-5 dakika inkübasyona bırakıldı, sonra yıkandı. 9- Her kuyucuğa 2 şer damla Kromojen eklendi dakika inkübasyona bırakıldı. 11- Her kuyucuğa 2 şer damla Stop (durdurma) solüsyonu eklendi. İşaret parmağı ile plağın yan tarafına hafifçe vurarak kuyucukların karışması sağlandı. 12- Havaya karşı 450 nm de ELISA okuyucusunda okundu. 21

31 4.BULGULAR Çalışmamızda, toplam 154 dışkı örneğinin 8 inde (%5.19) modifiye asit-fast boyama yöntemi ile Cryptosporidium sp. ye ait ookistler görüldü. Mikroskop altında tespit edilen bu 8 örnekte Cryptosporidium ookislerinin yoğunluğu örnekler arasında farklılık gösterdi. Çizelge 2. Modifiye Asit-Fast Boyama Yöntemi ile Cryptosporidium 0okistlerinin Saptandığı Hastaların Gruplara Göre Dağılımı Modifiye Asit-Fast Boyama (+) 0-12 yaş yaş - 30 yaş üstü - Toplam 8 (1000 büyütme, modifiye asit-fast boyama) Şekil.7.Cryptosporidium sp. nin ookistlerinin modifiye asit-fast boyamadaki görünümü 22

32 Lugol ile incelenen preparatların sadece 2 sinnde Cryptosporidium sp. ye ait ookistler tespit edildi. Ayrıca inceleme yapılan örneklerde 11 tane Giardia intestinalis, 5 tane Entamoeba coli ve 10 tane Blastocystis hominis gibi bağırsak protozoonları da görüldü (Çizelge 3). Çizelge 3. Lugollü Preparatlarda Görülen Protozoon Türlerinin Dağılımı Cryptosporidium sp. 2 % 1.29 Giardia intestinalis 11 % 7.14 Entamoeba coli 5 %3.24 Blastocystis hominis 10 % 6.49 ELISA yöntemi ile toplam 154 dışkı örneğinin 37 sinde Cryptosporidium sp. antijeni tespit edildi. ELISA test kiti prosedürüne göre pozitif ve negatif kontrol kullanılarak uygulanan yöntem ile çalışılan örneklerin bulunduğu plak ELISA okuyucusunda havaya karşı 450 nm de okunduktan sonra elde edilen değerlerden Cut off OD ve bu değerin üstü pozitif olarak değerlendirildi. Bu pozitif olguların 25 i 0-12 yaş grubunda, 4 ü yaş grubunda ve 8 i de 30 yaş üstündeki grupta olduğu tespit edildi. Cryptosporidium sp. antijenlerinin dağılımı yaş gruplarına göre sırasıyla %.16.23, %2.59 ve %5.19 olarak belirlendi (Çizelge 4). 23

33 Şekil.8. ELISA plağında pozitif ve negatif kuyuların görünümü (ilk 96 hastanın sonucu) 24

34 Şekil.9. ELISA plağında pozitif ve negatif kuyuların görünümü (Son 58 hastanın sonucu) Çizelge 4. Cryptosporidium sp. ELISA Antijen Testinin Pozitifliğinin Yaş Gruplarına Göre Dağılımı Yaş aralığı Genel Toplam (%) 0-12 yaş 25 (%16.23) yaş 4 (%2.59) 30 yaş üstü 8 (%5.19) Toplam 37 (%24.02) 25

35 Çizelge 5. Mikroskobi ile ELISA Sonuçlarının Karşılaştırılması MİKROSKOBİ MİKROSKOBİ TOPLAM pozitif negatif ELISA pozitif ELISA negatif TOPLAM ELISA Testinin Duyarlılığı: 8/(8+0)x100=100 ELISA Testinin Özgüllüğü: 117/(29+117)=80.1 Mikroskobik inceleme ile ELISA yöntemi karşılaştırıldığında ELISA nın duyarlılığı %100, özgüllüğü %80.1 olarak saptanmıştır. 26

36 5.TARTIŞMA Her geçen yıl, gerek bağışıklık sistemi baskılanmış olguların sayısındaki artış, gerekse bağışıklık sistemi sağlam kişilerde büyük salgınların saptanması, Kriptosporidyoz un önemini arttırmaktadır 8. Cryptosporidium parvum un dünyada, özellikle gelişmekte olan ülkelerde, insanlarda ishale neden olan en fazla yaygın olan üç patojenden biri olduğu düşünülmektedir 36, 40. Börekçi ve arkadaşlarının 9 Mersin de yaptıkları çalışmada, bir gecekondu mahallesinde yaşayan ve rastgele örnekleme yöntemi ile seçilen ailelerde Cryptosporidium prevalansını belirlemek amacıyla ishal şikayeti bulunmayan toplam 76 aileyi (466 kişi) çalışmaya almışlar. Örnek vermeyi kabul eden 361 kişinin dışkı örneklerini modifiye asit-fast boyama yöntemi ile boyayarak ışık mikroskobunda incelemişler ve 76 ailenin dokuzunda (%11.8), en az bir kişide Cryptosporidium ookistleri görmüşlerdir. Michel ve arkadaşlarının 44 Mısır da yaptıkları çalışmalarında modifiye asit-fast boyama ve ELISA ya karşı co-aglutinasyon metodunun daha üstün olduğunu bildirmişlerdir. Jayalakshmi ve arkadaşları 28 Hindistan da yaptıkları bir çalışmada, ishali olan 89 HIV li hastanın dışkı örneklerini ELISA ve modifiye asit-fast boyama yöntemleriyle incelemişler ve 11 (%12.4) örnekte pozitif sonuç elde etmişlerdir. ELISA testinin duyarlılığını %99.9 ve özgüllüğünü %98.7 olarak bulmuşlardır. Kriptosporidyoz üzerine yapılan geniş çaplı çalışmalarda, basit, hızlı ve güvenilir sonuçlar veren ELISA nın rutin çalışmalarda kullanılmasının faydalı olacağını bildirmişlerdir. Çalışmamızda ise ELISA ile boyalı preparatların mikroskobik inceleme yöntemlerinin her ikisi bir arada uygulandığı durumda ELISA testinde duyarlılığın %100, özgüllüğün %80.1 olduğu saptandı (Çizelge 5). Sonuçlarımızda, Jayalakshmi ve arkadaşlarının çalışmasından farklı olan olgularımızın hiç birisinde HIV pozitifliği bulunmayışı idi. Bu da göstermiştir ki özellikle çocuk populasyonunda HIV pozitifliği bulunmasa dahi Cryptosporidium sp. ookistlerinin saptanma olasılığı yüksek olabilmektedir ve Cryptosporidium sp. mutlaka hatırda tutulması gerekmektedir. Kehl ve arkadaşları 30 ABD de yaptıkları bir çalışmada, iki ELISA yöntemi, DFA, Asit-Fast boyama yöntemlerini Cryptosporidium ookistlerini saptamak amacıyla 27

37 kullanmışlardır. 129 dışkı örneği incelenerek 55 örnekte pozitif sonuç elde edilirken 74 örnekte ookist saptanamamıştır. ELISA yönteminin duyarlılığının %94.5, asit-fast boyama ve DFA birlikte kullanıldığında ise duyarlılığın %96.4 olduğunu saptamışlardır. Tek başına asit-fast boyamada tanı koymak zor olabilir. Boyama ile DFA yönteminin birlikte kullanıldığı durumlarda ELISA yöntemine tercih edilebildiği bildirilmiştir. El Shazly ve arkadaşlarının 29 Mısır da yaptıkları bir çalışmada, ishalli 1050 çocuğun 90 ında modifiye asit-fast boyama ile ookist saptanırken ELISA ile bu sayı 100 ü bulmuştur. Çalışmamızda ise boyama yöntemi ile 8 olguda pozitiflik saptanırken ELISA ile 37 olguda pozitiflik saptanmıştır (Çizelge 5). Rosenblatt ve arkadaşları 31, ABD de Mayo Kliniği ne başvuran hastalardan temin ettikleri 296 ishalli dışkı örneğinin 100 tanesinde ELISA ve IFA yöntemleriyle Cryptosporidium sp. olduğunu saptamışlardır ve ELISA nın duyarlılığının %93, özgüllüğünün ise %99 olduğunu bildirmişlerdir. Baveja 45, Delhi Hastanesinde yaptığı çalışmada, 216 dışkı örneğinde Cryptosporidium u saptamak amacıyla modifiye asit-fast ve ELISA yöntemlerini kullanmıştır. Cryptosporidium sp. yi saptamak için altın standart mikroskobik inceleme gibi ELISA nın duyarlılığının %100, özgüllüğünün ise %99.7 olduğunu bildirmiştir. Weitz 32, Şili de yaptığı çalışmada, akut ishalli 105 dışkı örneğinde Cryptosporidium u, ELISA yöntemi ile araştırmış ve bunların 58 inde pozitiflik saptamıştır. Su kaynaklı Cryptosporidium sp. bulaşması, en önemli bulaşma yolu olarak düşünülmektedir ve en büyük salgınlar bu yol ile oluşmuştur. Su ile bulaşmanın olduğu ilk olgular 1983 te Finlandiya dan Rusya nın St. Petersburg kentine seyahat eden ve ishali bulunan Finlandiyalı kişilerde tanımlanmıştır 36. Akyön ve arkadaşları 41, Ankara da 12 yaşın altındaki çocuklarda Kriptosporidyoz yaygınlığını saptamak amacıyla, IFA, DFA, Giemsa boyama ve modifiye asit-fast boyama ile ishalli 200 çocuktan alınan dışkı örnekleri ve sağlıklı çocuklardan alınan 50 dışkı örneğini incelemişlerdir ve 7 çocukta (%3.5) Cryptosporidium ookistini saptamışlardır. Kontrol gruptaki örneklerin hiçbirinde parazite rastlanmamıştır. Dolayısı ile ishal öyküsü bulunmayan olgularda parazite rastlamak çok mümkün olmamaktadır ve Kriptosporidyoz klinikte ishal oluşturmaktadır. Olgularımız bu nedenden dolayı ishal öyküsü bulunanlar arasından seçilmiştir (Çizelge 1). Van da yapılan diğer bir çalışmada ise Çiçek ve arkadaşları 42 Van Belediye Mezbahasında çalışan 87 işçinin dışkı örnekleri ve kesimi yapılan 167 koyun, 56 keçi ve 28

38 86 sığır olmak üzere toplam 309 hayvanın dışkı örneklerini Cryptosporidium sp. ookistleri yönünden incelemişlerdir. Bunun için RIDA Quik Cryptosporidium Strip Testi (R-Biopharm, Almanya) ve modifiye asit-fast boyama yöntemlerini kullanmışlardır. Strip testiyle pozitif bulunan dışkı örnekleri ELISA yöntemi ile doğrulanmıştır. Koyunların 22 sinde (%13.17), keçilerin 6 sında (%10.71), sığırların 7 sinde (%8.13), işçilerin ise 1 inde (%1.14) Cryptosporidium sp. ookistleri saptanmıştır (42). Çalışmamızda da mikroskobi yönteminde pozitif bulduğumuz sonuçlar ELISA yöntemi ile doğrulanmıştır (Çizelge 5). Otağ ve arkadaşları 46, Mersin de dört ilköğretim okulunda, yaşları 8-12 olan 72 çocuktan toplanan dışkı örneklerini modifiye asit-fast ve Auromin O boyama yöntemleriyle incelemişler ve hiçbir belirtisi olmayan 4 çocukta Cryptosporidium ookistlerini saptamışlardır. Ungar 47, çalışmasında Kriptosporidyozlu 62 hastanın 51 inde ELISA pozitiflik saptamış, Cryptosporidium infeksiyonu belirgin olmayan 182 örneğin ise 176 sında ELISA sonucunu negatif bulmuştur. Sonuçta ELISA yönteminin duyarlılığının %89.5, özgüllüğünün ise %96.7 olduğunu bildirmiştir. Direkel ve arkadaşları 48, yaptıkları çalışmalarında Malatya Huzurevi sakinleri ile İnönü Üniversitesi Turgut Özal Tıp Merkezi ne başvuran ishalli toplam 92 kişiden aldıkları dışkı örneklerinde, ELISA yöntemi ile Cryptosporidium parvum koproantijenlerini ve modifiye asit-fast boyama yöntemi ile ookistlerini araştırmışlardır. Toplam 5 örnekte hem ELISA hem de boyama yöntemi ile pozitiflik saptamışlardır. ELISA yönteminin duyarlılığını ve özgüllüğünü bu çalışmada %100 olarak saptamışlardır. Yılmaz ve arkadaşları 49, Van da yaptıkları çalışmalarında yaşları 0-15 arasında olan, 870 i kız, 1130 u erkek olan ishalli toplam 2000 çocuktan dışkı örnekleri temin etmişler ve aynı yaşlarda rastgele seçilen 100 çocuğu da kontrol grubu olarak kullanmışlardır. Bunları modifiye asit-fast boyama ve ELISA yöntemiyle incelemişler. Sonuşta ELISA ile 2000 çocuğun 97 sinde (%4.9), boyama ile sadece 39 unda (%1.95) ookistleri görmüşler. Kontrol grubunda her iki yöntemle de parazit saptanmadığını bildirmişledir. Doğan ve arkadaşları 50, Eskişehir de yaptıkları çalışmalarında, Osmangazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Çocuk Polikliniği ne başvuran 0-6 yaş arası ishalli 540 çocuk ile yetiştirme yurdunda bir gastroenterit salgını sırasında aynı yaş grubu 67 çocuktan alınan dışkı örnekleri Sheather in flotasyon tekniğine göre hazırlanarak 29

39 doğrudan taze inceleme, Gram, Giemsa, Modifiye asit-fast yöntemleri kullanılarak Cryptosporidium ookistlerinin varlığı ve mevsimsel periyodisitesi yönünden araştırılmıştır. Toplam 607 örneğin %3.6 sında Cryptosporidium ookistleri saptamışlardır. Sönmez ve arkadaşları 51, çalışmalarında 80 dışkı örneğini Kriptosporidyoz yönünden modifiye asit-fast boyama yöntemi ve dışkıda Cryptosporidium sp. antijenlerini aramaya yönelik hazırlanmış ELISA (r-biopharm, Germany) ile incelemişler ve modifiye asit-fast ile 3 örnekte (%3.75) Cryptosporidium sp. ookistleri, ELISA ile 5 örnekte (%6.25) Cryptosporidium sp. özgül antijenleri saptamışlardır. Bizim yapmış olduğumuz çalışma, farklı ülkelerde yapılan diğer çalışmalarla karşılaştırıldığında birçok çalışmada elde edilen görülme sıklığı yüzdesiyle uyumlu sonuçlar bulunurken, ülkemizde yapılan çalışmaların görülme sıklığı yüzdesinden yüksek olduğu görülmüştür (Çizelge 6-7). Çizelge.6. Bazı ülkelerde Cryptosporidium ile ilgili yapılan çalışmalar Araştırıcı Ülke, Şehir Grup Sayı Prevalans % kaynak Jayalakshmi ve Hindistan İshalli HIV(+) ark.(28) Kehl ve ark. ABD İshalsiz kişiler (30) El Shazly ve Mısır İshalli çocuklar ark.(29) Rosenblatt ve ABD İshalli çocuklar ark.(31) Weitz ve ABD İshalli kişiler ark.(32) 30

40 Çizelge.7.Ülkemizde Cryptosporidium ile ilgili yapılan bazı çalışmalar Araştırıcı kaynak Börekçi ark.(9) Akyön ark.(41) Direkel ark.(48) Doğanve (50) ve ve ve ark Şehir Grup Sayı Prevalans % Mersin İshalsiz kişiler Ankara İshalli kişiler Malatya İshalli kişiler Eskişehir İshalli çocuklar Ayrıca yaptığımız her iki yöntemin sonuçlarına baktığımızda 0-12 yaş grubundaki kişilerde pozitiflik değerlerin diğer gruplara göre sayıların daha yüksek olduğu görüldü. Modifiye asit-fast ile sadece bu grupta 8 pozitif sonuç bulunurken, ELISA ile aynı grupta %16.23, yaş grubunda olanlarda daha düşük yani %2.59 ve 30 yaş üstü olan grupta ise %5.19 oranında görülmüştür (Çizelge 2-4). Çalışmamızda mikroskobik incelemede pozitif olan tüm olgular ELISA ile tespit edilebilmiştir. 31

41 6. SONUÇ VE ÖNERİLER Dışkıda özgül antijen arayan ELISA yönteminin maliyeti yüksek olmasına rağmen etkensel tanı yöntemlerindeki zorluklara yardımcı olacağı sonucu çalışmamızda elde edilmiştir. Çalışmamız, özellikle çocuk populasyonunda (0-12 yaş arası) HIV pozitifliği bulunmasa dahi Cryptosporidium sp. ookistlerinin saptanma olasılığının yüksek olduğunu göstermiştir ve Cryptosporidium sp. nin mutlaka hatırda tutulması gerektiğini ortaya koymuştur. Bunun yanında, günümüz koşullarında tek başına mikroskobi bakı tanı için yetersiz kalmakta, ikinci bir doğrulama testi olarak ELISA yönteminin rutinde kullanılmasının çok uygun olacağı kanısına varılmıştır. 32

42 7.KAYNAKLAR 1. Markel EK, Voge M, John DT. Medical Parasitology. Sixth Edition. W. B. Saunders Company, London, 1986: Dirim D, Turgay N, Alkan MZ. Bir Cryptosporidiosis olgusunun Kinyoun Asit Fast Boyası ve PCR ile Takibi. Ege Üniversitesi, Bornova, İzmir, 2003: Willke TA, Söyletir G, Doğanay M. İnfeksiyon Hastalıkları ve Mikrobiyolojisi. 2002: Özcan K. Tıbbi Parazitoloji Ders ve Laboratuar Notları, Adana, 1998: Altıntaş K. Tıbbi Genel Parazitoloji ve Protozooloji. 1997: White AC. Infectious Diseases Society of America. Cryptosporidiosis artfiles/ parazitoloji Erişim Tarihi: Özcel MA, Özbel Y, Ak M. Özcel in Tııbi Parazit Hastalıkları. Tıbbi Parazitoloji Derneği Yayın No:22 İzmir, 2007: Börekçi G, Otağ F, Emekdaş G. Mersin de Bir Gecekondu Mahallesinde Yaşayan Ailelerde Cryptosporidium Prevalansı. İnfeksiyon Dergisi. 2005:19(1): Akısü Ç, Korkmaz M. Tıbbi Parazitolojide Tedavi. Ed Özcel MA. Tıbbi Parazitoloji Derneği,Ege Üniversitesi,Yayın No:20. İzmir, 2005: Hashmey R, Simith NH, Cron S, Graviss EA, Chappell CL, White AC. Cryptosporidiosis in Houston, Texas. Medicine(Baltimore), 1997; 76(2): Döşkaya M, Dayangaç N, Kuman HA. Cryptosporidium parvum. T Paraziol Derg, 2003; 27(1): Chacin- Bonilla L. Cryptosporidiosis in humans. Invest Clin 1995;36(4): Kramer MF, Vesey G, Look NL, Herbert BR, Simpson-Stroot JM, Lim DV. Development of a Cryptosporidium oocyst assay using an automated fiber optic-based biosensor. Journal of Biological Engineering, 2007; 1(1):3. 33