Flow Sitometrinin Malign Hematolojide Kullanımı. Dr. Alphan Küpesiz Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Hematoloji/Onkoloji BD Antalya

Transkript

1 Flow Sitometrinin Malign Hematolojide Kullanımı Dr. Alphan Küpesiz Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Hematoloji/Onkoloji BD Antalya

2

3 Neyi ölçer? Hücre çapı, hacmi, yüzey alanı ve granülaritesini ölçer. Yüzey proteinleri ile farklı hücre tiplerini ve sayısını belirler. Hücre içi DNA miktarı, enzimleri ve proteinlerini ölçer.

4 Malign Hematolojide Kullanım Akut lösemiler Minimal rezidüel hastalık DNA indeks ölçümü

5 Örnek toplama ve transport Periferik kan, kemik iliği, lenf nodu, BOS, bronkoalveoler lavaj sıvıları Akut lösemilerde immünfenotipleme için kemik iliği örneği şarttır En az örnek miktarı: 2 ml periferik kan ve kemik iliği, 1 ml BOS Kemik iliği sinüs kanı ile seyreltilmemiş olmalıdır

6 Örnek toplama ve taşıma Antikoagülan madde: Periferik kan ve kemik iliği için EDTA, heparin, ACD A En geç 6 saat içinde çalışılmalıdır. 24 saat içinde çalışan merkezler mevcut. Oda sıcaklığında en fazla 24 saat bekleyebilir. Örnekte bozulma belirtisi varsa çalışılmamalıdır. Örnekteki eritrositler dikkatle uzaklaştırılır. En uygun florokromlar seçilir.

7 Uluslararası Standartizasyon Bethesda Uluslararası Uzlaşı, 2007 EuroFlow Grubu Önerileri, 2012 Sekiz renkli antikor paneli B ALL, T ALL, AML/MDS

8 Anormal hücre grubunun saptanması Matürasyon evresinde duraklama ve hücre sayısında artış Antijen sunumunda görülen senkronizasyonun bozulması sig taşıyan B hücresinde halen TdT varlığı, CD15 taşımaya başlayan myeloid hücrelerde CD34 varlığının sürmesi Aberan antijen sunumunun tespit edilmesi Myeloid hücrelerde CD19 pozitifliği, lenfoid hücrelerde CD33 varlığı

9 B Hücre Matürasyonu Behm, SJCRH, 2003 TdT: Terminal deoksinükleotidil transferaz

10 T Hücre Matürasyonu

11 Myeloid Hücre Matürasyonu Behm, SJCRH, 2003

12 Tam kan örneği Yan saçılım Ön saçılım

13 CD45 antijeni = Pan lökosit antijeni Yan saçılım Yan saçılım Ön saçılım

14

15 Akut lösemide kullanılabilecek temel antikorlar Dr.Klara Dalva notları

16 AML de Tiplendirme Dr.Klara Dalva notları

17 Lenfoblastların Histogram Görüntüsü

18 Üç yaşında B hc ALL olgusu FAB-L1 blast

19 17 yaş T hc ALL

20 Mikst fenotip ALL: T/Myeloid Beş yaş, erkek HSM+ Hb 4,5/ / LDH: 3783Ü/dl

21 İnfantil Akut Megakaryoblastik Lösemi

22

23 Minimal Rezidüel Hastalık 1980 lerde başlayan yaklaşım Lösemik hücrelerin taşıdıkları antijen araştırması ALL AML

24 Minimal Rezidüel Hastalık MRD: Morfolojik olarak görülemeyen blastlar Sensitivite: %0.01 Morfolojik olarak normal hücreler Blast? Morfolojik olarak blast Normal?

25 Morfoloji / Flow Sitometri 248 Pediatrik ALL olgusu İndüksiyonun 2. haftasında Lenfoblastlar sadece %12.9 olguda morfolojik olarak tanımlanıyor İki örnekte %9 ve %16 blast oranı sadece flow ile saptanabiliyor Coustan-Smith E et al. Blood 2002;100:52-8.

26 PCR / Flow Neale GA et al. Leukemia 2004;18:934-8.

27

28 Protokol Önerisi

29 13 yaş, kız, T hc ALL Tanı 15.gün

30 5 yaş, erkek. PreBhc ALL

31 MRD Metodları Karşılaştırması MRD Tekniği FlowSitometri RQ PCR (IG/TR gen, Kırılma noktaları) RQ PCR (Füzyon transkript, aberan alan) Sensitivite 3 4 renk: renk: 10 4 Uygulanabilirlik B ALL: >%90 T ALL: >%90 B ALL: %95 T ALL: %90 95 B ALL: %25 40 T ALL: %10 15 Avantajları Dezavantajları Hızlı Hücresel analizi Kolay veri depolama Sellülariteyi görmek Değişken sensitivite Sınırlı standartizasyon B ve T ALL için Sensitif Standart uygun Zaman kaybı Pahalı Tecrübe ve bilgi gereksinimi Görece kolay Sensitif Spesifik gruplar için uygun (BCR ABL, MLL AF4) Sınırlı standartizasyon ALL de sınırlı uygulanabilirlik Kontaminasyon riski

32 MRD: Flow vs PCR Düşük maliyetli Hızlı Yüksek sensitivite %0.01 Güvenilir Tüm hücreler değerlendiriliyor

33 AML için MRD Anlamlı relaps belirteçi olarak kullanılıyor Son yıllarda artan veri mevcut PCR ile yorumlanması zor durumlarda etkin (AML1 ETO ve CBFß MYH11)

34 Akut Myeloid Lösemi de Flow-MRD İndüksiyon 1 sonrası İndüksiyon 2 sonrası Hastalıksız Sağkalım Hastalıksız Sağkalım Inaba H et al. J Clin Oncol Oct 10;30(29):

35 DNA İndeksi Karyotipleme: Işık mikroskobuyla Giemsa bantlı metafaz sayımı Flow sitometri: Nükleus boyanmasıyla DNA ölçümü yapılması Dİ: >1.16 (>50 kromozom) ise hiperdiploidi ile ilişkilidir (%25 30, iyi prognoz). Hipodiploidi (<44 kromozom) ise kötü prognoz ilişkilidir.

36 Flow ile DNA Ölçümü

37 Karyotipleme DNA İndeks/ Flow DNA İndeks Rachieru-Sourisseau P et al. Int J Lab Hematol Jun;32(3):288-98

38 Kromozom Sayısı /FLOW DNA İndeks Rachieru-Sourisseau P et al. Int J Lab Hematol Jun;32(3):288-98

39

40 Flow Sitometrinin Diğer Kullanım Alanları Kronik myeloid lösemi MDS Lenfoma tipleri Plazma hücreli lösemiler

41 Flow Sitometrinin Geleceği 1980 lerden bu yana hızla ilerleyen teknoloji Kitle sitometri (element antikor ilişkisi) Lösemik hücre ayrımı Proliferasyon molekülleri varlığı Apopitozis Sinyal iletimi İlaç direnci Bireyselleştirilmiş lösemi tedavisi

42 Kitle Sitometri (Mass Cytometry)

43

44 Teşekkür ederim