SİNİR AJANLARI MARUZİYETİNDE KOLİNESTERAZ ENZİMİNİN TANISAL DEGERİ

Transkript

1 SİNİR AJANLARI MARUZİYETİNDE KOLİNESTERAZ ENZİMİNİN TANISAL DEGERİ Dr. Erdim Sertoğlu Danisman: Prof.Dr. Levent Kenar

2 İÇERİK Enzim (ler) Hakkında Genel Bilgiler Eritrosit-Serum Enzim Farkları Ölçüm Teknikleri Bu ölçümü bizim lab.da nasıl kullanırız? Hastaneye yatış ve taburcudaki rolü Klinikle uyumu - Başka olaylarda Tanısal Değeri var mı? - Yayınlar

3 ENZİM(LER) HAKKINDA GENEL BİLGİLER

4 KOLİNESTERAZ Kolinesterazlar, neredeyse sadece hayvan dokularında bulunan ve asetilkolinin asetik asit ve koline hidrolizini katalize eden enzimlerdir. Bir acyl grubunun çeşitli kolin ve asetilkolin esterlerinden parçalanmasını katalize edebilir. Cholinesterase is of 2 types: 1. acetylcholinesterase (AchE), or true, specific, E-type cholinesterase (acetylcholine acetylhydrolase, EC ) 2. cholinesterase or pseudo, nonspecific, s-type cholinesterase (acylcholine acylhydrolase, EC ) Dvir H, Silman I, Harel M, Rosenberry TL, Sussman JL. Acetylcholinesterase: from 3D structure to function. Chem Biol Interact. 2010;187(1-3):10-22.

5 KOLİNESTERAZ Omurgalılarda bulunan kolinesteraz formları (Chatonnet and Lockridge 1989) Eritrosit AChE'nin şematik gösterimi Disülfid bağı ile bağlanmış dimerik yapı ve glikosilfosfatidilinositol anchor'ları yoluyla eritrosit membranına bağlanması (Taylor 1991) Taylor P (1991) The cholinesterases. J Biol Chem 266: Chatonnet A, Lockridge O (1989) Comparison of butyrylcholinesterase and acetylcholinesterase. Biochem J 260: Assis, C.R.D., Linhares, A.G., Cabrera, M.P. et al. Erythrocyte acetylcholinesterase as biomarker of pesticide exposure: new and forgotten insights. Environ Sci Pollut Res 25, (2018).

6 KOLİNESTERAZ Ach'nin hidrolizinin katalize olduğu AChE aktif gorge geçidinin altındaki etkileşimlerin şematik gösterimi, - kolin bağlanma alt grupları (aromatik kalıntılardaki π elektronlarının etkileşimiyle substratın çekimi ve konumlandırılması) ve - Esteratik alt gruplar(ester bağlarını yıkar) - (Fukuto 1990) Assis, C.R.D., Linhares, A.G., Cabrera, M.P. et al. Erythrocyte acetylcholinesterase as biomarker of pesticide exposure: new and forgotten insights. Environ Sci Pollut Res 25, (2018). Fukuto TR (1990) Mechanism of action of organophosphorus and carbamate insecticides. Environ Health Perspect 87:

7 KOLİNESTERAZ AChE Butyrylcholinesterase (BchE) (pseudo) Dağılım Sinir dokusunda, kırmızı kan hücrelerinde, akciğer ve dalakta bulunur. Beynin gri maddesinde bulunur. RBC lerdeki AchE RBC kolinesteraz olarak adlandırılır. En çok karaciğerde bulunur. Aynı zamanda pankreasta, kalpte, beynin beyaz maddesinde ve serumda da bulunur. Ach Hidrolizi Çok hızlı Yavaş İnhibisyon Fizostigmine daha duyarlı Organofosfatlara daha duyarlı Fonksiyon Ach aktivitesinin sonlandırılması Esterlerin hidrolizi

8 KOLİNESTERAZ

9 KOLİNESTERAZ Kan kolinesterazlarinin inhibisyonuna dayalı pestisit izlemi WHO tarafından uzun zamandır önerilmektedir (1967, 1984) Edson (1958), Ellman ve arkadaşalrının (Ellman and Courtney 1961) (adapted by WHO 1984) or erythrocyte AChE according to George and Abernethy (1983) metodunu kullanmak için taze tam kan örnekleri gereklidir. Bu metodların dezavantajları; (a) Total ChE'leri kullananlarda AChE ve BChE aktiviteleri ayırt edilemez; (b) Tam lysis ve santrifüj olmadan eritrosit AChE kullananlarda hemoglobinin etkileşimi nedeniyle düşük doğruluk. (c) Tersine, hemoglobin içermeyen eritrosit AChE'nin ekstraksiyon yöntemlerini mümkün kılar, (d) numunelerin dondurulması ve taşınması (Dondurulduktan sonra 7 güne kadar stabil olduğu için); (e) kolorimetrik interferans içermeyen örnekler; (f) sadece eritrosit AChE'den veri toplanması. WHO (1967) World Health Organization. Expert committee on the safe use of pesticides in public health. Technical Report Series 356, Geneva WHO (1984) World Health Organization. Spectrophotometric kit for measuring cholinesterase activity. WHO/VBC/84.888, Geneva Edson EF (1958) Blood tests for users of OP insecticides. World Crops 10: Ellman GL, Courtney KD, Andres V Jr, Featherstone RM (1961) A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem Pharmacol 7:88 95 George PM, Abernethy MH (1983) Improved Ellman procedure for erythrocyte cholinesterase. Clin Chem 29:

10 ONEMİ REVIEW PubMed verilerine göre çalışma Aralık 13, 2016 da gerçekleştirilmiştir. OP pestisit maruziyetinin biyobelirteçlerine ilişkin toplam çalışma tanımlanmış, bunların 75'i dahil etme ve hariç tutma kriterlerini karşılamaktadır. Bu çalışmalarda 99 ana bilgisayar tabanlı biyobelirteç, 28 metabolit, 12 pestisit ve 4 adducts olmak üzere 143 farklı analit / numune matriks kombinasyonunu tanımlanmıştır. En sık bildirilen biyobelirteçler, dialkil fosfat üriner metabolitleri (22 çalışma), kan asetilkolinesteraz ve plazma butirilkolinesterazdır (her biri 26 çalışma). Vandekar M. Minimizing Occupational Exposure to Pesticides: Cholinesterase Determination and Organophosphorus Poisoning. In: Gunther FA, Gunther JD (eds). Residue Reviews. Springer, New York, NY, Marrs TC: Organophosphate poisoning. Pharmacol Ther 1993; 58(1): Haigh JR, Lefkowitz LJ, Capacio BR, Doctor BP, Gordon RK: Advantages of the WRAIR whole blood cholinesterase assay: comparative analysis to the micro-ellman, test-mate ChETM, and Michel (1pH) assays. Chem-Biol Interact 2008; 175(1):

11 ONEMI Çıkarım - OP zehirlenmesinden şüpheleniliyorsa, tanı amaçlı en yaygın yaklaşım eritrosit AChE veya plazma BuChE aktivitesinin ölçülmesidir. AChE ve / veya BuChE'yi değerlendiren 37 çalışma arasında; 31 çalışmada (31/37,% 84) Ellman yöntemi veya Ellman yönteminin modifiye bir versiyonu ile spektrofotometrik tekniklerin kullanıldığını bildirilmiştir. Vandekar M. Minimizing Occupational Exposure to Pesticides: Cholinesterase Determination and Organophosphorus Poisoning. In: Gunther FA, Gunther JD (eds). Residue Reviews. Springer, New York, NY, Marrs TC: Organophosphate poisoning. Pharmacol Ther 1993; 58(1): Haigh JR, Lefkowitz LJ, Capacio BR, Doctor BP, Gordon RK: Advantages of the WRAIR whole blood cholinesterase assay: comparative analysis to the micro-ellman, test-mate ChETM, and Michel (1pH) assays. Chem-Biol Interact 2008; 175(1): Ellman GL, Courtney KD, Andres V, Featherstone RM: A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem Pharmacol 1961; 7(2):

12 YINE DE OP maruziyetini değerlendirmek için kolinesteraz aktivitesine güvenmenin önemli dezavantajları da vardır. 1- ChE aktivitesinde popülasyon duzeyinde farklılıklar - genetik etkiler ve cesitli sağlık koşulları nedeniyle. 2- Pestisitlere maruziyete ek olarak, ağır metaller ve polisiklik aromatik hidrokarbonlar gibi diğer çevre kirleticilerine maruz kalmanın da AChE seviyelerini etkileyebileceğine dair bazı kanıtlar vardır. 3- Genel değerlendirme AChE seviyelerindeki bir değişiklik için güvenilir saptamanın alt sınırının % 20 olduğu seklindedir; yani, başlangıca göre% 20'den daha az olan değişiklikler OP maruziyeti için güvenilir göstergeler olmayabilir. Vandekar M. Minimizing Occupational Exposure to Pesticides: Cholinesterase Determination and Organophosphorus Poisoning. In: Gunther FA, Gunther JD (eds). Residue Reviews. Springer, New York, NY, Wessels D, Barr DB, Mendola P: Use of biomarkers to indicate exposure of children to organophosphate pesticides: implications for a longitudinal study of children s environmental health. Environ Health Perspect 2003; 111(16): Lionetto MG, Caricato R, Calisi A, Giordano ME, Schettino T: Acetylcholinesterase as a biomarker in environmental and occupational medicine: new insights and future perspectives. BioMed Res Int 2013; 2013: 8. Lessenger J, Reease B: Rational use of cholinesterase activity testing in pesticide poisoning. J Am Board Family Practice 1999; 12(4): Hayes W. Pesticides Studied in Man. Baltimore, MD, Williams & Wilkins, 1982.

13 YINE DE Bu nedenle, kolinesteraz aktivitesi düşük düzeylerdeki OP maruziyetlerini izlemek için büyük olasılıkla pratik değildir (?), bu da popülasyonun farkli duzeylerdeki maruziyetlerinde çok sayıda numunenin taranmasını imkansız hale getirir. OP sinir ajanları, OP pestisitlerden daha yüksek toksisiteye sahip oldukları için, AChE seviyelerinde önemli bir değişikliği indüklemek için gereken sinir ajanı miktarı önemli ölçüde daha düşüktür. Ancak 1995'teki Tokyo metrosu sarin saldırısı sırasında sinir ajanlarının kullanımı, sağlık çalışanlarına ikincil maruziyetler gibi yaygın düşük seviyeli maruziyetlere neden olmustur. Kolinesteraz aktivitesi, belirli bir OP sinir ajanı eşiğini aşan maruziyete sahip bireylerin tanımlanmasında faydalı olabilir, ancak AChE ve BuChE aktivitelerindeki değişiklikleri gözlemlenen klinik semptomlarla ilişkilendirecek esikler belirlenmis değildir ve AChE ve BuChE seviyelerinin gözlemlenen hasta semptomları ile ilişkisini ortaya koyan daha fazla araştırma yapılması gereklidir. Moshiri M, Darchini-Maragheh E, Balali-Mood M: Advances in toxicology and medical treatment of chemical warfare nerve agents. Daru: J Fac Pharm, Tehran Univ Med Sci 2012; 20(1): Okumura S, Okumura T, Ishimatsu S, Miura K, Maekawa H, Naito T: Clinical review: Tokyo - protecting the health care worker during a chemical mass casualty event: an important issue of continuing relevance. Crit Care 2005; 9(4):

14 KOLİNESTERAZ BAĞLANMA BÖLGELERI AchE, substrat için 2 bitişik bağlanma bölgesine sahiptir. 1. bölge "anyoniktir" ve asetilkolinin katyonik dörtlü (quaternary) nitrojenini bağlar. Diğer bölge "esteratic", bir serin residue ve enzim reaksiyonu sırasında salınan protonu kabul eden başka bir nükleofilik grup (bir histidin residuenun imidazolü) NETICEDE; Anyonik bölge, substratın nitrojenini çekerken, esteratik bölgedeki karbonil grubunun elektrofilik karbonu, serin Herz F, Kaplan E. A review: human erythrocyte acetylcholinesterase. Pediatr Res Apr;7(4): Dvir H, Silman I, Harel M, Rosenberry TL, Sussman JL. Acetylcholinesterase: from 3D structure to function. Chem Biol Interact. 2010;187(1-3): ES, esteratik bölge; AS, anyonik substrat bağlama bölgesi; ACS, aromatik katyon bağlanma bölgesi; PAS, periferik anyonik bağlanma bölgesi. Taranmış alanlar, varsayılan hidrofobik bağlanma bölgelerini temsil eder. ACh'nin katalitik merkezin esteratik ve anyonik bölgelerini kapsadığı gösterilmiştir. His ve Ser'in imidazol ve hidroksil yan zincirleri, esteratik bölgede gösterilmektedir. Anyonik bölge içinde, (COO ) n, 6-9 varsayılan negatif yükü temsil eder.

15 KOLİNESTERAZ BAĞLANMA BÖLGELERI - REAKTIVASYON Anyonik bölgede bağlanan maddeler (basit kuaterner bileşikler), substratın bağlanmasını önledikleri için tersinir AchEaz inhibitörleridir (orn.; Prostigmin). Bu tür bir inhibisyon yavaşça geri döndürülebilir. Diizopropilfosfofloridat gibi maddeler, esteratik bölgenin serin kalıntısı ile stabil diizopropilfosfat esterleri oluşturur ve bu da irreversibl inhibe edilmiş AchE ile sonuçlanır. Bu tür bir inhibisyon, insecticides ve sinir gazlarını karakterize eder. 2-piridin aldoxime methiodide (2-PAM) gibi intramoleküler mesafede güçlü bir katyonik gruba sahip bileşikler, diizopropilfosfat grubunu esteratik bölgeden hızla uzaklaştırarak enzim aktivitesini geri getirir. 2-PAM, diizopropilfosfofloridat zehirlenmesi için bir panzehir olarak başarıyla kullanılmıştır. Herz F, Kaplan E. A review: human erythrocyte acetylcholinesterase. Pediatr Res Apr;7(4):

16 Organofosfat, enzim üzerindeki serin hidroksil grubunu fosforile ederek AChE'yi inaktive eder. Fosfoester bağı üzerindeki Oksim (2- pralidoksim) enziminin AChE ile organofosforlu pestisitin katalitik bölge boşluğunun altındaki aktivitesinin etkisi. Adapted from ATSDR (2007) Assis, C.R.D., Linhares, A.G., Cabrera, M.P. et al. Erythrocyte acetylcholinesterase as biomarker of pesticide exposure: new and forgotten insights. Environ Sci Pollut Res 25, (2018). ATSDR (2007) AGENCY FOR TOXIC SUBSTANCES AND DISEASE REGISTRY. Case studies in Environmental Medicine cholinesterase inhibitors: including pesticides and chemical warfare nerve agents. Course WB1102. Available at: gov/csem/csem.html. Atlanta, 153 pp

17 Bir substrat molekülünün [Asetilkolin (ACh) veya butirilkolinin (BCh)] acylation geçiş durumu modellenmistir. İnsan AChE ve insan BChE'nin aktif bolgeleri. The gorge - moleküler yüzey (yarıtransparan gri) and magenta (morumsukırmızı) açil-bağlama kesesi. Katalatik triad (Çubuklarda) ve oksianyon kalıntılarında (çizgiler) cyan daki A-bölgeleri (yeşilimsi-mavi). magenta içindeki tüm açil-baglama keseleri(morumsu-kırmızı). A-bölgelerindeki kolin-bağlama keselerinin kilit aromatik kalıntıları sarı P-bölgesi kalıntıkları rim of the gorge da bulunur(yeşil) Yapısal su molekülleri kırmızı kürelerle gösterilmektedir. A-bölgesindeki hidrojen bağları kesik çizgilerle gösterilmektedir. Rosenberry TL, Brazzolotto X, Macdonald IR, Wandhammer M, Trovaslet-Leroy M, Darvesh S, Nachon F. Comparison of the Binding of Reversible Inhibitors to Human Butyrylcholinesterase and Acetylcholinesterase: A Crystallographic, Kinetic and Calorimetric Study. Molecules Nov 29;22(12):2098.

18 GORGE GİRİŞLERİNİN LOKASYONU 12 den itibaren saat yönünde ana geçit girişi, ikinci ön kapı, yan kapı, ikinci arka kapı, arka kapı ve üçüncü ön kapıdır. Su molekülleri V şeklindedir ve mavi küre sodyum iyonudur. B1 B7 olarak işaretlenmiş yedi su molekülü ve çoğu zaman protein de içine gömülü halde bulunmaktadır. Henchman RH, Tai K, Shen T, McCammon JA. Properties of water molecules in the active site gorge of acetylcholinesterase from computer simulation. Biophys J May;82(5):

19 ORTHO-7 (OXIME İLACI) NIN ASETİLKOLİNESTERAZ İLE KONJUGE OLAN TABUN GORGENUN AKTİF BÖLGESİNİN TRANSLOKASYON ENERJİTİĞİ (Mus musculus)mache Katalitik triad ve anyonik alt bölge sırasıyla pembe ve mavi rankle gösterilirken, periferik anyonik bölge (PAS) bölgesi leylak rengi (soluk mor) ile gösterilir. İlaç molekülü Ortho-7, protein gorge dan harmonik bir yay ile çekilir. Ortho-7 (oxime drug)un kimyasal şekli [1,7-heptylene-bis- N,N -2-pyridiniumaldoxime]. İki piridinyum halkasından biri (aktif piridinyum) aktif triad bölgesine, diğeri (periferik piridinyum) AChE enziminin PAS bölgesine doğru yönlenmiştir. Sinha V, Ganguly B, Bandyopadhyay T. Energetics of Ortho-7 (oxime drug) translocation through the active-site gorge of tabun conjugated acetylcholinesterase. PLoS One. 2012;7(7):e40188

20 ENERGETICS OF ORTHO-7 (OXIME DRUG) TRANSLOCATION THROUGH THE ACTIVE-SITE GORGE OF TABUN CONJUGATED AchE Hidrofobik etkileşimlerden sorumlu kalıntılar pembe renkte gösterilirken, ilaçla hidrojen bağı oluşturan kalıntılar cyan ile renklendirilmiştir. L76 ile birlikte mor renkteki PAS (peripheral anionic site) kalıntıları, Y72 ve W286, gorge'un "bottle neck region unu oluştururlar. Ilacin aktif triad'a (geçidin altında gösterilen S203) erişim sağlamak için burayi ayirmasi gerekir. Y72 ve W286 kalıntıları, ilacın piridinyum halkaları ile iki aşamada güçlü katyon-π etkileşimi oluşturur: ilki aktif piridinyum halkasi ile, ilaç ilk alındığında (snapshot 6) ve ikincisi periferik piridinyum halkasi ile, ilaç tamamen gorge'a bağlandığında (snapshot 9). In the fully captured state, residues W86 ve Y337 (mavi) da aktif piridinyum halkası ile benzer katyon-π etkileşimi oluşturur. Enzimin bağlanma cebini oluşturan ve ilaç yakalama ve salımından sorumlu olan AChE kalıntılarınin gösterildigi moleküler dinamik yörüngelerin anlık görüntüleri (snapshots) Sinha V, Ganguly B, Bandyopadhyay T. Energetics of Ortho-7 (oxime drug) translocation through the active-site gorge of tabun conjugated acetylcholinesterase. PLoS One. 2012;7(7):e40188

21 ERİTROSIT-PLAZMA ENZİM(LER) FARKLARI

22 Hem serum hem de eritrosit kolinesteraz aktivitesi, Amerika Birleşik Devletleri'nde en yaygın kullanılan pestisitler arasında yer alan bu insektisitler tarafından inhibe edilir. AChE'nin eritrositlerdeki yarı ömrü 2-3 ay iken, serum kolinesterazın (psödokolinesteraz) yarı ömrü yaklaşık 8 gündür. Bu nedenle, eritrosit AChE, organofosfatlara kronik ve geçici olarak uzak maruziyetin bir göstergesidir.

23 ENZİM FARKLARI AchE, asetilkolini daha hızlı hidrolize ederken Psödokolinesteraz, butirilkolini daha hızlı hidrolize eder. Eritrosit AChE'ye özgü aktivite, çok daha yüksek bireyler arası ve bireyler arası varyasyon sunan plazma BChE'nin aksine nispeten sabittir. AChE (1 to 3 months), BChE (a few days to weeks)'ye kıyasla antikolinesteraz ajanlarına karşı daha yavaş spontan rejenerasyona uğrar, böylece daha uzun sureli bir maruziyet sonrasinda bu tür bileşikleri tespit etme şansını arttırır ve eritrosit AChE'nin prognostik önemini gösterir. Psödokolinesterazın yarı ömrü yaklaşık 8-16 saattir. İleri KC hastalığı olan hastalarda Süksinilkolin ile nöromüsküler blokaj meydana gelmeden önce azalma % 75 olmalıdır. Nonspesifik? Akut miyokard infarktüsü vakalarının % 90.5'inde plazma psödokolinesteraz yükselmesi gözlenmiştir. AchE in varlığı, karın duvarı defektleri ve nöral tüp defektleri dahil olmak üzere birçok yaygın doğum kusurunu doğrulayabilir. Assis, C.R.D., Linhares, A.G., Cabrera, M.P. et al. Erythrocyte acetylcholinesterase as biomarker of pesticide exposure: new and forgotten insights. Environ Sci Pollut Res 25, (2018).

24 ENZİM FARKLARI Eritrositte AchE Alles and Hawes (1940) ilk kez 1940 yılında eritrosit enziminin beyin esteraza benzediğini ancak serumda bulunan kolinesterazdan belirgin şekilde farklı olduğu 1949'da Pritchard Artan AchE aktivitesinin genç eritrositin bir özelliği olduğuna dair ilk doğrudan kanıt, (Retikülositten zenginlerde yüksek aktivite ve retikülositten fakir fraksiyonlarda düşük aktivite bulunmuştur). Sabine, O grubunun eritrositlerini A-tipi normal alıcılara nakletmiş,ardından donör hücrelerini izole etmiş ve benzer sonuçlar elde etmiştir. *BRAUER, R. W., AND ROOT, M. A.: The cholinesterase of human erythrocytes. Fed. Proc, 4: 113 (1945). Herz F, Kaplan E. A review: human erythrocyte acetylcholinesterase. Pediatr Res Apr;7(4): GALEHR, O., AND PLATTNER, F.: Uber das Schicksal des Acetylcholins im Blute. Seine Zerstorung im Blute verschiedener Saugetiere. Pflueger's Arch. Gesamte Physiol. Menschen Tiere, 218: 506 (1927). ALLES, G. A., AND HAWES, R. C: Cholinesterases in the blood of man. J. Biol. Chem., 133: 375 (1940). SABINE, J. C: Choline esterase of blood cells and plasma in blood dyscrasias, with special reference to pernicious anemia. J. Clin. Invest., 19: 833 (1940). PRITCHARD, J. A.: Erythrocyte age and cholinesterase activity. Amer. J. Physiol., 158: 72 (1949) SABINE, J. C: The cholinesterase of erythrocytes in anemias. Blood, 6: 151 (1951). SABINE, J. C: Erythrocyte cholinesterase titers in hematologic disease states. Amer. J. Med., 27: 81 (1959).

25 ENZİM FARKLARI - KOLINESTERAZ AKTIVITESINI ETKILEYEN FAKTÖRLER Kan kolinesteraz aktivitesini etkileyen faktörler (adapted from ATSDR 2007) Assis, C.R.D., Linhares, A.G., Cabrera, M.P. et al. Erythrocyte acetylcholinesterase as biomarker of pesticide exposure: new and forgotten insights. Environ Sci Pollut Res 25, (2018). ATSDR (2007) AGENCY FOR TOXIC SUBSTANCES AND DISEASE REGISTRY. Case studies in Environmental Medicine cholinesterase inhibitors: including pesticides and chemical warfare nerve agents. Course WB1102. Available at: gov/csem/csem.html. Atlanta, 153 pp

26 KOLİNESTERAZ ENZİMİ ESAS PATOLOJİ Epidemiology Dünya çapında tahminen 3 milyon insan her yıl organofosfatlara maruz kalıyor ve bu da yaklaşık ölüme neden oluyor. ABD'nde, çok az ölümle birlikte yılda yaklaşık 8000 maruziyet vardır. Maruz kalma çoğu zaman bir tarım ilacından kaynaklanırken, aynı zamanda organofosfat bileşikleri de içeren karınca ve hamam böceği spreyi gibi ev eşyaları vardır. Küresel olarak, organofosfatlı böcek ilaçlarına bağlı % 2-25 arasında değişen ölüm oranları bulunmakta en yaygın böcek ilaçları fenitrothion, diklorvos, malathion ve triklorfondur. En yaygın ölüm nedeni solunum yetmezliğidir. - Robb EL, Baker MB. Organophosphate Toxicity Jul 27. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2021

27 KOLİNESTERAZ ENZİMİ ESAS PATOLOJİ Aşırı ACh birikimi sinaptik aralıkta nikotinik ve muskarinik klinik bulgulara neden olur. Pathophysiology Organofosfat insektisitlerin özelliği, karboksil ester hidrolazların (esas olarak AChE) inhibisyonudur. Organofosfat, enzim üzerindeki serin hidroksil grubunu fosforile ederek AChE'yi inaktive eder. AChE nin özellikle organofosforlu, klorlu ve karbamatlı pestisitler ile dönüşümsüz inhibisyonu canlı dokudaki sinir sinapslarında ve nöromüsküler kavşaklarda ACh nin artmasına yol açıp, Ach reseptörlerinin aşırı stimülasyonuna neden olur. Sonuçta AcH birikimi kolinerjik bulguların ağırlıkta olduğu bir toksisite tablosu oluşturmaktadır. Güven A. Asetilkolinesteraz ın önemi ve inhibitörleri. Kafkas Üni Vet Fak Derg, 2000;6 (1-2): Saydam CK, Sözmen B, Aslan LS. Organofosfor zehirlenmelerine yaklaşım. Türkiye Klinikleri J Med Sci, 2006; 26: Namba T. Cholinesterase inhibition by organophosphorus compounds and clinical effects. Bull Wld Hlth Org. 1971; 44: Heath DF. Organophosphorus poisons. Volume 13. Newyork. Pergamon Pres, 1961; Robb EL, Baker MB. Organophosphate Toxicity Jul 27. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2021

28 Erkek ve kadınlarda AChE ve BChE aktivitelerinin dağılımı. Hesaplanan medyan değerler kırmızı bir çizgi ile işaretlenmiştir. Worek F, Schilha M, Neumaier K, Aurbek N, Wille T, Thiermann H, Kehe K. On-site analysis of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase activity with the ChE check mobile test kit-determination of reference values and their relevance for diagnosis of exposure to organophosphorus compounds. Toxicol Lett May 13;249:22-8.

29 ÖLÇÜM TEKNİKLERİ - YÖNTEMLER

30 GENEL BILGI Biyolojik numunelerde AChE aktivitesinin ölçümü için spektrofotometrik yontemler, eletrokimyasal yontemler, ph belirleme testleri ve radyoaktif testler dahil olmak üzere bir dizi geleneksel yöntem bildirilmiştir. Gunumuzde, standart Ellman yontemi en yaygın yontemlerden biri olarak hizmet etmektedir. Hassasiyeti artırmak için MS tabanlı HPLC testleri gibi bazı alternatif yöntemler geliştirilmiştir. Peng L, Rong Z, Wang H, Shao B, Kang L, Qi H, Chen H. A novel assay to determine acetylcholinesterase activity: The application potential for screening of drugs against Alzheimer's disease. Biomed Chromatogr Oct;31(10). Del Carlo M, Pepe A, Sergi M, Mascini M, Tarentini A and Compagnone D. (2010). Detection of coumaphos in honey using a screening method based on an electrochemical acetylcholinesterase bioassay. Talanta, 81 (1-2): Haigh JR, Lefkowitz LJ, Capacio BR, Doctor BP and Gordon RK. (2008). Advantages of the WRAIR whole blood cholinesterase assay: comparative analysis to the micro-ellman, Test-mate ChE, and Michel (DeltapH) assays. Chem Biol Interact, 175 (1-3): He P, Davies J, Greenway G and Haswell SJ. (2010). Measurement of acetylcholinesterase inhibition using bienzymes immobilized monolith micro-reactor with integrated electrochemical detection. Anal Chim Acta, 659 (1-2): Kao LT and Gratzl M. (2009). Serum cholinesterase assay using a reagent-free micro ph-stat. Anal Biochem, 389 (2): Ellman GL, Courtney KD, Andres V, Jr. and Feather-Stone RM. (1961). A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem Pharmacol, 7: Hu F, Zhang H, Lin H, Deng C and Zhang X. (2008). Enzyme inhibitor screening by electrospray mass spectrometry with immobilized enzyme on magnetic silica microspheres. J Am Soc Mass Spectrom, 19 (6): Peng L, Jiang T, Rong Z, Liu T, Wang H, Shao B, Chen H. (2011). Surrogate based accurate quantification of endogenous acetylcholine in murine brain by hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 879 (32): Spencer JD, Rushton D and Allen KR. (2010). A simple liquid chromatography linked to tandem mass spectrometry method for measurement of serum cholinesterase activity using succinylcholine as substrate. Ann Clin Biochem, 47 (Pt 3):

31 KOLORİMETRİK METOD Serum ve plazma kolinesterazın (CHE) kantitatif tayini ÇALIŞMA PRENSİBİ Yöntem, CHE için spesifik substrat olarak butiriltiokolini kullanır. CHE, bütiriltiokolin hidrolizini katalize ederek bütirat ve tiyokolin oluşturur. Tiyokolin, hekzasiyanoferratı (III) (sari) hekzasiyanoferrata (II) (renksiz) indirger. Absorbanstaki azalma numunedeki CHE aktivitesiyle doğru orantılıdır. Ölçüm Araliği: Tespitaralığı 150 U/L to Lineer limit U/L. INTERFERANSLAR 20 mg/dl ye kadar askorbik asit bulunması, 1000 mg/dl e kadar hemoglobin, bilirubin 60 mg/dl ve lipid 1000 mg/dl. 6 aya kadar olan bebeklerde, CHE aktivitesi yetişkinlere göre% 40 ila% 50 daha yüksektir. Genç kadınlarda enzim aktivitesi yetişkin erkeklerdekinin yaklaşık% 64 ila% 74'üdür. Hamilelik sırasında aktivite azalır. Yucesan B, Kurt M, Sezen F, Subasi SA. İlaçlama sektöründe çalışan işçiler ile zehirlenme şüphesi görülen hastaların kolinesteraz seviyelerinin belirlenmesi. Turk Hij Den Biyol Derg, 2013; 70(1): 7-14.

32 DIFERANSIYEL PH PROTOKOLÜ 820 ul çalışma tamponu içeren diferansiyel ph aparatının karıştırmkuyucuğuna 20 numune (plazma), ardından 10 ul 275 mmol/l asetilkolin çözeltisi (7,6 mmol / L, nihai konsantrasyon ) eklendi. Eritrosit kolinesteraz aktivitesinin ölçümü için 10 ul tam kan ve 820 ul kinidin içeren çalışma tamponu kullanıldı. Daha sonra reaksiyonu başlatmak için 10 ul 69 mmol / L (2,0 mmol / L, nihai konsantrasyon) asetilkolin ilave edildi. Tampona 275 mmol / L asetilkolin çözeltisinin 10 ul ilavesi, 4 x 10-4 ph / dakikalık boş bir sürüklenme oluştururken, 10 ul 69 ile 1 x 10-4 ph / dakikalık bir sapma elde edildi. Normal bir numunenin ölçümü sırasında geliştirilen tipik ph değişiklikleri -zaman akışı grafiği, Şekil 1'de gösterilmektedir. Yukarıda bildirilen asetilkolin çözeltisi hacimleri kullanılarak uzun süreli doğrusal oranlar elde edildi; 30 saniyelik bir gecikme fazı ve 90 saniyelik bir ölçüm süresi rutin olarak kullanıldı. Barenghi L, Ceriotti F, Luzzana M, Ripamonti M, Mosca A, Bonini PA. Measurement of erythrocyte acetylcholinesterase and plasma cholinesterase activity by a differential ph technique. Ann Clin Biochem Sep;23 ( Pt 5):

33 DIFERANSIYEL PH PROTOKOLÜ Barenghi L, Ceriotti F, Luzzana M, Ripamonti M, Mosca A, Bonini PA. Measurement of erythrocyte acetylcholinesterase and plasma cholinesterase activity by a differential ph technique. Ann Clin Biochem Sep;23 ( Pt 5):

34 DIFERANSIYEL PH PROTOKOLÜ Barenghi L, Ceriotti F, Luzzana M, Ripamonti M, Mosca A, Bonini PA. Measurement of erythrocyte acetylcholinesterase and plasma cholinesterase activity by a differential ph technique. Ann Clin Biochem Sep;23 ( Pt 5):

35 Tayin yöntemi- Kolorimetrik Örnek tipi- Tam kan Genel bakış Cholinesterase Activity Assay Kit (Colorimetric) (ab235937) Kolinesteraz Aktivite Test Kiti (Kolorimetrik), plazmayı ayırmadan tam kan örneklerinde AChE ve BChE aktivitelerini ölçmek ve ayırt etmek için spesifik asetilkolinesteraz (AChE; EC ) ve butirilkolinesteraz (BChE; EC ) substratları ile selektif BChE inhibitörünü birleştirir. Kan örneklerinin antikolinesteraz bileşiklerine maruziyetini değerlendirmek için basit, uygulaması kolay ve klinik araştırmalarda kullanışlıdır. Notlar Kolinesteraz (ChE), kolin esterlerini hidrolize eden bir grup enzimden oluşur. Kanda iki ChE izoenzimi vardır: asetilkolinesteraz (AChE; EC ), aynı zamanda eritrositler veya esas olarak RBC'lerde bulunan gerçek ChE olarak da bilinir; ve plazmada bulunan, plazma ChE veya psödo-che olarak da bilinen bütirilkolinesteraz (BChE; EC ). Kan AChE veya BChE aktivitesi, zehirli kimyasal maddelere, organofosfatlar veya karbamatlar gibi insektisitlere, anestetiklere ve AD'yi tedavi etmek için kullanılan donepezil veya rivastigmin dahil olmak üzere çeşitli terapötik ilaçlara maruz bırakılarak seçici olarak azaltılabilir. Bu nedenle, Kan Kolinesterazları (ChE = AChE + BChE), baskılanmış ve / veya artmış merkezi ve periferik sinir sistemi aktivitesinin potansiyel biyobelirteçleri ve olası terapötikleri doğrula araçlarıdır.

36 Butyrylcholinesterase Assay Kit (ab241010) Ürüna dı- Butyrylcholinesterase Assay Kit Tayin yöntemi- Kolorimetrik Araştırma Alankarı Fonksiyon Nörotransmiter asetilkolinin inaktivasyonuna katkıda bulunur. Nörotoksik organofosfat esterlerini indirgeyebilir. Doku özgüllüğü - Eritrositler dışında çoğu hücrede bulunur. Hastalkta tutulum BCHE'deki kusurlar BChE eksikliğinin nedenidir [MIM: ]. BChE eksikliği, kas gevşetici süksinilkolin veya mivakuryum ve diğer ester lokal anestetikler dahil olmak üzere belirli anestezik ilaçların kullanımından sonra uzamış apne ile karakterize metabolik bir bozukluktur. Kalıtsal durum, bir OR özelliği olarak aktarılır.

37 ChE testi için tasarlanmıştır Özellikleri: CE labeled 4 dakikada sonuç Parmaktan örnek Taşınabilir Kullanıcı, kritik sonuçları yorumlamak için uzmana danışmalı Askeri ve sivil amaçlar için geliştirildi (1) Askeri çatışmalarda ve terörist saldırılarda organofosfat zehirlenmesi (2) Toksik zirai kimyasallarla akut pestisit zehirlenmesi C arasında çalışabilir.

38 CHE kontrol mobil test kiti ile AChE (üst) ve BChE aktivitesinin (alt) belirlenmesi için modifiye Ellman testinin şematik reaksiyonları. Worek F, Schilha M, Neumaier K, Aurbek N, Wille T, Thiermann H, Kehe K. On-site analysis of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase activity with the ChE check mobile test kit-determination of reference values and their relevance for diagnosis of exposure to organophosphorus compounds. Toxicol Lett May 13;249:22-8.

39 HASTANEYE YATIŞ VE TABURCUDAKİ ROLÜ

40

41 Devanur R.M.M. Prasad, Prasanna S. Jirli, Mahadevaiah Mahesh, Shivanagappa Mamatha. Relevance of Plasma Cholinesterase to Clinical Findings in Acute Organophosphorous Poisoning. Asia Pacific Journal of Medical Toxicology /APJMT

42 Devanur R.M.M. Prasad, Prasanna S. Jirli, Mahadevaiah Mahesh, Shivanagappa Mamatha. Relevance of Plasma Cholinesterase to Clinical Findings in Acute Organophosphorous Poisoning. Asia Pacific Journal of Medical Toxicology /APJMT

43 Zivkovic AR, Schmidt K, Stein T, Münzberg M, Brenner T, Weigand MA, Kleinschmidt S, Hofer S. Bedside-measurement of serum cholinesterase activity predicts patient morbidity and length of the intensive care unit stay following major traumatic injury.

44 OZET Kolinerjik sistem, immune response'u hızlı bir şekilde modüle ederek enflamasyona karşı koyar. BChE, aktivitesindeki değişikliğin morbidite ve YBÜ'de kalış süresi ile ilişkili olup olmadığı? 10 sağlıklı gönüllüden ve 44 major traumatic injury (MTI) hastasından kan örnekleri hastaneye kabulde toplandı ve ardından 12, 24 ve 48 saat sonra ölçümler yapıldı. BChE aktivitesini belirlemek için point-of-care test yaklaşımı kullanıldı. Hastaneye kabul sırasında ölçülen BChE aktivitesi, anlamlı ve sürekli bir azalma gösterdi ve hastaneye yatıştan 24 saat sonra elde edilen hastalık şiddeti skorları ile korelasyon gösterdi. Hastaneye kabul sırasında elde edilen BChE aktivitesi, YBÜ'de kalış süresiyle ilişkiliydi. BChE aktivitesinin yatak başı ölçümü, YBÜ'deki tedaviyi optimize edebilir. Zivkovic AR, Schmidt K, Stein T, Münzberg M, Brenner T, Weigand MA, Kleinschmidt S, Hofer S. Bedside-measurement of serum cholinesterase activity predicts patient morbidity and length of the intensive care unit stay following major traumatic injury.

45 (a) Dağılım grafiği, acil servise vardıklarında travma hastalarından elde edilen ISS puanlarını temsil eder. (b) Hastaneye kabul sırasında 10 sağlıklı gönüllüden (kontrol, açık daireler) ve 44 majör travma hastasından (kapalı daireler) ölçülen BChE aktivitesini temsil eder. (c) Hastaneye yatıştan 12, 24 ve 48 saat sonra yaralı hastalarda ölçülen BChE aktivitesi, hastaneye kabul sırasındaki ilk ölçümle karşılaştırıldığında önemli ölçüde azalmıştır. (d) (c) 'de gösterilen BChE aktivite verileri, hastaneye girişte elde edilen başlangıç değerlerine göre normalleştirilmiştir. (e) CRP aktivitesi, hastaneye yatıştan 12 saat sonra başlayan sürekli bir artış olduğunu ortaya koydu. (f) WBC'deki ilk yükselme 12 saat sonra azaldı ve gözlem süresi boyunca sabit kaldı. ISS Injury Severity Score **p<0.01; ***p<0.001 Zivkovic AR, Schmidt K, Stein T, Münzberg M, Brenner T, Weigand MA, Kleinschmidt S, Hofer S. Bedside-measurement of serum cholinesterase activity predicts patient morbidity and length of the intensive care unit stay following major traumatic injury.

46 Hastaneye kabulde ölçülen BChE aktivitesi, 24 saat sonra elde edilen hastalık şiddeti skorları ile ilişkilidir. Hastaneye kabulde majör travma hastalarından ölçülen BChE aktivitesinin ve 24 saat sonra elde edilen APACHE II (a), SAPS II (b) ve SOFA (c) skorlarının korelasyonu Zivkovic AR, Schmidt K, Stein T, Münzberg M, Brenner T, Weigand MA, Kleinschmidt S, Hofer S. Bedside-measurement of serum cholinesterase activity predicts patient morbidity and length of the intensive care unit stay following major traumatic injury.

47 Hastaneye kabul sırasında ölçülen BChE aktivitesi, majör travmatik yaralanması olan hastalarda YBÜ'de kalış süresi ile ilişkilidir. Hastaneye kabulde (a) ve 48 saat sonra (b) travma hastalarından ölçülen BChE aktivitesi, YBÜ'de kalış süreleri ile ilişkilidir. Hastalık şiddeti skorları, majör travmatik yaralanmayı (MTI) takiben YBÜ'de kalış süresiyle ilişkilidir. (a) Elde edilen ISS puanı, ciddi şekilde yaralanan hastaların YBÜ'de kalış süresiyle ilişkilidir. (b) APACHE II, (c) SAPS II ve (d) MTI'yi takiben hastaneye yatıştan 24 saat sonra alınan SOFA skorları, YBÜ'de kalış süresiyle ilişkilidir. Zivkovic AR, Schmidt K, Stein T, Münzberg M, Brenner T, Weigand MA, Kleinschmidt S, Hofer S. Bedside-measurement of serum cholinesterase activity predicts patient morbidity and length of the intensive care unit stay following major traumatic injury.

48 KLİNİKLE UYUMU - BAŞKA OLAYLARDA TANISAL DEĞERİ VAR MI? - YAYINLAR

49 RSHMB UZEM (Ulusal Zehir Danışma Merkezi) verilerine göre pestisit zehirlenmeleri 2000 yılında UZEM e müracaat eden toplam hastaların %8,3 (1.518) ünü, 2001 yılında ise %8,5 (1.472) ini oluşturmuştur. Ayrıca RSHMB UZEM verilerine göre; pestisit toksisitesi Türkiye de en fazla yaş grubunda görüldüğünü bildirmiştir. Dawson AH, Eddleston M, Senarathna L, Mohamed F, Gawarammana I, Bowe SJ, et al. Acute human lethal toxicity of agricultural pesticides: a prospective cohort study. PLoS Med, 2010; 26: 7(10); e Cesaretli Y, Özcan N, Özer N, Olcay HE. The evaluation of pesticide exposures in the years of in Turkey. Refik Saydam Hygene Institute, Poison information Center data in the years of

50

51 Psödokolinesteraz (PKE), süksinilkolinin (depolarizan bir nöromüsküler bloker) hidrolizinden sorumludur. PKE süksinilkolini önce süksinilmonokolin, daha sonra da süksinik aside metabolize ederek etkisini sonlandırmaktadır. Eksikliğinde, normal koşullarda yaklaşık olarak 5-10 dakika süren süksinilkolinin etkisi uzamakta ve birkaç saate kadar sürebilmektedir. Yeni hızlı ve kısa etkili non-depolarizan nöromüsküler blokerlerin kullanıma girmesi ile birlikte süksinilkolin kullanımını klinik pratikte giderek azalmıştır, fakat zor havayolu, tok hasta, elektrokonvülzif tedavi gibi durumlarda hâlâ klinisyenlerin ilk tercihi olmaya devam etmektedir. Kullanım endikasyonu olan durumlarda, hastanın PKE enziminin olası eksikliği düşünülmelidir.

52 ERITROSIT MEMBRAN ACHE AKTIVITESI - HASTALIK ILISKISI Yaşlı insanlarda ve yenidoğanlarda azalmış eritrosit AChE aktivitesi kanıtlanmıştır. Farklı yaşlardaki eritrositlerin in vitro olarak hazırlanan alt fraksiyonları, yasli RBC'lerin genç RBC alt popülasyonlarından daha düşük bir AChE enzim aktivitesi sergilediğini, eritrosit AChE'nin yaşlanmanın biyobelirteci olarak kabul edildiğini göstermistir. Paroksismal noktürnal hemoglobinürili hastalar ve hemolitik anemili hastalarda, düşük eritrosit AChE seviyeleri karakteristiktir. Jaromin A., Korycińska M., Piętka-Ottlik M., Musiał W., Peczyńska-Czoch W., Kaczmarek L., Kozubeka A. Membrane perturbations induced by new analogs of neocryptolepine. Biol. Pharm. 2012;35: Herz F., Kaplan E. A Review: Human erythrocyte acetylcholinesterase. Pediatr. Res. 1973;7: Hilário S., Saldanha C., Martins e Silva J. An in vitro study of adrenaline effect on human erythrocyte properties in both gender. Clin. Hemorheol. Microcirc. 2003;28: Prall Y.G., Gambhir K.K., Ampy F.R. Acetylcholinesterase: An enzymatic marker of human red blood cell aging. Life Sci. 1998;63:

53 ERITROSIT MEMBRAN ACHE AKTIVITESI - HASTALIK ILISKISI Rutin anjiyografi yapilan insülin bagimli olmayan DM hastalarında, RBC AChE enzim aktivitesinde bir bozulma ve floresein enjeksiyonundan sonra hidrofobik eritrosit membraninda akışkanlıkta azalma gosterilmistir. Parkinson, esansiyel hipertansiyon, glokom, retinal vaskülit, amiyotrofik lateral skleroz (ALS) ve Hirschsprung hastalığı gibi farklı hastalıklardan muzdarip hastalardan alınan kan örneklerinde gerceklestirilen çalışmalar, RBC AChE enzim aktivitesinin artmış seviyelerini gostermektedir. TANISAL BELIRTEC? Prall Y.G., Gambhir K.K., Ampy F.R. Acetylcholinesterase: An enzymatic marker of human red blood cell aging. Life Sci. 1998;63: Sargento L., Zabala L., Saldanha C., Ramalho P.S., Silva J.M. The effect of sodium fluorescein angiography on erythrocyte properties. Clin. Hemorheol. Microcirc. 1998;18: Coelho H., Azevedo M., Proença C., Martins e Silva J., Manso C. Plasma dopamine-beta-hydroxylase and erythrocyte acetylcholinesterase in a group of patients with Parkinson disease. J. Neur. Transm. 1978;42: Martins e Silva J., Proença M.C., Nogueira J.B., Clara J.G., Costa J.N., Manso C. Erythrocyte acetylcholinesterase in essential hypertension. J. Neural Transm. 1980;49: Zabala L., Saldanha C., Martins e Silva J., Ramalho P.S. Red blood cell membrane integrity in primary open angle glaucoma: Ex vivo and in vitro studies. Eye. 1999;13: Ramalho P.S., Hormigo A., Martins R., Saldanha C., Martins Silva J. Haematological changes in retinal vasculitis. Eye. 1988;2: Duarte C., Pinto S., Napoleão P., Pronto-Laborinho A.C., Barros M.A., Freitas T., de Carvalho M., Saldanha C. Identification of erythrocyte biomarkers in amyotrophic lateral sclerosis. Clin. Hemorheol. Microcirc. 2016;64: Chalkoo M.A., Rashid A., Kakroo S.M., Razvi S.A., Wani A.A. Role of erythrocyte acetylcholinesterase in the diagnosis of hirschsprung s Disease. J. Pioneer. Med. Stud. 2013;3:79 82.

54 ERITROSIT MEMBRAN ACHE AKTIVITESI - HASTALIK ILISKISI RBC'lerde artmis AChE enzim aktivitesi, kanda yüksek inflamatuar molekül konsantrasyonları, ROS ve reaktif nitrojen türlerinin varlığı ile karakterize edilen inflamatuar vasküler hastalıklar olan glokom, esansiyel hipertansiyon ve ALS'de doğrulanmıştır. Sonuç olarak, eritrosit AChE, inflamasyonun bir belirteci olarak kabul edilebilir? Martins e Silva J., Proença M.C., Nogueira J.B., Clara J.G., Costa J.N., Manso C. Erythrocyte acetylcholinesterase in essential hypertension. J. Neural Transm. 1980;49: Zabala L., Saldanha C., Martins e Silva J., Ramalho P.S. Red blood cell membrane integrity in primary open angle glaucoma: Ex vivo and in vitro studies. Eye. 1999;13: Chalkoo M.A., Rashid A., Kakroo S.M., Razvi S.A., Wani A.A. Role of erythrocyte acetylcholinesterase in the diagnosis of hirschsprung s Disease. J. Pioneer. Med. Stud. 2013;3: Harrison D.G., Guzik T.J., Lob H.E., Madhur M.S., Marvar P.J., Thabet S.R., Vinh A., Weyand C.M. Inflammation, immunity, and hypertension. Hypertension. 2011;57: Galassi F., Renieri G., Sodi A., Ucci F., Vannozzi L., Masini E. Nitric oxide proxies and ocular perfusion pressure in primary open angle glaucoma. Br. J. Ophtalmol. 2004;88: Rafael R. Protein tyrosine nitration: Biochemical mechanisms and structural basis of its functional effects. Acc. Chem. Res. 2013;46: Silva-Herdade A.S., Saldanha C. Effects of acetylcholine on an animal model of inflammation. Clin. Hemorheol. Microcirc. 2013;53:

55 Cholinergic deficiency in AD has received noticeable attention to target AChE for disease therapy. AchE inhibitors including galantamine, rivastigmine and donepezil are currently the most important first-line treatments for AD. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)-ESI- MS assay has been currently developed to improve the method. To eliminate endogenous butyrylcholinesterase activity present in tissue, 10 µl of 2 mm iso-ompa (tetraisopropyl pyrophosphoramide) in tris buffer was added to 10 µl brain homogenate supernatants We developed a new method to exploit acetylcholine-d 4 as a surrogate substrate of ACh and measure product cholined 4 via LC-MS/MS. This assay detected activity of AChE present in the normal mouse brain, which is consistent with the standard Ellman assay that determines products spectrophotometrically. Lassiter TL, Marshall RS, Jackson LC, Hunter DL, Vu JT and Padilla S. (2003). Automated measurement of acetylcholinesterase activity in rat peripheral tissues. Toxicology; 186 (3): Naik RS, Doctor BP and Saxena A. (2008). Comparison of methods used for the determination of cholinesterase activity in whole blood. Chem Biol Interact, 175 (1-3):

56 Serum kolinesterazın (BChE) yanıklar dahil akut enflamatuar hastalıklarda klinik olarak ilgili bir biyobelirteç olduğu gösterilmiştir. Bu gözlemsel kohort çalışmasında BChE aktivitesi POCT kullanılarak ölçülmüştür. POCT ölçümleri, 35 hastanın acil servise kabulünde yapılmış ve 12, 24 ve 48 saat sonra tekrarlanmıştır. Yanık yaralanması olan hastaların, hastaneye kabulünü takiben BChE aktivitesinde sürekli azalma gözlemlenmiştir. BChE aktivitesi, yanık yaralanma şiddeti, organ yetmezliği şiddeti ve yoğun bakım ünitesi kaynak gereksinimleri ile negatif korelasyon göstermiştir. Son olarak, POCT tarafından ölçülen BChE aktivitesi, kısaltılmış yanık ciddiyet indeksi (ABSI) skorlamasını tamamlayabilir ve akut yanık bakımı tedavisinde muhtemelen erken risk sınıflandırmasını iyileştirebilir olduğu sonucuna varılmıştır.

57 Özet Background: Rektal mukozal biyopsilerin donmuş kesitlerinde artmış asetilkolinesteraz (AChE) aktivitesi, Hirschsprung hastalığını (HD) doğru bir şekilde teşhis eder. Ancak bir tarama testi olarak kanda bir biyobelirteç arayışı, kişiyi kanda AChE'yi aramaya ve bunun HD teşhisindeki rolünü incelemeye yönlendirir. Amaç: Normal çocuklarda plazma ve eritrositlerde AChE aktivitesini tahmin etmek için düşük maliyetli güvenilir bir yöntem geliştirmek (kontrol) ve bunun HD'deki rolünü incelemek (test). Materyal ve metod: Kan için AChE testi. rektal mukozal biyopsilerin altın standart doku AChE histokimyası ile karşılaştırılmıştır.. Results: Ellman'ın optimum modifiye edilmiş metotları, plazma AChE aktivitesini analiz etmek için en uygun bulundu, Wilson ve Henderson'ın metodu, RBC'lerde ekstraksiyon ve AChE tahmini için optimaldi. Conclusion: Test kan örnekleri için belirlenen, birbirini dışlayan AChE aktivite aralığı normal ile örtüştü ve bu nedenle HD IÇIN BIR TANI ARACI OLARAK KABUL EDILMEDI. Anahtar Kelimeler: Asetilkolinesteraz enzim testi; Ellman yöntemi; Hirschsprung hastalığı; plazma; Kırmızı kan hücreleri.

58 AChE aktivitesi, bir akış detektöründe online analiz edildi

59 Enzim reaktörünün eklenmesinden sonra, RBC'lerin hemolizinden ve dolayısıyla hemoglobinin yıkanmasından kaynaklanan iki kısa süreli pik meydana gelmektedir. Ach (0.45 mm, 30 dakika) ekledikten sonra, absorbans değerleri yaklaşık 500 mau'ya yükselmis ve bu seviyede sabit kalmistir. t = 180 dakikada blank değerler (DTNB, asetiltiyokolin ve jelatin içeren fosfat tamponu), enzim reaktörünün çıkarılması ve tampon blank başlangıç değerine dönmesinden önce boş bir filtre yerleştirilmesiyle belirlenmiştir. Herkert NM, Lallement G, Clarençon D, Thiermann H, Worek F. Comparison of the oxime-induced reactivation of rhesus monkey, swine and guinea pig erythrocyte acetylcholinesterase following inhibition by sarin or paraoxon, using a perfusion model for the real-time determination of membrane-bound acetylcholinesterase activity. Toxicology. 2009;258(2-3):79-83.

60 AChE'nin sarin ve paraoxon (PXE) ile inhibisyonu takiben oksimlerle yeniden aktivasyonu Fig. 2. Time course of AChE activity from deep-frozen and thawed rhesus monkey (A), swine (B) and guinea pig erythrocytes (C) after inhibition with sarin (50 nm) for 30 min (rhesus monkey and swine) or 60 min (guinea pig) and reactivation with obidoxime (10 M). Following the equilibration phase, the enzyme was inhibited with sarin (30 or 60 min). Then, sarin was discontinued and after a 10 min washout phase, reactivation started with addition of 10 M obidoxime. After 130 min (rhesus monkey and swine) or 160 min (guinea pig), obidoxime was discontinued and the values of reactivated AChE with ATCh, DTNB and buffer were determined. After 150 min (rhesus monkey and swine) or 190 min (guinea pig), the enzyme reactor was replaced by a blank filter and the blank values of the complete perfusion medium, and gelatine buffer only were determined. Fig. 3. Time course of AChE activity from deep-frozen and thawed of rhesus monkey (A), swine (B) and guinea pig erythrocytes (C) after inhibition with paraoxon (PXE; 1 M) for 30 min (rhesus monkey and swine) or 60 min (guinea pig) and reactivation with obidoxime (10 M). Following the equilibration phase, the enzyme was inhibited with paraoxon (30 or 60 min). Then, paraoxon was discontinued and after a 10 min washout-phase, reactivation started with addition of 10 M obidoxime. After 130 min (rhesus monkey and swine) or 160 min (guinea pig), obidoxime was discontinued and the values of reactivated AChE with ATCh, DTNB and buffer were determined. After 150 min (rhesus monkey and swine) or 190 min (guinea pig), the enzyme reactor was replaced by a blank filter and the blank values of the complete perfusion medium, and gelatine buffer only were determined. AChE, acetylcholinesterase; ATCh, acetylthiocholine iodide; DTNB, 5,5'- dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) Herkert NM, Lallement G, Clarençon D, Thiermann H, Worek F. Comparison of the oxime-induced reactivation of rhesus monkey, swine and guinea pig erythrocyte acetylcholinesterase following inhibition by sarin or paraoxon, using a perfusion model for the real-time determination of membrane-bound acetylcholinesterase activity. Toxicology. 2009;258(2-3):79-83.

61 AChE aktivitesi, bir akış detektöründe online analiz edildi

62 Sarin (30 nm) ile inhibisyondan ve obidoksim (10 M) ile yeniden aktivasyondan sonrasinda, insan eritrositlerinde (taranmış kırmızı çizgi) ve beyin dokusunda (düz mavi çizgi) AChE aktivitesinin zaman süreci Mavi çizgi: 0.45 mm ATCh eklenmeden önce biyoreaktör 60 dakika boyunca 0.3 mm DTNB ile yıkandı. Maksimum aktiviteye ulaştıktan sonra, 60 dakika süreyle 30 nm sarin eklendi. 10 dakikalık bir arınma aşamasından sonra, yeniden aktivasyon 10 M obidoksim uygulanarak başlatıldı. Herkert NM, Freude G, Kunz U, Thiermann H, Worek F. Comparative kinetics of organophosphates and oximes with erythrocyte, muscle and brain acetylcholinesterase. Toxicol Lett Mar 7;209(2): Kirmizi çizgi: Maksimum aktiviteyi belirlemek için 0,3 mm DTNB ve 0,45 mm ATCh eklenmeden önce, enzim reaktörüne jelatin içeren fosfat tamponu (0.1 M, ph 7.4), distile su (eritrositlerin hemolizini kolaylaştırmak için) 5 dakika boyunca perfüze edildi Maksimum aktiviteye ulaştıktan sonra, 60 dakika süreyle 30 nm sarin eklendi. Devami soldaki gibi

63 İnsan (A), swine (B) ve guinea pig (C) AChE'nin sarin (insan için 30 nm, kobay ve domuz AChE için 50 nm) tarafından hesaplanan zamana bağlı inhibisyonu. Sarin ile inhibe edilmiş insan (A), swine (B) ve guinea pig (C) AChE'nin (insan için 30 nm ve swine ve guinea pig AChE için 50 nm) obidoksim (10 M) ile hesaplanan zamana bağlı reaktivasyonu Eritrosit (kırmızı kareler) ve beyin dokusu (sarı daireler) Herkert NM, Freude G, Kunz U, Thiermann H, Worek F. Comparative kinetics of organophosphates and oximes with erythrocyte, muscle and brain acetylcholinesterase. Toxicol Lett Mar 7;209(2):173-8.

64 Conclusions; Michaelis-Menten kinetiğinin belirlenmesi, test edilen enzim türlerinin neredeyse aynı Km değerlerine sahip oldugunu gosterdi. Ek olarak, beyin ve eritrosit AChE'nin inhibisyon ve reaktivasyon kinetiği oldukça benzerdi. Bu veriler, farklı dokulardan AChE'nin neredeyse benzer kinetik özelliklere sahip olduğu ve beyin AChE'nin oksimler tarafından reaktivasyona karşı karşılaştırılabilir şekilde duyarlı olduğu görüşünü desteklemektedir. Herkert NM, Freude G, Kunz U, Thiermann H, Worek F. Comparative kinetics of organophosphates and oximes with erythrocyte, muscle and brain acetylcholinesterase. Toxicol Lett Mar 7;209(2):173-8.

65 GUNUMUZ - GELECEK

66 Akıllı telefon kamerası tabanlı kolorimetrik kolinesteraz aktivitesi analizinin, AChE, BChE veya her ikisinin de biyokimyasal birbiyomarker olarak rol oynadığı bakım noktası testi için güvenilir bir araç olduğunu kanıtlanmıştır. Test, standart spektrofotometriye benzer sonuçlar sağlamıştır. Testin özellikleri, bir bakım noktası testi için ümit vericidir ve mevcut klinik ve evde bakım uygulamalarına kolayca uyarlanabilir hale getirmektedir. Akıllı telefon kamerası tabanlı kolorimetrik test, aynı zamanda bakım noktası testlerinin ortak gereksinimlerini ve beklentilerini de karşılamaktadır: basitlik, taşınabilirlik, numunelerle ayrıntılı işlem yapılmaması, düşük maliyet, zararlı reaktiflerin kullanılmaması vb. Pohanka M, Zakova J. A Smartphone Camera Colorimetric Assay of Acetylcholinesterase and Butyrylcholinesterase Activity. Sensors (Basel). 2021;21(5):1796.

67

68

69 İnsan plazması, BChE ile dietoksifosfo, aged etoksifosfo ve dimetoksifosfo eklentileri oluşturmak üzere parathion ve diklorvos'a maruz bırakıldı. Immünopresipitasyon yöntemi ile anti-bche antikorlarına konjuge agaroz boncuklar kullanılarak insan serumunda BChE ekstraksiyonu Ekstrakte edilen BChE pepsin digestion ve LC- MS/MS ile OP-eklenmiş peptidler açısından analiz BChE ve BChE adducts tanımlanması ve ölçülmesinin, insanların birden çok OP pestisitine maruziyetinin teşhisinde faydalı olması beklenmektedir. Indapurkar AS, Eangoor P, Yeh JS, Vakkalanka M, Cashman JR, Knaack JS. A Method for Diagnosing Organophosphate Pesticide Exposure in Humans using Liquid Chromatography Coupled Tandem Mass Spectrometry. J Anal Toxicol Dec