Testosteron çin Enzimimmunassay Tekni inin Gelifltirilmesi*

Transkript

1 Turk J Vet Anim Sci 27 (2003) TÜB TAK Testosteron çin Enzimimmunassay Tekni inin Gelifltirilmesi* Araflt rma Makalesi Bülent GÜVEN Kafkas Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Fizyoloji Anabilim Dal, Kars - TÜRK YE Semin ÖZSAR Kadir Has Üniversitesi, T p Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dal, stanbul - TÜRK YE Nalan MARAfiLI, fiaban MARAfiLI, Ayla ÖZCAN Kafkas Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dal, Kars - TÜRK YE Gelifl Tarihi: Özet: Bu çal flmada, plazmada testosteron tayini için çift antikorlu enzimimmunassay yöntemi gelifltirildi. Testosteron 3-O-CMO, horseradish peroksidaz enzimi ile 'mixed anhydride' yöntemi kullan larak iflaretlendi ve konjugat sephadex G- 25 kolon kromatografisinden geçirilerek saflaflt r ld. Testosteron antikoru, tavflanlar Testosteron-3-O-CMO-BSA ile immunize edilerek üretildi. Testosteron antiserumunun çeflitli steroidler ile çapraz reaksiyon oranlar %<0.01 olarak bulundu. Standart e ri 0-20 ng/ml (0-200 pg/delik) aras nda olup testin hassasiyeti ise 2,5 pg/delik olarak tespit edildi. Testin kantitatif verimi % 98,8 ve deneyleraras varyasyon katsay s %12,6 olarak bulundu. Bu çal flmada gelifltirilen enzimimmunassay, testosteronun rutin tayini için ekonomik bir yöntemdir. Çok az laboratuvar cihaz gerektirdi inden özellikle hayvanc l k konusunda araflt rma yapanlar için kullan fll ve alternatif bir yöntemdir. Anahtar Sözcükler: Testosteron, enzimimmunassay Development of an Enzyme Immunoassay for the Determination of Testosterone Abstract: In this study, a double antibody enzyme immunoassay for the direct determination of testosterone in plasma was developed. Testosterone 3-O-CMO was conjugated with horseradish peroxidase by the mixed anhydride method, and the conjugate purified by column chromatography (sephadex G-25). Testosterone antibody was obtained by immunization of rabbits against Testosterone-3- O-CMO-BSA. Cross reactions of the antiserum against some steroids were found to be <0.01%. The detection limit of the assay was 2.5 pg/well and the working range of the standard curve was 0-20 ng/ml (0-200 pg/well). The recovery was found to be 98.8% after the addition of known amounts of testosterone to plasma samples. The inter-assay coefficient of variation was 12.6%. The described EIA offers a very economical alternative for the routine estimation of testosterone levels. Only minimal laboratory equipment is required and therefore the assay should be especially useful for research in animal science. Key Words: Testosterone, enzyme immunoassay Girifl Testosteron analizi hayvanc l kta puberta öncesi testisin steroidogenic aktivitesinin tespiti, puberta sonras seksüel geliflmenin izlenmesi, seksüel geliflmeye beslenmenin etkisi ve çiftleflme aktivitesi üzerine mevsimsel de iflikliklerin etkisini araflt rmak maksad yla yayg n olarak kullan lmaktad r. Ayr ca, atlarda granulosa hücresi tümörlerinin ve kriptorflizm teflhisinde, köpeklerde leydig hücrelerinin salg yapma durumunun kontrolünde ve fertilite kontrolünde, kedilerde leydig hücre fonksiyonunu de erlendirmede testosteron analizlerinden faydalan lmaktad r. * Bu çal flma Kafkas Üniversitesi Araflt rma Fonunca desteklenmifl (97 VF 014) ve Kafkas Üniversitesi Hayvanc l k Araflt rma ve Uygulama Merkezinde yap lm flt r. 45

2 Testosteron çin Enzimimmunassay Tekni inin Gelifltirilmesi Testosteronun doping amac yla kullan lmas nda illegal kullan mlar tespit için testosteron analizleri rutin olarak yap lmaktad r (1-7). Hayvanc l kta verimin art r lmas için kullan lan seleksiyon ve melezleme gibi geleneksel yöntemler yayg n olarak kullan lmakla birlikte hormon, enzim, metabolitler gibi biyokimyasal parametrelerin de beraber çal fl ld araflt rmalar daha verimli olmaktad r. Bu nedenle hayvanc l kta özellikle hormon tayinleri üretimin (süt, et, yapa ) ve üremenin gelifltirilmesi amac yla yayg n olarak kullan lmaktad r (8). Hayvanc l k konusunda hormon düzeylerini içeren araflt rma yapmak hormon kitlerinin ithal edilmesi nedeniyle pahal ya mal olmakta bu da geliflmifl ülkelerde çal flan araflt r c lar araflt rma yapma konusunda k s tlamakta ayr ca gen kayna olarak kullan lacak ülkeye özgü rklar n temel fizyolojik verileri bile elde edilememektedir. Bu sebepler nedeniyle araflt rma kurumlar n n daha fazla araflt rma yapabilmesi ve rutin analizlerde kullanmak üzere kendi test sistemlerini gelifltirmesi büyük önem kazanmaktad r. Hormon düzeylerini ölçmek için kullan lan yöntemler immun testlerin temel prensibine dayan r (9). Bu testlerde de iflik maddeler izleyici olarak kullan lm flt r. Radyoaktif izotoplar en yayg n olarak kullan lan madde olmakla birlikte enzimler izotoplara alternatif olarak immun testlerde kullan lmaktad r (1,2,8). zotoplar n ve kullan lan organik solvanlar n insan sa l ve çevreye olan zararl etkileri yan nda pahal say m cihazlar na olan gereksinim nedeniyle radioimmunassay (RIA) yöntemi ekonomik olmamaktad r. zleyici olarak enzimlerin kullan ld enzimimmunassay (EIA) yöntemleri ucuz ve kolay uygulanabilirli i nedeniyle RIA'ya alternatif olmufltur (10,11). Testosteronun, plazma, tükrük, k l ve idrarda analizi için çeflitli immunolojik ve kromatografik yöntemler (12-17) gelifltirilmifltir. EIA yönteminin testosteron için gelifltirildi i çeflitli araflt rmalarda (18-22) ekstraksiyon veya direkt analizler tercih edilmifl ve bu sistemlerde tek veya çift antikor kullan lm flt r. Fakat çift antikorlu EIA yönteminin daha güvenilir oldu u ve befl kat daha az oranda hormona özgül antikor kullan ld ndan ekonomik oldu u bildirilmifltir (10,23). Bu çal flmada; a) Testosterona karfl antikor üretimi ve karakterizasyonu, b) Testosteronun enzimle iflaretlenmesi ve saflaflt r lmas c) Testosteron EIA metodunun kalite kontrolu çal flmalar n n gerçeklefltirilmesi amaçlanm flt r. Materyal ve Metot Testosteron'a Karfl Antikor Üretilmesi Çal flmada 6 ayl k, difli, Yeni Zelanda rk 10 adet tavflan kullan ld. Tavflanlar n 5'i Testosterone 17β- Hemisuccinate: Bovine Serum Albumin, 5'i de Testosterone 3-(O-Carboxymethyl) Oxime: Bovine Serum Albumin (Testosterone 3-O-CMO-BSA) antijenine karfl immunize edildi. Antijen fosfat tampon içinde çözüldü ve eflit miktardaki Freund's Adjuvant ile emülsifiye edildikten sonra tavflanlara subkutan yolla yaklafl k 20 de iflik yerden enjekte edildi. lk enjeksiyonda Complete Freund's Adjuvant ve 300 µg antijen kullan l rken sonraki enjeksiyonlarda Incomplete Freund's Adjuvant ve 250 µg antijen kullan ld. Booster enjeksiyonlar 3 er hafta ara ile 12 kez yap ld ve 3. enjeksiyonu takipeden her enjeksiyondan sonraki 10. günde tavflanlar n kulak venas ndan kan al narak antikor titresi enzimimmunassay (EIA) yöntemi ile tespit edildi. Testosteron Antiserumunun Özgüllü ünün Tayini Antiserumun özgüllü ü çeflitli steroid hormonlarla verdi i çapraz reaksiyon oran ile tespit edildi. Bunun için estrone, estradiol ve progesteron hormonlar n n 1 ng - 16 µg aras nda standartlar haz rland ve bu standartlar, enzim iflaretli testosteron ve testosteron antiserumu ile reaksiyona sokularak her hormonun testosteron antiserumuna ba lanma oran enzimimmunassay metodu ile tayin edildi (13). Testosteronun Horseradish Perosidaz (HRP) ile flaretlenmesi flaretlemede "mixed anhydride" yöntemi (24) kullan lm fl olup afla daki flekilde yap lm flt r. A Solusyonu: 0,5 mg Testosterone 3-(O-Carboxymethyl) Oxime, 0,5 ml N,N dimethylformamide içinde çözüldü ve buna 6,25 µl methylmorpholine ilave edilerek çözelti önce 0 ºC'ye daha sonra -15 ºC'ye kadar so utuldu. B Solusyonu: 5 mg HRP enzimi 500 µl distile suda çözüldü ve 375 µl N,N-dimethylformamide ilave edilerek çözelti 0 ºC'ye so utuldu. 46

3 B. GÜVEN, S. ÖZSAR, N. MARAfiLI, fi. MARAfiLI, A. ÖZCAN Reaksiyon: A solusyonuna 6,25 ml iso-butylchloroformate ilave edilerek kar fl m 3 dakika -15 ºC'de inkübe edildi. Daha sonra B solusyonu A solusyonuna ilave edildi ve ph 8,0'e 1 N NaOH ile ayarland. Kar fl m 1 saat -15 ºC'de ve 2 saat 0 ºC'de kar flt r ld ve daha sonra reaksiyon 10 mg NaHCO 3 ile durduruldu. Testosteron-HRP Konjugat' n n Saflaflt r lmas flaretleme sonucu elde edilen kar fl m önce dialize edildi daha sonra kolon kromatografisinden geçirilerek saflaflt r ld. Dializ ifllemi için porlar, moleküler a rl 'den küçük olan maddelerin geçebildi i, selüloz dializ tüpü kullan ld. Dializ 24 saat süre ile PBS (40mM Na 2 HPO 4, 0,14 M NaCl, 0,2g, ph 7,2) tampona karfl yap ld ve her 6 saatte bir PBS tamponu de ifltirilerek dializ banyosu tazelendi. Dialize edilen kojugat daha sonra kolon kromatografisinde (kolon ebad : 1,5 x 85 cm, kolon dolgu maddesi: sephadex G-25, ak fl h z : 0,5 ml / dk) saflaflt r ld. Toplanan her bir fraksiyonun 0,5 µl si 100 µl substrat (%0,01 tetrametilbenzidin, %0,004 hidrojen peroksit, 100 mm sodyum asetat, ph5,5) ile 1 dk inkübe edildi ve reaksiyon 50 µl 4N H 2 SO 4 ile durduruldu ve renk yo unlu u fotometrede (450 nm) okundu. Saf konjugat n bulundu u fraksiyonlar biraraya getirildi ve 50 µl'lik porsiyonlara ayr larak -20 ºC de sakland. Mikrotitrasyon Plaklar n n IgG ile Kaplanmas Önceki çal flmam zda (25) üretti imiz ve affinite kolonundan geçirilerek saflaflt r lan anti-tavflan IgG-keçi IgG plaklar kaplamada kullan ld. 100 µg anti-tavflan IgG-keçi IgG 10 ml karbonat tamponu (50 mm NaHCO 3, ph 9,6) ile suland r ld ve mikrotitrasyon pla n n her deli ine 100 µl pipetlendi (1 µg/delik), daha sonra plak +4 ºC'de 18 saat inkübe edildi. nkübasyon sonucu plak içeri i boflalt ld ve özgül olmayan ba lanmay azaltmak için pla a 300 µl/delik, deney tamponu (40 mm Na 2 HPO 4, 0,14 M NaCl 0,2g, %0,1 BSA, ph 7,2) konuldu ve plak 60 dakika oda s s nda inkübe edildi. kinci inkübasyondan sonra plak 4 kere y kama solusyonu ile y kand, kurutuldu ve test yap lana kadar -20 ºC'de sakland. Testosteron-HRP Konjugat ve Antikorun Uygun Titresinin Tespiti Anti-tavflan IgG-keçi IgG ile kapl plaklara yukardan afla ya bir s ra 10 µl PBS tampon, bir s ra testosteron standart ndan (1 ng/1 ml PBS) 10 µl pipetlendi. Konjugat n, 1:1000 ile 1:32000 aras ndaki dilusyonlar ndan yukardan afla ya, testosteron antiserumunun ise 1:1000 ile 1: aras ndaki dilusyonlar ndan soldan sa a olmak üzere pla a 100'er µl pipetlendi. Plak 37 ºC'de 2 saat ve +4 ºC'de 18 saat inkube edildi, inkübasyon sonras plak 4 kez y kama solusyonu (%0,05 Tween 80) ile y kand ve her deli e 150 µl substrat ilave edildi, plak 40 dakika oda s s nda inkübe edildikten sonra substrat reaksiyonu 50 µl 4N H 2 SO 4 ile durduruldu. Plakta oluflan renk yo unlu u fotometrede (450 nm) okundu. Testosteron Standartlar n n Haz rlanmas Testosteron standart n n haz rlanaca steroid ihtiva etmeyen plazmay elde etmek için, 10 ml plazma 0,5 mg aktif kömür ile oda s s nda 30 dk kar flt r ld ve kar fl m g de 60 dk santrifüje edildi. Santrifüj sonunda steroid ihtiva etmeyen plazma k sm ayr larak standart haz rlanmas nda kullan ld. Standartlar 10 mg/10 ml ethanol içindeki stok testosteron solusyonundan, 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, ng/ml olacak flekilde al narak haz rland. Stok solusyondan uygun miktarlar al narak tüpe kondu, ethanol vakumlu f r nda 55 ºC de evapore edildi ve her bir standarta steroid ihtiva etmeyen plazma konarak standartlar haz rland ve standartlar test yap lana kadar -20 ºC'de sakland. Testin Yap l fl Anti-tavflan IgG-keçi IgG kapl plak, testosteron standartlar, testosteron-hrp konjugat, testosteron antiserumu oda s s na gelinceye kadar beklendi. Standartlar 10 µl/delik, konjugat 100 µl/delik, antikor 100 µl/delik olarak pla a pipetlendi. Plak 37 ºC'de 2 saat ve +4 ºC'de 18 saat inkube edildi, inkübasyon sonras plak 4 kez y kama solusyonu ile y kand ve her deli e 150 µl substrat ilave edildi, plak 40 dakika oda s s nda inkübe edildikten sonra substrat reaksiyonu 50 µl 4N H 2 SO 4 ile durduruldu. Renk yo unlu u fotometrede (450 nm) (Tecan, Spectra III) okundu. Kantitatif Verim Testin do rulu u kantitatif verim (recovery) deneyi ve bir plazma numunesinin çeflitli deney serilerinde analizi yap larak araflt r ld. Kantitatif verim için herhangi bir plazma numunesine 0,5-15,0 ng/ml aras ndaki testosteron standartlar ilave edildi. Plazmalar 30 dakika 37 ºC'de inkübe edildikten sonra enzimimmunassay 47

4 Testosteron çin Enzimimmunassay Tekni inin Gelifltirilmesi metodu ile analiz edildi. Numunelere eklenen testosteron miktar ile test sonunda ölçülen miktar karfl laflt r larak kantitatif verim yüzdesi hesapland ve regresyon analizi yap ld. Testin do rulu unu ölçmek için bir plazma numunesi farkl günlerde yap lan EIA testlerinde analiz edildi ve deneyler aras varyasyon katsay s yüzde olarak hesapland. Bulgular Testosteron HRP ile iflaretlendikten sonra konjugat sephadex G-25 kolon kromatografisinden geçirildi ve toplanan fraksiyonlarda saf HRP-Testosteron konjugat n n bulundu u 79 ve 80. fraksiyonlar toplanarak testte kullan ld (fiekil.1). Antiserumun özgüllü ü, titre tespiti ve çapraz reaksiyon testiyle saptand. Antiserumun ve konjugat n test için uygun titresi, optik dansitenin 'e en yak n oldu u ve '0' ile '10' pg standart aras nda en yüksek fark n bulundu u titreler tespit edilerek bulundu. HRPtestosteron konjugat n n 1: 4000, antiserumun 1:16000 dilusyonunun EIA için uygun oldu u bulundu ve testte kullan ld. Testosteron antiserumu'nun çapraz reaksiyon oran östradiol ile %0,016, progesteron ile %0,012, östron ile %0,001 olarak bulunmufl olup çapraz reaksiyonlar fiekil 2'de gösterilmifltir. Testosteron standartlar n n (0,5-15,0 ng/ml aras ndaki) plazmaya eklenmesi sonucu elde edilen testosteron düzeyleri dikey eksene iflaretlendi ve elde edilen e rinin regresyon fonksiyonu y = - 0,32 e ( ,162x), regresyon katsay s r 2 = 98,8 olarak bulundu (fiekil 3). Steroid ihtiva etmeyen plazmada haz rlanan testosteron standartlar, bu çal flmada üretilen antiserum ve HRP-Testosteron konjugat kullan larak EIA ile analiz edildi, test sonucu bulunan standart e ri fiekil 4'de gösterilmifltir. EIA metodunun hassasiyeti, standart O.D.450 nm fiekil Fraksiyonlar Testosteron HRP konjugat n n kolon kromatografisinden saflaflt r lmas. (kolon ebad : 1,5 x 85 cm, kolon dolgu maddesi: sephadex G-25, ak fl h z : 0,5 ml/dk) Bulunan Testosteron ng/ml fiekil Eklenen Testosteron mg/ml Kantitatif verim testinin regresyonu. y = e ( x), r2= Progesteron Östron % Ba lanma Ostradiol O.D. 450 nm Testosteron ng / ml fiekil 2. Testosteron antiserumunun çapraz reaksiyonlar ng/ml fiekil 4. Testosteron standart e risi. 48

5 B. GÜVEN, S. ÖZSAR, N. MARAfiLI, fi. MARAfiLI, A. ÖZCAN e ride '0' dan sonra tayin edilebilen en düflük miktar olan 0,25 ng/ml (25 pg/delik) olarak bulundu. Herhangi bir plazma numunesi 8 ayr günde yap lan EIA testi ile analiz edildi (6,24±0,7 ng/ml, n= 8 ) ve deneyler aras varyasyon katsay s % 12,6 olarak bulundu. Tart flma Çal flmada antikor üretmek için Testosterone 17β- Hemisuccinate: Bovine Serum Albumin, ve Testosterone 3-(O-Carboxymethyl) Oxime: Bovine Serum Albumin olmak üzere iki farkl antijen kullan lm fl olup sadece bir tavflanda Testosterone 3-(O-Carboxymethyl) Oxime: Bovine Serum Albumin antijenine karfl EIA testinde kullan labilecek kalitede antikor üremifltir. Di er tavflanlar n baz lar bu antijenlere cevap vermesine ra men elde edilen antiserumlar immun testlerde kullan lacak özelli e sahip de illerdi. Hormonlar için immun testlerde düzeyinde analiz yap ld ndan kullan lacak antiserumun yüksek affiniteye ve özgüllü e sahip olmas gerekmektedir (13). Düflük affiniteli antiserumlar immun testlerde hormon düzeylerinin tespitinde yetersiz kalmaktad r. Bu çal flmadaki EIA testinde kullan lan antiserum 2,5 pg/delik (0,25 ng/ml) gibi düflük testosteron düzeyini 0 de erinden ay r rken, çal flmada üretilen di er antiserumda bu miktar 200 pg/delik (20 ng/ml) gibi yüksek bir düzeydeydi. Testosteron için EIA tekniklerinin gelifltirildi i çeflitli araflt rmalarda testin hassasiyeti 0,5 pg/delik (18), 5 pg/delik (19), 1 pg/delik (20,21), olarak tespit edilmifl olup çal flmam zda bu de er 2,5 pg/ml olarak bulunmufltur. Bu da testin, fizyolojik de erleri ay rt edebilecek bir hassasiyete sahip oldu unu göstermektedir. Kantitatif verim testinde regresyonun % 98,8 deneyler aras varyasyonun % 12,6 oran nda olmas ve kullan lan antiserumun baz steroidlerle düflük oranda çapraz reaksiyon vermesi testin testosteron analizinde güvenle kullan labilece ini göstermektedir. Hormon testlerinin kullan labilirli i, kolay ve ucuz olmas na görede de erlendirilir (2,8). Radioimmunassay (RIA) güvenilir bir test olmakla birlikte radyasyon tehlikesi ve kullan lan aletlerin çok pahal olmas nedeniyle RIA ile çal flmak s n rl say daki araflt rma merkezlerinde mümkün olmaktad r. Bu çal flmada sunulan testosteron için EIA metodu RIA n n problemlerini gidermekle birlikte pratiklik, güvenirlik gibi kriterlere de sahiptir. Hayvanc l k alan nda yap lacak araflt rmalar, analiz edilecek numune say s n n fazla olmas ve kitlerin ithal edilmesi nedeniyle pahal ya mal olmakta veya yap lamamaktad r. Bunun yan nda ülkemizde hayvanc l k alan ndaki baz çal flmalarda befleri kitler kullan ld ndan sonuçlar n güvenirli i tart flmal durumdad r. thal edilen 96 örneklik bir EIA kitinin maliyeti yaklafl k 500 USA dolar iken bu çal flmada gelifltirilen 96 örneklik EIA testinin maliyeti yaklafl k 4 USA dolar d r. Aradaki fark karfl laflt r ld nda bu testlerin ülkemizde üretilmesinin önemi daha belirgin olmaktad r. Bu çal flmada kullan lan antikor üretimi, hormonlar n enzimle iflaretlenmesi ve saflaflt r lmas, üretilen antikor ve konjugat n karakterizasyonu gibi yöntemlerin tüm steroid hormonlar için ayn oldu u göz önüne al nd nda özellikle hayvanc l k alan nda çal flan araflt r c lar n kendi test sistemlerini kurmas hem ekonomik hem de daha çok say da kaliteli araflt rma yapmas bak m ndan büyük önem göstermektedir. Kaynaklar 1. Edqvist, L.E., Haggström, A., Kindhal, H., Stabenfeldt, G.H.: Radioisotopic Techniques for the Study of Reproductive Physiology in Domestic Animals. 1976; IAEA-SM-205/3: Karg, H., Claus, R., Hoffmann, B., Schallenberger, E., Schams, D.: Present Status and Future Possibilities of Radioimmunoassay in Animal Production. 1976; IAEA-SM-205/3: Edqvist, L.E., Stabenfeldt, G.H.: Clinical Reproductive Endocrinology. In Clinical Biochemistry of Domestic Animals, Fourth Edition. Academic Press, Inc. 1989; Sutama, I.K., Edey, T.N.: Postpubertal Sexual Development in Merino Rams after Differential Feeding through Puberty. Theriogenology. 1986; 25 (4): Dufour, J.J., Fahmy, M.H., Minvielle, F.: Seasonal Changes in Breeding Activity, Testicular Size, Testosterone Concentration and Seminal Characteristics in Rams with Long or Short Breeding Season. J. Anim. Sci. 1984; 58 (2): Özsar, S., Güven, B., Çelebi, M., Kalkandelen, G., Van de Wiel D.F.M.: Testosterone and LH Concentrations in the Male Angora Goat during Puberty. Anim. Reprod. Sci. 1990; 23: Muduuli, D.S., Sanford, L.M., Palmer, W.M., Howland, B.E.: Secretory Patterns and Circadian and Seasonal Changes in Luteinizing Hormone, Follicle Stimulating Hormone Prolactin and Testosterone in the Male Pygmy Goat. J. Anim. Sci. 1979; 49 (2):

6 Testosteron çin Enzimimmunassay Tekni inin Gelifltirilmesi 8. Van de Wiel, D.F.M., Koops, W., Vos, E.: Enzyme and Radioimmunoassay Techniques for Hormone Determination in Livestock. Proceedings of a Symp. Nuclear and Related Techniques in Animal Production and Health, Vienna IAEA.1986; March, Pratt, J.J.: Steroid Immunoassay in Clinical Chemistry. Clin. Chem.1978; 24 (11): Meyer, H.H.D.: Possible Ways of Techniques and their Application in Animal Production. Procedings of a symp., Nuclear and Related Techniques in Animal Production and Health, IAEA, Vienna. 1986; March, Tijssen, P.: Practice and Theory of Enzymeimmunoassay. Elsevier, Amsterdam. 1985; Pratt, J.J., Wiegman, T., Lappöhn, R.E., Woldring, M.G.: Estimation of Plasma Testosterone without Extraction and Chromatography. Clinica Chimica Acta. 1975; 59: Laboratory Training Manual on Radioimmunoassay in Animal Reproduction. International Atomic Energy Agency., Vienna., Venturelli, E., Cavalleri, A., Secreto, G.: Methods for Urinary Testosterone Analysis. J. Chromatogr. B. Biomed Appl. 1995; 15: Legrand, C., Dousset, B., Tronel, H., Belleville, F., Nabet, P.: Measurement of Plasma Testosterone by Gas Chromatographynegative-ion Mass Spectrometry Using Pentafluoropropionic Derivatives. J. Chromatogr. B Biomed. Appl. 1995; 663/2: Tschop, M., Behre, HM., Nieschlag, E., Dressendorfer, R.A., Strasburger, CJ.: A Time-Resolved Fluorescence Immunoassay for the Measurement of Testosterone in Saliva: Monitoring of Testosterone Replacement Therapy with Testosterone Buciclate. Clin. Chem. Lab. Med. 1998; 36 (4): Erkoç, F.Ü., Özsar, S., Güven, B., Kalkandelen, G., U rar, E.: High-Performance Liquid Chromatographic Analysis of Steroid Hormones. J. Chromatogr. Sci. 1989; 27: Sengupta, J., Dhar, T.K., Ali, E.: Sandwich Immunoassay of Small Molecules, Effects of Heterology and Development of a Highly Sensitive and Specific Enzyme Immunoassay for Testosterone, J. Immunol. Meth. 1992; 147: Elder, P.A., Lewis, J.G.: An Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for Plasma Testosterone. J. Steroid Biochem. 1985; 22: Marcus, G.J., Durnford, R.: A Simple Enzyme Linked Immunosorbent Assay for Testosterone. Steroid. 1985; 46: Tarun, K.D., Esahak, A.: Direct Microtitre Plate Enzyme Imunnoassay of Testosterone in Unextracted Serum. J. Immunol.l Meth. 1992; 147: Esahak, A., Judhajit, S., Tarun, K.D.: Sandwich Immunoassay of Small Molecules. I. Investigation with Testosterone as Model Hapten. J. Immunol. Meth. 1992; 147: Meyer, H.H.D., Güven, B.: Improvement of Microtitration Plate Enzymeimmunoassay for Steroid Determination by a Second Antibody Technique. J. Steroid Biochem. 1986; 25: Suppl Meyer, H.H.D., Güven B., Karg, H.: Enzymimmuntests (EIA) auf Mikrotitrationsplatten zur progesteronbestimmung in Magermilchproben. Wien. Tierarztl. Monatsschr. 1986; 73: Güven, B., Özsar, S., fiaban, E., Çelebi, M., Meyer, H.H.D.: Plasma FSH and LH concentrations during the estrus cycle of prolific Sak z sheep. Kafkas Univ. Vet. Fak. Derg. 1996; 2 (2):