Dr. Sevim GÖNEN Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Doku Tipleme Laboratuvarı

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "Dr. Sevim GÖNEN Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Doku Tipleme Laboratuvarı"

Asli Kavak
7 yıl önce
İzleme sayısı:

1 Dr. Sevim GÖNEN Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Doku Tipleme Laboratuvarı

2 Panel Reaktif Antikor Düzeyleri?? Reddedilmiş böbrek nakli ve kan transfüzyonları sonrasında veya kadınlarda gebelik döneminde gelişebilen Panel reaktif antikor düzeyleri çeşitli yöntemlerle belirlenebilmektedir.

3 DOKU ANTİJENLERİNE KARŞI ANTİKORLAR NASIL SAPTANIYOR? 40 Yıllık Gelişim Hücresel antikor saptama testleri: CDC (Kompleman Bağımlı Sitotoksisite) Akım sitometrisi (1983) Solid faz antikor saptama testleri (SPADS): Rekombinant HLA Sınıf I ve II molekülleriyle kaplanmış solid bir matriks/mikropartiküller ve optik okuma yöntemi kullanılmaktadır. ELISA Luminex Transplantation 2008;86: , Human Immunology 2009; 70: ,Curr Opin Organ Transplant 2009;14:

Solid faz antikor saptama testleri (SPADS): Rekombinant HLA Sınıf I ve II molekülleriyle kaplanmış solid bir

4 Teknolojinin İlerleyişi Böbrek bekleme listelerinde bekleyen hastaların serumlarındaki antikorları tespit etmede kullanılan en eski ve en klasik yöntem CDC Fakat antikor özgüllüklerini tayin etmede düşük duyarlılık ve düşük çözünürlüğe sahip olmasından dolayı yeni arayışlar

eski ve en klasik yöntem CDC Fakat antikor özgüllüklerini tayin

5 Teknolojinin İlerleyişi 1990 lı yıllarda ELISA teknolojisinin gelişmesiyle lenfositlerin yerine HLA molekülleri kullanılmaya başlanıyor CDC ve ELISA dan daha fazla hassasiyete sahip olduğu için Luminex teknolojisi son 10 yıldır yaygın şekilde doku tipleme laboratuvarlarında yerini alıyor.

başlanıyor CDC ve ELISA dan daha fazla hassasiyete sahip olduğu için

6 PRA tespitinin duyarlılığının ve özgüllüğünün arttırılması için kullanılan hücresel ve solid faz temeline dayalı testler: Hedef lenfositler Kompleman bağımlı sitotoksisite Akım sitometrisi HLA-A1 HLA-A2 HLA-A3 HLA-B7 HLA molekülleri ELISA Luminex 6

testler: Hedef lenfositler Kompleman bağımlı sitotoksisite

7 Kompleman Bağımlı Sitotoksisite (CDC) Tamamen canlı hücreye dayanır.

8 Lenfosit izolasyonu Kompleman ilavesi Boya Mikroskobik değerlendirme

9 Dezavantajları Düşük düzeydeki Sınıf I ve Sınıf II antijenlerine özgül antikorlar belirlenememektedir. Sadece aktivasyonu komplemana bağlı olan antikorlar (IgG1,IgG3) saptanabilmektedir.

10 Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay(ELISA) Antijen- antikor ilişkisini, antikora bağlanmış bir enzimin aktivitesini araştırmak temeline dayanan kantitatif ölçüm yöntemidir.

11 Kuyular yıkama solüsyonu ile rehidrate edilir. Dilüe edilmiş hasta serumu, kontroller ve enzim işaretli anti-igg antikoru eklenir. Enzime uygun bir kromojen substrat ortama konulur.

12 Sisteme bağlanmış enzim bu substratı parçaladığında ortaya çıkan renk, yapılacak kolorimetrik yöntemlerle ölçülerek bağlanmış olan enzim dolayısıyla bağlanmış olan antikor hakkında fikir verecektir.

13 Flow PRA Tarama Testi İnsan serumundaki PRA nın akış sitometrisi ile hızlı bir şekilde saptanması için önceden kalibre edilmiş reaktifler bulunmaktadır. FlowPRA boncuklarının her birinin reaktivitesi, insan alloserumları ve spesifik HLA monoklonal antikorlar kullanılarak akış sitometrisi ile teyit edilmiştir.

FlowPRA boncuklarının her birinin reaktivitesi, insan alloserumları ve

14 Serumda anti-hla antikoru varsa Flow-PRA boncuklarına bağlanır. Floresan işaretli anti-human IgG antikoru ile boyanmadan sonra, anti-hla IgG pozitif serumu, negatif seruma kıyasla bir floresan kanal geçişi gösterir.

15 Flow PRA Tarama: Test serumunda bulunan HLA antikorlarının yüzde miktarını verir.

16 FlowPRA I boncuklarının FSC-SSC nokta alanı

17 FlowPRA II boncuklarının FSC-SSC nokta alanı

18 Flow PRA Spesifik Testleri:Antikorların hangi HLA antijenine spesifik olduğunu belirler.

20 Luminex : Cihaz, iki lazer içeren mini dijital akım analiz sisteminden oluşmaktadır.

21 Sıvı lazerden geçtiğinde ilk geçişte boncuklar HLA tipine göre sınıflandırılır. İkinci geçişte PE işaretli anti human IgG bağlı HLA moleküllerine göre boncuklar taranır.

22 MFI NEDİR? PRA pozitifliğini saptamak için boncuğun median fluorescent intensity (MFI) değeri: Üç negatif kontrol boncuğunun MFI değerine bölünür ve elde edilen değerden arka plandaki ayarlama etkeni çıkarılarak üç farklı ayarlanmış oran elde edilir.

23 Pozitif nedir? Negatif nedir? MFI 2000 MFI değerleri icin konsensus yok!!!: DSA için değişik yorumlamalar : evet/hayır

24 Luminex PRA Tarama

25 LuminexPRA Tanım II

26 Tek Antijen (Single Antigen) Boncuk Çalışması ile Donöre Özgü Antikorların Saptanması Tek HLA molekülleri ile kaplanmış [single antigen bead (SAB)] solid faz çalışmaları, hastanın HLA antikor spesifisitelerini, donörün HLA tiplemesi ile sanal olarak karşılaştırarak donöre özgü HLA antikorlarının saptanmasına imkan sağlar. Özel bir test olan SAB ile saptanan donöre özgü antikor (DSA)'ların klinik ile ilişkisinin belirlenmesi son derece önemlidir.

27 HLA Antikor özgüllüğünü tanımlamak için Luminex tek antijen boncuk çalışması mükemmel bir araçtır MFI ( mean fluorescence intensity) Boncuklar bireysel HLA antijenleriyle kaplıdır 27

28 Önceden başarısız bir böbrek transplantasyonu geçiren hastanın serumundan 3 farklı teknik kullanılarak (CDC-PRA,ELISA-PRA ve L-SAB) donör HLA sına karşı uyumsuzluk gösteren HLA B27 antijenine karşı DSA tespit edilmiştir.

29 CDC-PRA: B27+Extras

30 ELISA-PRA: A23,A24,B7,B27,B60,B61+Extras

31 L-SAB: A23,A24,A25,A29,A32,A33,A66,A74,B7,B13,B18,B27,B35,B37,B38,B39,B42,B44,B47,B48, B53,B54,B56,B57,B58,B59,B60,B61,B63,B67,B73,B76,B81

32 Sensitize Hastada Transplantasyon Öncesi İmmunolojik Risk Değerlendirilmesi Human Immunology 70 (2009)

33 PRA TAYININDE KULLANILAN YÖNTEMLER /DUYARLILIK Method Pozitif (n)/toplam(n) % CDC 12 / ELISA 32 / FLOW 48 / Analysis of HLA Presensitization (PRA) W.E. Herczyk 2003

35 3 Farklı test tekniği karşılaştırılmıştır: CDC,ELISA ve Akım Sitometrisi: Solid faz testlerinin duyarlılığı, hücre temelli testlere göre daha yüksektir. Ancak serumdaki birçok bileşen etkileyebilir. Bu nedenle standartizasyon dikkatli bir şekilde yapılmalı ve tayinlerin klinik olarak eşik değerleri önemlidir.

36 2009 dan itibaren ABD de kullanılmaktadır yılları arasında kadavra donörün HLA ları kullanılmış. Merkezler her hastası için kabul edilemez MM leri sisteme girdiğinde sistem bir PRA tahmini yapmaktadır. Gerçek PRA ölçümleriyle korelasyonu oldukça iyi bulunmuştur.

37 PRA HESAPLANMASI Eurotransplantta, benzer bir uygulama olan Virtual PRA uygulamasını başlatmıştır. Human Immunology 70 (2009)

38 Received date: 16-Mar-2015 Accepted date: 20-Mar-2015 Virtual PRA replaces traditional PRA: small change but significantly more justice for sensitized patients Caner Süsal and Christian Morath Departments of Transplantation Immunology and Nephrology, University of Heidelberg,Germany

39 SONUÇ 1 CDC Avantaj: Ucuza mal edilir. Dezavantaj: Canlı hücre gerektirir. Duyarlılığı düşüktür. HLA için spesifik değildir.

40 SONUÇ 2 AKIM SİTOMETRİSİ Avantaj: Duyarlılığı CDC den fazladır. Farklı hücre tiplerini ve Ig G sınıfı/alt tiplerini ayırabilir. Dezavantaj: Reaktif ve donanımları pahalıdır. HLA için spesifik değildir.

41 SONUÇ 3 SOLİD FAZ TEKNİKLER Avantaj:Yüksek duyarlılık ve özgüllük sağlar. Canlı hücreye gerek duyulmaz. Az serum ile çalışılabilir. Dezavantaj: Birçok serum faktöründen etkilenebilir.

42 SONUÇ 4 Tek Antijen Boncuk (SİNGLE ANTİGEN) Avantaj: Mevcut bütün antikorları saptar. Epitop veya allel spesifik antikorları tanımlayabilir. Cw,DP ve DQ ya karşı antikorları tayin edebilir. Dezavantaj:Tek boncukla temsil edilen antijen, degişik miktardaki antijen ve bozulmuş molekülleri kaçırılabilir. Multipl antikorların toplam düzeyini vermeyebilir.

44 ELISA, Flow-PRA veya Luminex gibi yöntemlerle saptanmış sitotoksik olmayan antikorlar transplantasyonda risk faktörü, CDC ile saptanmış antikorlar kontrendikasyon olarak görülmelidir. Am J Transplant 2003;3:

45 Teşekkürler

Benzer belgeler

CROSSMATCH ELISA YÖNTEMİ

CROSSMATCH ELISA YÖNTEMİ Uzm.Dr.Mustafa BALCI Transplantasyon İmmünolojisi ve Doku Tiplendirme Laboratuvarı Sorumlu Hekimi TRANSMED ÖZEL TIP LABORATUVARI ANKARA Humoral Alloreactivity Pre Tx Preformed