Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi ECZ 344/8. Ders Prof.Dr. Dilek AK YÖNTEM SEÇİMİ VE DEĞERLENDİRME

Transkript

1 1 Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi ECZ 344/8. Ders Prof.Dr. Dilek AK YÖNTEM SEÇİMİ VE DEĞERLENDİRME

2 Yöntem Seçimi 2 Biyolojik sıvılarda ilaç analizi için yöntem seçiminde validasyon parametreleri, hız ve kolaylık için farklı gereksinimler söz konusudur. Örneğin, aşırı doz için yapılan işlemlerde bol miktarda plazma numunesi ile ekstraksiyon, kromatografik saflaştırma ve analiz basamakları izlenir. Yüksek düzeyde kesinlik ve duyarlılık gerektiğinde ucuz olmayan ve uzmanlık gerektiren yöntemlere ihtiyaç duyulur. Analitik verilerin çok önemli olmadığı durumlarda ucuz bir yöntem veya rutin bir deney protokolü kullanılır.

3 Yöntem Seçimi 3 İlacı sentezleyen kimyacı NMR ve kütle spektrumu yardımı ile gerekli yapısal bilgileri sağlar. UV spektrumu bilindiğinde sonraki kromatografik çalışmanın saptama basamağı için önemli bir veri elde edilir. ITK ile ön ilaç formu, yan ürünler ve parçalanma ürünleri veya metabolitler ilgili bileşikten ayrılabilir. Stabilite hakkında bilgi sahibi olmak çok önemlidir.

4 Analitik Profil Bileşiğin Karakterizasyonu 4 Fizikokimyasal karakteristikleri UV-görünür bölge spektrumu Floresans spektrumu ITK HPLC GC Kütle Spektrometri NMR Çözünürlük

5 Fizikokimyasal Karakteristikler 5 Çalışılan bileşik için, Çeşitli çözücülerde çözünürlük İyonize olabiliyorsa bileşiğe ait pka değeri Molekül ağırlığı Optikçe aktif formun varlığı analizi yürüten tarafından bilinmelidir.

6 Ultraviyole-Görünür Bölge Spektrometri 6 Absorpsiyon düzeyi incelenir, yüksek mi? HPLC de UV detektör dalga boyuna buradan karar verilir. Spektrum ph değişikliklerinden etkilenir mi? Absorpsiyonu ve duyarlılığı artırmak için yararlıdır. Absorpsiyon spektrumu spesifik değildir, ancak spesifik bir ekstraksiyon işleminden sonra veya ilaç metabolizmaya uğramadığında uygulanabilir. Absorpsiyon spektrumu metabolizmadan az etkilenir.

7 Floresans Spektrum 7 Floresans ışın yayma özelliği olan maddeler, kendilerine özgü dalga boyundaki ışınlarla uyarılabilir ve tayin edilebilirler. Floresans özelliği olmayan maddeler, üzerinde taşıdığı çeşitli fonksiyonel gruplar kullanılarak türev oluşturabilen ajanlar ile türevi oluşturulduktan sonra tayin edilebilir. Örn primer amin grubu taşıyan maddeler, floreskamin ve dansil klorür ile türev yapılabilir. Ancak türevin kolayca oluşması ve stabilitesi değerlendirilmelidir. Metabolizma floresans karakteristiklerini değiştirebilir.

8 ITK 8 Analog ve potansiyel metabolitlerin yanı sıra parçalanma ürünleri ile ilgili veri sağlar. Lekelerin görünürleştirilmesinde kullanılan sprey reaktifler olası kolorimetrik tayin için fikir verebilir. Kantitatif sonuçlar için uygun değil (!) Plazma analizi için nadiren densitometre ile kullanılır. Densitometre, özellikle idrar numunelerinde ilaç suistimalinin araştırılmasında, kolay, ucuz ve kullanışlı bir yol ile incelemeye imkan sağlar.

9 HPLC 9 Biyolojik sıvılarda ilaç analizi için en uygun yöntemdir. Özellikle ters-faz sistemler (C8 ve C18 kolon ile) ayırma ve tayin başarıyla gerçekleştirilir. Metabolitler polardır ve ana bileşikten önce elüe olur. Kısa analiz süresi için yöntem optimize edilebilir. ph etkisi dikkate alınmalı, iyon çifti kromatografi uygulanabilir. Türevlendirme nadiren kullanılır

10 GC 10 Uçucu olmayan veya labil bileşiklerin türevleri için uygulanır. Nonpolar sabit fazlar ( örn. OV-1) Seçici sabit fazlar (örn. OV-101) Türevlerin alıkonma karakteristikleri kullanılır. Cihaz karakteristikleri biyolojik analizler için uygundur. GC için bir yöntem geliştirilemiyorsa HPLC nin uygulanması da zordur.

11 Kütle Spektrometri 11 Bileşiklerin kütle spektrumları standart koşullarda belirlenmelidir. KS nin bir cihaz olarak ilk uygulamaları biyolojik sıvılarda ilaç analizinde saflaştırılmış metabolitlerin karakterizasyonu ile ilgilidir. Daha sonra daha basit rutin işlemlerin spesifikliğini değerlendirmek için spesifik bir detektör olarak kullanılmıştır. Selective ion monitoring ve Tandem mass spectrometry nin kullanılması, KS nin spesifikliğinin analiz yöntemlerinde hayati olduğunu göstermiştir. Farklı tipteki iyonlaştırma işlemleri ve farklı türevler spesifik iyon verimini artırmak için kullanılır ve eğer spektrum elde edilebiliyorsa analitik profil derlemesinde yerini alabilir.

12 NMR 12 Biyolojik örneklerde ilaç analizi için fazla değerli bir yöntem değildi. Kütle Spektrometri gibi, metabolitlerin karakterizasyonu için kullanılırdı. İzole edilen metabolitin miktarı cihazdaki analiz için yetersiz düzeyde olurdu. Modern yüksek alanlı cihazlar, bilgisayar teknikleri, NMR spektroskopisinin daha iyi anlaşılması ile NMR kullanımı temel teknikler arasında yer almaktadır.

13 Çözünürlük 13 Belirli çözücüler kullanılarak ilacın çözünürlüğü incelenmelidir, böylece en iyi ekstraksiyon yöntemi belirlenebilir. En uygun ekstraksiyon çözücüsü ilacın tamamını yada büyük bir kısmını endojen bileşik veya metabolitlerden çekip alan çözücüdür. Ekstraksiyonda geri kazanım düşük ise kesinlik de düşüktür Zayıf asit ve bazlar için ph seçimi önemlidir. ph-çözünürlük profili çıkarılmalıdır. Organik çözücü ile belirli bir ph deki tampon çözelti arasında ilacın dağılımı için organik faza geçen ilaç miktarı ölçülerek ph ya karşı grafiği çizilir. İlacın radyoaktif işaretlenmiş formu ile bu işlemleri yapmak özelikle düşük derişimlerde kolaylık sağlar.

14 Yöntemin Seçimi 14 Ekstraksiyon koşulları İç standart kullanımı

15 Ekstraksiyon Koşulları 15 Ekstraksiyon koşullarının teorisi lipofil özellik ve zayıf asit/bazların iyonizasyonuna dayanır ve tamponlanmış biyolojik sıvıdan ilacın ektraksiyonu için optimum koşullar fizikokimyasal özelliklerden tahmin edebilir. Ancak metabolitler ve endojen bileşikler varlığında bu basit bir konu değildir. Mevcut literatür bilgisi (pka, logp, plazma proteinlerine bağlanma karakteristikleri) ve benzer yapılar için oluşturulmuş ekstraksiyon şemalarından yararlanılabilir. Analitik profil verileri ve verimli bir ekstraksiyon şemasına karar verildikten sonra seçici ölçüme olanak sağlayan bir ayırma tekniği ile biyolojik sıvıdaki uygulamalara geçilir. Bu aşamada biyolojik sıvının kendisi ve ilaç katılmış hali için uygun yanıtlar alındığı takdirde metabolitler eklenerek işlemlere devam edilir.

16 Ekstraksiyon Koşulları 16 Olası sorunlar şunlarla ilgili olabilir: İlacın proteinlere kuvvetli bağlanması (plazmadan kolayca ekstre edilemez). Numunenin denaturasyonu sırasında çökmüş proteinlere ilacın istenmeyen absorpsiyonu Endojen bileşiklerden kaynaklanan girişim (kromatografi ve ekstraksiyon sırasında bunların yeterince uzaklaşmaması). Kromatografik sistemin yeniden gözden geçirilmesi ve daha seçici dedektörlerin kullanılması çözüm olabilir. Uygun bir sistem belirlendikten sonra miktar tayini yapılır. Yüzde geri kazanım belirlenir. Kör numuneye bilinen miktar ilaç katılarak olası kayıplar kontrol edilir. Tekrar edilebilir sonuçların eldesi partisyon düşük olsa bile değişkenlerin yönteme etkisini azaltacaktır.

17 İç Standart (IS) Kullanımı 17 Özellikle kromatografik yöntemlerde uygun kullanımla kesinlik artar. IS, analite benzer yapıda olmalı, bilinen derişimde olmalı, analizden önce bilinen derişimlerde numuneye katılmalı, derişimi analitinkine yakın olmalı, ölçümler sonunda geri kazanım yüzdesi analitin yanıtlarını düzeltmek için kullanılabilmelidir.

18 İç Standart (IS) Kullanımı 18 En yaygın uygulama analizden hemen önce final ekstreye katılmasıdır. Ancak bu uygulama ekstraksiyon ile ilgili değişkenlikleri yansıtmaz. Daha doğru bir uygulama IS nin orijinal biyolojik örneğe katılması ve tüm işlemlerde yer almasıdır ve gerçek amaca daha uygundur.

19 İç Standart (IS) Kullanımı 19 Fizikokimyasal özellikleri analite yakın bir kimyasal yapıya sahip IS seçildiğinde, ilgili ph değerinde sulu ve organik fazlarda partisyonu, kullanılan koşulların tamamında stabilitesi, türevlerin dönüşümü, cam kaplara absorpsiyon ve benzer protein bağlanma özellikleri uyumlu olacaktır. Geniş bir aralıkta görülen geri kazanım değerlerini düzeltme kapasitesi ile analizler arasında görülen ve kanıtlanamayan farklılıkları telafi etmek için kullanılmalıdır. Klinik çalışmalarda en uygun IS birlikte alınan bir ilaç olabilir. Ölçümlerde hem IS hem analit sinyali (pik alanı veya pik yüksekliği) ölçülerek iki bileşiğin yanıt oranları hesaplanır ve standart için aynı koşullarda hazırlanan kalibrasyon eğrisi eşitliğinde çözülerek miktarları hesaplanır. IS nin kesin değerinin bilinmesine gerek yoktur ancak numune ve standartlara aynı miktarda katılması önemlidir.

20 İç Standart Kullanımı 20 ph partisyon profiline dikkat edilmeli, benzer ekstraksiyon karakteristikleri için ilaç ve IS nin partisyon profilleri (ph ya karşı ekstre edilen fraksiyon grafiği) oluşturulmalıdır. Analitik işlemlerin bir parçası olan bir transformasyon varsa İS de buna maruz kalmalıdır. Türevlendirmede sterik etkiler dikkate alınmalıdır. IS, duyarlılıktaki değişimleri yansıtmalıdır. Patolojik numunelerle çalışırken dikkat edilmelidir. Normal numunelerde olmayan, farklı bileşenler analizi etkileyebilir. İS seçerken yapısına dikkat edilmelidir. Kalibrasyon ve deneysel örneklere aynı miktar katılması önem taşır, tam derişiminin bilinmesine gerek yoktur.

21 Yöntemin Değerlendirilmesi 21 Toksikoloji ve metabolizma çalışmalarında çalışılan türler için girişim veya metabolizmada farklar nedeniyle değerlendirme gerekir. Mevcut literatür bilgisinden hareketle uygulanacak yöntem seçilerek analizin yapılacağı laboratuvar koşullarına uygun hale getirilmelidir. Bunun için, Kesinlik Doğruluk Spesifiklik LOD

22 Kesinlik 22 Bir yöntemin kesinliği tekrarlı ölçümler arasındaki uyum olarak tanımlanır. SD, RSD ile ifade edilir. Beklenen derişim aralığında 6 derişimde 6 tekrar analizi tavsiye edilir, gün içi ve günler arası kesinlik oluşturulur. RSD farklı derişimlerdeki kesinliğin değerlendirilmesinde daha iyi fikir verir. Günler arası kesinlik, rutin analizlerin yapıldığı laboratuvarlar için çok önemlidir. Analizcinin yetenek ve deneyimi ile cihazın güvenirliğini gösterir.

23 Doğruluk 23 Bulunan miktarlar ile gerçek değer arasındaki uyumdur. Deney sonucu bulunan değerlerin bilinen değerler ile karşılaştırılması ile belirlenir. Materyalin bilinen miktarlarını biyolojik ortama katarak veya aynı numuneye referans yöntem uygulayarak belirlenir. Kalibrasyon grafiği analizci tarafından hazırlanmış ise ve bu doğruluk belirlenmesinde kullanılıyorsa bu durum ifade edilmelidir.

24 Spesifiklik 24 Endojen bileşikler ve metabolitler varlığında analitik yöntemin tayini amaçlanan bileşik için yanıt üretme yeteneğidir. Kromatografik çalışmalarda pikin yerinin kör çalışmada boş olması gerekir. Analiz edilen ilaç ile metabolit piki üstüste geldiği zaman teşhis için kütle spektrumları standart maddelerinki ile karşılaştırılmalıdır. Metabolitler ve diğer ilaçlarla ilgili olası girişim için yöntem test edilmelidir.

25 Saptama Sınırı (LOD) 25 Körden (blank) farklılaşan ölçülebilen en küçük derişim değeridir. Bu terim duyarlılık olarak da ifade edilir ancak LOD daha doğrudur. Duyarlılık derişim yanıt kalibrasyon grafiğinde eğimi tanımlamak için de kullanılır. %20 bağıl standart sapma kabul edilebilir kesinlik değeridir.

26 Analitik Yöntem Raporu 26 Beklenen duyarlık düzeyi ile birlikte problemin genel ifadesi Önerilen yöntemin detaylı tarifi Yöntem geliştirme Ekstraksiyon koşulları Çözücülerde ilacın stabilitesi Kromatografik sistemin seçimi Saptama sisteminin seçimi Yöntemin değerlendirilmesi Yöntemin geri kazanımı Kesinlik Doğruluk Spesifiklik Duyarlılık Uygulama