Nükleik asitler. Deoksiribonükleik asit Ribonükleik asit DNA nın YAPISI ve ÖZELLİKLERİ

Transkript

1 Nükleik asitler Sıcaklıkla öldürülmüş S suşları Canlı R suşlarını canlı S suşuna dönüştürür a) Farelere virulan S suşu enjekte edildiğinde ölür b) R suşu enjekte edildiğinde yaşar c) Isıyla öldürülmüş S suşu enjekte edildiğinde yaşar d) Isıyla öldürülmüş S suşu ve canlı R suşu enjekte edildiğinde ölür Deoksiribonükleik asit Ribonükleik asit Frederick Griffith-1928 Streptococcus pneumonia S suşundaki bir faktör R suşunu transforme ederek S haline dönüştürdü 1 2 R suşunu virulan yapan faktör DNA dır.oswald Avery-1944 Isıyla öldürülmüş S suşundaki hücre ekstrelerinde bulunan DNA bozulursa ve bu ekstre R suşuyla karıştırılırsa canlı nonvirulan R suşları fareyi öldürmez 3 4 DNA nın YAPISI ve ÖZELLİKLERİ *DNA saf olarak elde edilmiş ve X ışınları kırınımı yöntemiyle molekül yapısı araştırılmıştır. *İngiliz bilim adamı olan MAURİCE H.F. WİLKİNS ve ROSALİND FRANKLİN tarafından X ışınları kırınımı yöntemiyle yapılan araştırmalar sonucunda, DNA nın daha net ve ayrıntılı bantları elde edilmiştir. *Daha sonra Amerikalı genetikçi JAMES D.WATSON ve bir İngiliz biyofizikçisi olan FRANCİS H.C. CRİCK tarafından bu bulgular değerlendirilerek, DNA nın sarmal yapılı, yangın merdiveni şeklindeki molekül modeli ileri sürülmüştür. *Watson ve Crick in 1953 te yayınladıkları DNA molekül modeline göre, DNA molekülü sarmal şeklinde birbiri üzerine kıvrılmış iki iplikten oluşmuştur 5 6 1

2 Nükleotidler Nükleotidlerdeki bazlar 7 8 eker-p omurgası ve 3D yapısı Antiparalel zincirler mavi ile gösterilmiştir bazlar arası H bağları A-T arasında 2 G-C arasında 3 bağ bulunur. 3.34nm Helixin bir dönüşü Bazlar arası mesafe 0.334nm (3.34Angstrom) 9 10 eker ve bazdan oluşan birim nükleozid olarak adlandırılır. Fosfodiester bağı iki komşu deoksiriboz arasındadır. 11 Büyük ve küçük oluklar DNA ya proteinlerin bağlanmasını kolaylaştırırlar. DNA sağa dönümlü heliks yapıdadır. Solüsyondaki form B formudur 12 2

3 DNA Hücre çekirdeğindeki DNA molekülleri, hücrenin bölünme evresinde, kompleks katlanmalarla kromozom denen yapılar haline gelirler Canlı hücrelerde genetik bilginin saklandığı kromozomal komponent DNA da saklı olan genetik bilgi, replikasyon suretiyle kalıtılabilmekte transkripsiyon olayı ile RNA ya aktarıldıktan sonra translasyon olayı ile protein haline çevrilebilmektedir DNA nın denatürasyonu ve renatürasyonu RNA (ribonükleik asit) DNA daki genetik bilgiyi bir fonksiyonel proteine dönüştürmekte aracı rol oynayan nükleik asittir RNA molekülü çift sarmallı değil tek zincir şeklindedir; bazen firkete modeli gibi çeşitli modeller oluşturabilir RNA çeşitleri haberci RNA (messenger RNA, mrna) taşıyıcı RNA (transfer RNA, trna) ribozomal RNA (rrna) haberci RNA (messenger RNA, mrna) protein sentezi için gerekli genetik mesajı nükleustaki DNA dan sitoplazmadaki ribozomlara taşıyan RNA lardır. Protein sentezi için kalıp görevi görür. mrna üzerindeki, her biri bir amino aside uyan üçlü baz gruplarına kodon denir

4 trna (transfer RNA, taşıyıcı RNA) sekonder yapıları yonca yaprağı şeklinde olan RNA dır protein sentezine girecek amino asitleri sentez yerine taşır Bir antikodondaki bazlar, protein sentezi için kalıp görevi gören mrna nın üzerinde bulunan, trna ile taşınan amino aside uyan kodondaki bazların tamamlayıcısıdırlar Ile taşır ribozomların yapısındaki RNA dır; rrna (Ribozomal RNA) Svedberg ünitesi (S) olarak belli sedimantasyon katsayılarına sahip olan çeşitli rrna lar kombine olarak ribozomları oluştururlar AUC Ile ne uyar Nükleik asitlerin reaksiyonları DNA nın nükleotid dizisi, organizmanın protein moleküllerinin tümünün sentezinde bilgi kaynağıdır DNA molekülü, sakladığı genetik bilgilerin sonraki nesillere aktarılması için kendi kopyasını oluşturur (replikasyon). Bir protein molekülüne ait olarak DNA da saklanan genetik bilgiler, önce bir RNA molekülünün sentezi suretiyle kopyalanır veya yazılır (transkripsiyon). transkripsiyonla RNA ya kopyalanmış olan genetik bilgiler daha sonra okunarak bir protein molekülü haline çevrilir (translasyon). Transkripsiyon ve translasyon olaylarının toplamı gen ifadesi (gen ekspresyonu) olarak adlandırılır

5 SANGER METODU Frederick Sanger, Cambridge'de Medical Research Council'de 10 küsur yıllık bir çalışmanın sonucunda, 1955'te insülinin amino asit dizilimini ortaya koyarak 1958 Kimya Nobel'ini almaya hak kazandı. * Sequences, sequences, sequences, Sanger F., Annual Rev. Biochem. 57, 1-28, *DNA dizi analizinden sık kullanılan yöntem Fred SANGER ve arkadaşlarının geliştirdiği yöntem olan zincir sonlanma yöntemidir(sanger et al., 1977). *Bu yöntem enzimatik DNA sentezine dayanır ve günümüzün en yaygın kullanılan DNA dizi analizi tekniğidir. *Bu yöntemde dizisi saptanacak olan DNA ipliği yeni sentezlenecek iplik için kalıp olarak kullanılır. *DNA sentezini sağlamak için Taq DNA polimeraz kullanılabilir. * Yöntemin temeli DNA polimerazın dntp lerin (deoksiribonükleozittrifosfat) yanısıra deoksiribozun 3 pozisyonunda OH grubu taşımayan ddntp leride (dideoksiribonükleozittrifosfat) substrat olarak kullanabilmesine dayanır. *Sentezlenen DNA ya bir ddntp nin katılması 3 pozisyonunda OH grubu olmadığı için sentezi durdurur. datp ddatp *Dizi analizi yapılırken dört ayrı reaksiyon karışımı hazırlanır. *Her bir karışım kalıp DNA zinciri, bir primer, dntp lerin dördü ve az miktarda ddntp lerden birini içerir. *Özgül zincir sonlanması için her bir reaksiyonda farklı bir ddntp bulunur. *Reaksiyonların her birinde çok az miktarda modifiye nükleotit kullanıldığı için yeni zincir sentezi rastgele sonlanarak bir dizi DNA fragmenti meydana gelir. *Reaksiyonlar sonucu elde edilen DNA parçalarına elektroforez uygulanarak jel üzerinde yan yana yürütülür. *Uygulanan elektriksel alanın etkisi ile DNA parçacıkları en kısası en önde olmak üzere jel üzerinde bir merdiven görüntüsü oluşturur. *İşaretleme yöntemine göre jel üzerinde, tespit edilen parçacıklar reaksiyon karışımına konulan ddntp nin tipine göre okunur

6 UYGULAMA (1) 1-Bençlerde duran buz içerisinde 4 adet ependorf tüpü bulunmaktadır. A tüpünde - izole edilmiş genomik insan DNA sı B tüpünde izole edilmiş HIV virüsü DNA sı C tüpünde izole edilmiş balık DNA sı D tüpünde saf su Sorular 1) DNA bulunan tüpleri tespit etmek için ne yapmanız gerekir? (kantitatif tayin) 2) Bu işlemi nasıl gerçekleştirirsiniz? 3) Tam olarak miktar tayini yapabilir misiniz? 4) Diyelim içinde DNA olan tüpleri buldunuz, saflığını nasıl kontrol edersiniz? 5) Örnekler neden buz içinde?

7 EtBr Nokta Testi *DNA konsantrasyonunun belirlenmesinde etidium bromür (EtBr) nokta testi basit ama güvenilir sonuçlar veren bir metoddur. *U.V ışığın absorpsiyonu nükleik asit örneklerindeki DNA konsantrasyonunun belirlenmesinde sıkça kullanılmaktadır. *Örnek içerisindeki DNA miktarı ile açığa çıkan U.V floresan ışığın miktarı arasında doğru bir orantı vardır. *Bilinmeyen DNA nokta yoğunluklarının bir bilgisayar yazılımı yardımıyla standart DNA noktaları ile karşılaştırılması esasına dayanmaktadır. *CTAB DNA izolasyon protokolüne göre DNA izolasyonları yapılan örneklerin kantitatif DNA miktar tayinleri EtBr nokta testi ile yapılmıştır. *Uygulanan protokolde şu aşamalar gerçekleştirilmiştir; Calf thymus DNA sı (Sigma D1501) kullanılarak 170 ng/µl konsantrasyonda stok solüsyon hazırlanmış ve 0, 3, 6, 10, 12.5, 21.5, 25, 42.5, 50, 85, 100 ve 170 ng/µl olacak şekilde dilusyona uğratılmıştır. 10 mg/ml olan stok EtBr solüsyonu kat seyreltilerek protokolde kullanılacak olan konsantrasyona (1 ng/µl) getirilmiştir. Öncelikle parafilm üzerine aralıklı olarak 10 µl EtBr (1 ng/µl) koyulur. Daha sonra standart DNA ile izole edilen ve miktarı bilinmeyen DNA stoklarından 1 er µl EtBr üzerine eklenir. Örneklere aynı sayıda pipetleme yapılarak EtBr ve DNA ların karışması sağlanır. U.V. jel görüntüleme cihazının içine serilen streç filmin üst kısmına EtBr ile karıştırılmış standart DNA örnekleri konsantrasyonu az olandan çok olana doğru sıralanırken alt kısma da EtBr ile karıştırılmış miktarı bilinmeyen DNA örnekleri pipet yardımıyla koyulur ve fotoğrafları çekilir ( ekil 3.2.3). Çekilen fotoğraflarda, standart ve miktarı bilinmeyen DNA örneklerinin ışık yoğunluk ölçümleri ImageJ programı ( kullanılarak gerçekleştirilmiştir Standart ve DNA miktarı bilinmeyen örneklerin ışık yoğunluk ölçüm sonuçları Microsoft Excel e aktarılmıştır. Standart DNA örneklerinin ölçüm sonuçları doğrultusunda oluşturulan grafikten yararlanılarak miktarı bilinmeyen DNA örneklerinin konsantrasyonları hesaplanmıştır 39 7