SADE ve SAGE ve Gen Ekspresyonunun Seri Analizi. Prof.Dr. Nermin GÖZÜKIRMIZI

Transkript

1 SADE ve SAGE ve Gen Ekspresyonunun Seri Analizi Prof.Dr. Nermin GÖZÜKIRMIZI

2 Gen Anlatımının Belirlenmesi DNA mikroçalışmaları Makroçalışmaları EST (Expressed sequence tag) Gen anlatımının seri analizi (SAGE)

3 Gen anlatımının seri analizi (SAGE) teknolojisi Velculescu tarafından 1995 yılında geliştirilmiştir. SAGE, transkriptin miktarı ve çeşidi ile ilgili detaylı ve hızlı bilgi vermektedir. SAGE, mrna saflaştırılması, cdna taglarının oluşturulması, izolasyonu ve PCR ile çoğaltımı basamaklarından oluşmaktadır. SAGE nin etkinliğini arttırmak için PCR döngü sayısı arttırılarak elde edilen ürünün miktarının arttırılması amaçlanmaktadır.

4 SAGE yönteminin mikroadaptasyon formu olan SADE tekniğinde ise az sayıdaki ( ) hücrede nicel gen anlatımı belirlenebilmektedir.

5 Her iki metod arasında az miktarda cdna elde edilmektedir. Bunun sebebi pekçok faktör tarafından biotinalat DNA bağlanımının değişmesidir. Bu faktörler, serbest biotin ve fenolün varlığı, biotinilatlı DNA parçasının uzunluğu, kompozisyonu ve biotin molekülü ile oligo (dt) arasındaki mesafedir.

6 Bu metodlar büyük miktardaki biyolojik materyallerin (1-5 mikro gram polya mrna) analizini gerçekleştirebilecek şekilde tasarlanmıştır. Bununla birlikte, memeli dokuları özel fizyolojik fonksiyonları ve özel gen anlatımı paternlerine sahip farklı hücre tiplerinden oluşmaktadır. Bu da yüksek organizmada geniş skaladaki anlatım bilgisinin yorumlanmasının karmaşık hale geldiğini göstermektedir. Bu sebepten dolayı belirlenmiş hücre popülasyonunun analizi için daha uygun metotların çıkarılması gerekmektedir.

7

8 SAGE Yapım Aşamaları Boncuklarla RNAs yakalanması cdna içinde RNA nın çevrilmesi Bir kısımda iki tane tag bulunur Di-tag ın PCR ile milyonlarca kopyası yapılır Uzun bir concatamer içindeki modüller ve yapışkan Di-tag birlikte uzaklaştırılır Concatamerler bakteri içine konur ve milyonlarca kopyası elde edilir. En iyi konsatamerler bulunur ve dizilemesi yapılır Kaç tane cdna olduğunun belirlenmesi bilgisayar ortamında yapılır ve sayılır RNA dan elde edilen gen ile herbir tag ın dizisi eşleştirilir

9

10

11 Tags and Ditags from Sequencing Gel

12 SAGE Teknolojisinin Avantajları Bilinen genlerin önceki seçimi dışında bütün transkriptlerin analizi (transcriptome). Bilinen ve bilinmeyen genlerin herikisi içinde kantitatif veri sağlar. Deneysel bir uygulamanın (karsinojen, hormon) sonucu olarak gen anlatımında belirlenen değişiklikler için uygundur.

13

14 Geniş olarak gen anlatım çalışmaları çeşitli teknikler kullanılarak rutin olarak yapılmaktadır. cdna ve oligonükleotid array ler, Gen Anlatımının Seri Analizini (SAGE) içeren tekniklerdir. Birçok memeli dokusu markalı hücresel heterojenite gösterir. Saflaştırılan hücre popülasyonları ve anatomik olaral belirlenmiş doku fragmentlerinin analizi ile uyumlu metodları yapmak için oldukça tercih edilir. Bu amaçla SADE teknolojisi geliştirilmiştir. SADE

15 SAGE Deneysel olarak 3 prensibe dayandırılmıştır. Transkriptin spesifitesini sağlayan ve yeterli bilgiyi taşıyan yaklaşık 10 baz çifti uzunluğunda tagların oluşturulması. Concatamer olarak adlandırılan, klonlanıp dizilenebilen seri halindeki uzun molekülleri oluşturmak üzere tag ların birbirlerine bağlanması Elde edilen transkript tag larının kantitatif analizi ile gen anlatım profillerinin kurulması. SAGE tekniği differantial display gibi diğer farklılaşmış gen anlatım tekniklerinden çok daha güçlü bir tekniktir. Parçalı dizi ve herbir mrna nın bolluğu hakkında kantitatif bilgi sağlanır.

16 Bu yaklaşım, yalnız herhangi bir zamanda kanserli ve normal hücrede anlatım yapan bütün transkriptlerin belirlenmesinde değil aynı zamanda herbir transkriptin nisbi bolluğu ile ilgili de kantitatif bilgi sağlar. Örnekler arasında farklılıkların istatiksel analizini sağlar. SAGE nin bir dezavantajı nispeten kısa bir zamanda yüzlerce örneğin karşılaştırılması için uygun değildir. Ancak, bu yalnızca laboratuvar çalışmalarında dizileme gücünün sınırlandırmasıdır. Açık olarak, dizileme hızı artarsa analiz edilebilir örnek sayısı da artar.

17 SAGE Kullanımının Teknik Avantajları Özellikle düşük miktarda RNA ve küçük miktarlardaki örneklerin kullanımı önemli bir avantajdır. SAGE mrna popülasyonlarının istatistiksel olarak açıklanmasını sağlar. SAGE metodunun değişik formları geliştirilmiştir. Bu metodlar MicroSAGE, SAGE lite ve SAGE Adaptation to Downsized Extracts (SADE) dir. SADE beyin transkriptomları ve fare böbreğinin karakterizasyonu için yapılan çalışmalarda kullanılır. Böbrek çalışmalarında spesifik mikro seviyesindeki küçük parçalardaki nefron segmentlerinden anlatım kütüphanelerinin gelişmesi mümkündür.

18 Beyin bölgesi için spesifik olan moleküler markerlar belirlenmiştir. SAGE kullanılarak spesifik hücre alt popülasyonlarının analizi sağlanarak çeşitli metodlarla (microdissection veya immunopurification) purifiye edilen hücre ekstraktlarından mrna elde edilir.

19