BT 42 TİROSİNAZ ENZİMİNİN EKSTRAKSİYONU, SAFLAŞTIRILMASI VE FENOLLERİN GİDERİMİNDE KULLANIMI

Transkript

1 BT 42 TİROSİNAZ ENZİMİNİN EKSTRAKSİYONU, SAFLAŞTIRILMASI VE FENOLLERİN GİDERİMİNDE KULLANIMI D.Öztan 1, U.Gündüz Zafer 2 1 Gazi Üniversitesi, Mühendislik-Mimarlık Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, Maltepe, Ankara e-posta: dyguoztan@yahoo.com 2 Gazi Üniversitesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, Maltepe, Ankara e-posta: ufzafer@gazi.edu.tr ÖZET Bu çalışmada, üzümden tirosinaz enziminin ekstraksiyonu ve saflaştırılması yapıldı. Böylece daha ucuz maliyetle ekstrakte edilen ve saflaştırılan tirosinaz enzimi, uygulama alanlarından biri olan sulardaki fenollerin giderimiyle ilgili çalışmalar için kullanıldı. Aynı zamanda piyasadan alınan saf tirosinaz enzimi ile enzim aktivite tayini, fenol giderimi çalışmaları yapıldı, daha sonra da üzümden ekstrakte edilen ve saflaştırılan enzim ile bu çalışmalar tekrar denenip karşılaştırma imkanı bulundu. Ekstraksiyon ve saflaştırma aşamalarında; sırasıyla, ham enzim ekstraktının eldesi, Triton X-100 ve PVP (polivinil prolidon) kombinasyonu ile saflaştırma, daha sonra da amonyum sülfat çöktürmesi yapılarak istenilen enzim elde edildi. % 80 verimle 8,3 kat saflaştırma yapıldı. Anahtar Kelimeler: Üzüm; Tirosinaz; Fenol; Ekstraksiyon; Saflaştırma

2 1. GİRİŞ Nüfusu hızla artmakta olan dünyamızda endüstrileşmenin yol açtığı başlıca sorunlardan biri de endüstriyel atıklardır. Endüstriyel atıkların yanı sıra, insan ve hayvan kaynaklı atık ve artıklar da dünyamız için büyüklüğü giderek artan bir sorun oluşturmaktadır. İster endüstriyel kaynaklı ister insan ve hayvan kaynaklı olsun, bu atık ve artıkların yol açtıkları veya açacakları sorunların önlenmesi hem dünyamız açısından hem de gelecek nesiller açısından oldukça büyük önem taşımaktadır. Yirmi birinci yüzyıla adım attığımız şu günlerde çevre bilincinin dünyamızda halen tam olarak yerleşmemiş olması, gelecek kuşaklar açısından büyük bir kayıptır. Şu bir gerçektir ki, çevre kalitesinin kontrolü bireysel bir istek olmaktan çok toplumsal bir gerekliliktir. Son yirmi yıl içerisinde, atıkların arıtımında enzimlerin kullanımına yönelik oldukça dikkate değer çalışmalar yürütülmüştür. Enzimlerin atık arıtımında sundukları yeni olasılıklar üzerindeki çalışmalar yoğun bir şekilde devam etmektedir. Biyoteknolojide yaşanan gelişmelere bağlı olarak, daha iyi izolasyon ve saflaştırma yöntemlerinin kullanılması ile daha ucuz ve daha kolay elde edilebilir enzimlerin üretimi sağlanmaktadır [1, 2]. 2. DENEYSEL YÖNTEM Deneysel çalışmada kullanılan yöntemler; Enzim Aktivite Tayini; Enzim için en uygun substratın katekol olduğu yapılan daha önceki çalışmalardan belirlendi [3]. Bu nedenle çalışmada substrat olarak katekol, ph=7 de sodyum fosfat tamponu ve yeterli miktarda enzim kullanılarak enzim aktivite tayini yapıldı. Piyasadan Alınan Saf Enzim ile Yapılan Fenol Ayrımı; İlk olarak yapılan enzim aktivite tayininden sonra 30 o C sıcaklıkta ph=7 deki sodyum fosfat tamponu içinde başlangıç fenol konsantrasyonları 50, 150 ve 250 ppm olan fenol çözeltileri için, farklı miktarlarda tirosinaz enzimi kullanılarak fenol giderimi yapıldı ve bunların arıtım üzerindeki etkileri incelendi. Üzümden Tirosinaz Enziminin Ektraksiyonu ve Saflaştırılması; Bunun için 250 g üzüm 125 ml sodyum fosfat tamponu içinde (0,1 M, ph=7,3) 15 saniye mikser ile karıştırıldı ve tülbenten süzüldü [4,5]. Elde edilen ham enzim ekstraktı 4 o C de 4000 rpm de 15 dakika santrifüj edildi. Çökelti 1 saat 4 o C de 4000 rpm de % 1,5 TX-100 ve % 2,0 PVP (polivinil prolidon) ile 100 ml sodyum fosfat tamponu içinde ekstrakte edildi. Üstteki kısım %30 doygunluktaki amonyum sülfatla çöktürüldü. Çöktürme işlemi, reaksiyon kabı içerinde 1 saat 4 o C de 100 rpm de karıştırılarak yapıldı. 1 saatin sonunda 4 o C de 30 dakika santrifüjlendi. Üstteki kısma %90 doygunlukta amonyum sülfat tekrar eklendi. 1 saat 4 o C de 100 rpm de reaksiyon kabı içerisinde karıştırılarak tekrar çöktürme yapıldı. 1 saatin sonunda yine 4 o C de 30 dakika santrifüjlendi. Böylece %30-%90 doygunluk arasındaki çökelek toplandı. 40 ml 0,1 M ph=7,3 olan sodyum fosfat tamponu içinde yeniden çözdürüldü. Böylece istenilen enzim elde edilmiş oldu. Bu ekstraksiyon ve saflaştırma basamakları Şekil 1 de verilmektedir.

3 4 o C % 1,5 TX-100 +% 2,0 PVP 4000 rpm 4000 rpm Eklenmesi 4 o C, 1 saat 15 dak 0,1M tampon ph=7,3, 15s (NH 4 ) 2 SO 4 (NH 4 ) 2 SO 4 % 90, 1 saat, 4 o C %30, 1 saat 4 o C 4000 rpm 4000 rpm Enzim 4 o C, 30 dak 4 o C, 30 dak + Enzim Enzim Şekil 1: Enzim Ekstraksiyon ve Saflaştırma Basamakları Üzümden Elde Edilen Enzim ile Yapılan Fenol Ayrımı; Enzim aktivite tayininden sonra 30 o C sıcaklıkta ph=7 deki sodyum fosfat tamponu içinde başlangıç fenol konsantrasyonu 50 ppm olan fenol çözeltisi için, üzümden elde edilen enzimden 10 unit/15 ml kullanılarak fenol giderimi yapıldı. 3.SONUÇLAR VE TARTIŞMA Çalışmanın ilk aşamasında saf tirosinaz enzimi ile, başlangıç fenol konsantrasyonu 50 ppm, 150 ppm ve 250 ppm olan çözeltilerden, 30 o C sıcaklıkta ve ph=7 de, enzimatik metodun kullanılması ile fenol ayırma işlemi gerçekleştirildi. Farklı miktarlarda enzimin kullanılması ile elde edilen fenol ayırma verimleri, Tablo 1 de gösterilmektedir.

4 Tablo 1: 30 o C Sıcaklıkta ve ph=7 de Farklı Enzim Miktarları ile Elde Edilen Fenol Ayırma Verimleri ( V= 15 ml ) Başlangıç Fenol Konsantrasyonu (ppm) 50 Kullanılan enzim miktarı (unit) Fenol Ayırma Verimi (%) 7,02 7,8 8, Kullanılan enzim miktarı (unit) 9,72 10,8 11,88 Fenol Ayırma Verimi (%) 68, ,3 250 Kullanılan enzim miktarı (unit) 16,23 18,03 19,83 Fenol Ayırma Verimi (%) Tablo 1 deki sonuçlara göre başlangıç fenol konsantrasyonları 50 ppm, 150 ppm ve 250 ppm olan sulu fenol çözeltileri için kullanılan enzim miktarları ve fenol ayırma verimleri arasındaki ilişkiler, Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 4 de gösterilmiştir. Verim ( % ) Kullanılan Enzim Miktarı (unit) Verim ( % ) Kullanılan Enzim Miktarı (unit) Şekil 2: 50 ppm konsantrasyonundaki Şekil 3: 150 ppm konsantrasyonundaki fenol çözeltisi için kullanılan enzim fenol çözeltisi için kullanılan enzim miktarlarına göre elde edilen verimler miktarlarına göre elde edilen verimler (çözelti hacmi = 15 ml), T= 30 o C, ph=7. (çözelti hacmi = 15 ml), T= 30 o C, ph=7.

5 73 72 Verim ( % ) Kullanılan Enzim Miktarı(unit) Şekil 4: 250 ppm konsantrasyonundaki fenol çözeltisi için kullanılan enzim miktarlarına göre elde edilen verimler ( çözelti hacmi = 15 ml ), T= 30 o C, ph=7. Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 4, çalışılan deneysel koşullar ve enzim konsantrasyonu aralığında, enzim miktarının artması ile fenol ayırma veriminin arttığını göstermektedirler. Çalışmanın ikinci aşamasında önce üzümden tirosinaz enzimi elde edildi. Daha sonra da elde edilen bu enzim fenol ayırma deneyinde kullanıldı. Ekstraksiyon ve saflaştırma aşamaları; sırasıyla, ham enzim ekstraktının eldesi, Triton X-100 ve PVP (polivinil prolidon) kombinasyonu ile saflaştırma, daha sonra da amonyum sülfat çöktürmesi yapılarak üzümden tirosinaz enzimi, 8,3 kat saflaştırılarak % 80 verimle elde edildi. Tablo 2 her bir aşamayı ve elde edilen verimleri göstermektedir. Verimi ve saflaştırmayı daha da artırmak için çalışmalara devam edilecektir. Tablo 2: Üzümden Tirosinaz Enziminin Saflaştırılması ve Ekstraksiyonu Toplam Aktivite Toplam Protein Spesifik Aktivite Verim Saflaştırma Ekstraksiyon ve Hacim Aktivite Protein Saflaştırma Adımları ( ml ) (U/ml) ( EU ) (mg/ml) ( mg ) (U/mg protein) ( % ) ( n-kat ) Ham Enzim Ekstraktı ,33 335,16 541, PVP ve TritonX-100 Ekstraktı ,89 83, , ,3 %30-90 Amonyum Sülfat ,67 26, , ,3

6 30 o C sıcaklıkta ph=7 deki sodyum fosfat tamponu içinde başlangıç fenol konsantrasyonu 50 ppm olan 15 ml lik fenol çözeltisi için, üzümden elde edilen enzimden 10 unit/15 ml kullanılarak % 64 verimle fenol giderimi yapıldı. Bu verimin, saf tirosinaz enzimi ile yapılan fenol ayırma veriminden daha düşük olmasının nedeni, elde edilen karışımda tirosinaz enzimi dışında bazı safsızlıkların olmasıdır. 4. TEŞEKKÜR Bu çalışma, Gazi Üniversitesi BAP tarafından MMF 06/ kodlu ve MMF 06/ kodlu projeleriyle desteklenmektedir. Ayrıca Gazi Üniversitesi İleri Malzeme ve Boya Araştırma Merkezi(GİMBAM) çalışanlarına, laboratuvar olanaklarından yararlanmamızı sağladıkları için teşekkür ederiz. 5. KAYNAKLAR [1] Ikehata, K., Characterization of Tyrosinase for the treatment of aqueous phenols, Canada Bioresource Tecnology 74, [2] Karam, J. Nicell, J.A., Potential applications of enzymes in waste treatment, J.Chem. Tech. Biotechnol., 69, [3] Zhang, X., Flurkey, W.H., Phenoloxidases in Portabella mushrooms, Journal of Food Science, 62, [4] Rapeanu, G., Loey, A.V., Smout, C., Hendrickx, M., Biochemical characterization and process stability of polyphenoloxidase extracted from Victoria grape, Food Chemistry, 94, [5] Delicado, E.N., Triton X-114-aided purification of latent Tyrosinase, Journal of Chromatography B, 680,