B-TeZ IAC Aflatoksin M 1 3ml kullanarak Temizleme Süreci talimatı

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "B-TeZ IAC Aflatoksin M 1 3ml kullanarak Temizleme Süreci talimatı"

Irmak Öncel
7 yıl önce
İzleme sayısı:

Immunoafinite Kromatografi ile Aflatoksin M1 (AFM1) içeren Süt Ürünlerinin Sütünün Temizlenmesi ve Perbromid ile Postcolumn Türevlendirme ile Sonraki HPLC Analizi (Aflatoksin B1 ortak tespiti için)

1 Immunoafinite Kromatografi ile Aflatoksin M1 (AFM1) içeren Süt Ürünlerinin Sütünün Temizlenmesi ve Perbromid ile Postcolumn Türevlendirme ile Sonraki HPLC Analizi (Aflatoksin B1 ortak tespiti için) Prensip: Immunoafinite Kromatografi beraberinde matris bileşenlerinden etkili ayrılma ile aflatoksinlerin etkili zenginleştirme süreci anlamına gelir. Bu eluat en iyi HPLC ile belirleme için uygundur. Yıkama işleminin değiştirilmesi ile, PBS tamponunun 0.2M amonyum asetat çözeltisi ile değişimi anlamına gelir, GC uygulanabilir. Süt Örnek Hazırlama: Shundo et al. 1 yöntemine göre test edilecek süt 15 dakika boyunca 1540g ile ilk santrifüj edilir. Öz daha sonra ayırma hunisi kullanılarak ayrılır. Eğer ayrılma tamamlanmazsa, süt örneği kalan yağ parçacıklarının aşağıda bir sonraki adımda kolonu bloke etmesinden kaçınmak için filtre edilmelidir. Zenginleştirme Adımı IAC: 50ml yağsız süt 5ml 10X PBS ile seyreltilmelidir (10 kat konsantre edilmiş 50mM PBS tampon) ve sonra B-Tez IAC Aflatoksin M1 3ml kolonun üst kısmında bir haznede uygulanır. Afinite jel içinden akış oranı 1-3 ml/dk'dır. Dikkat! Ne jel ne de jel ve kolonun luer kilitli çıkışı arasında hiç büyük hava kabarcıklarının olmadığının farkında olun, sürekli akışı ya da gerekli madde değişimini engeller. Uygulama ve beklenen içeriklere bağlı olarak, daha büyük veya daha küçük özüt alikotları uygulanabilir. Bu gibi durumlarda örnek hesaplama (aşağıya bakınız) adapte edilmelidir. Eğer örnekler aynı anda hazırlanacak ise, 12 örnek için J.T. Baker manifold değer kanıtlamıştır. Yıkama: Tam örnek jelden geçtikten sonra 50mM PBS 5 ml si ile yıkanır. Jelde kalan sıvılar kolonun üstünden basınç veya alttan alçak basınç uygulanarak kaldırılır. Elüsyon: 1/5

2 B-TeZ IAC Aflatoksin M1 3ml kolonun üstünde örnek haznesi kaldırılır ve uygun bir şişe afinite kolonu altına yerleştirilir. Bağlı toksinler elüsyon çözücüsü olarak toplam 1.5ml metanol kullanılarak elüe edilir. Elüsyon süreci analitlerin tam olarak yayılmasını sağlamak için iki adımda gerçekleştirilir. İlk olarak, 0.5ml elüsyon çözücüsünden bir hacim uygulanır. Hacim kolondan geçtikten sonra yarım dakika bekletilir elüsyon çözücüsünün 1ml ikinci kısmı kolondan elue edilmeden önce. Kalan çözücü çözeltileri hafif bir uygulama ya da aşırı basınç ile elüe edilmelidir - Tüm metanolik parçalar kolon eluat vermek için bütünleşmiştir. Kolon elüat direk olarak HPLC içine enjekte edilebilir veya konsantrasyonların düşük olduğu durumda buharlaşma ile konsantre edilebilir (ör. sürekli nitrojen akımı altında 50 C de VLM buharlaştırıcısı ). Dikkat: Eğer buharlaşma ile konsantrasyon uygularsanız, koruyucu olarak 100µl asetik asit/su (50/50 v/v) ekleyin. Analit kaybını önlemek için, küçük hacimli kalıntıda konsantrasyonu durdurun, ör µl. Kalan daha sonra HPLC çözücüsü içinde tekrar çözünür, ör. aşağıda görülen örnek hesaplamada 400µl de, ve son olarak bir alikot sisteme enjekte edilir. IAC Kolon Özellikleri: A) Çalışma Aralığı ve B-TeZ IAC Aflatoksin M1 3ml Kolon Kurtarma Oranları: Kolonun çalışma aralığı: Kolonun Sıfır Kontaminasyonu: Çalışma aralığında AFM 1 için Garantili Kurtarma Oranları: (*) IAC başına ng AFM1 <0.04ng (LOD of HPLC-FLD method) >85% 2/5

3 Kurtarma oranları % 20 metanol veya % 10 asetonitril altında seyreltilmiş özütün çözücü içeriğine sınırlıdır. B) B-TeZ IAC Aflatoksin M1 3ml Kolonun Çapraz Reaktiviteleri (**) : Aflatoksin M 1 (AFM 1 ): 100% Aflatoksin B 1 (AFB 1 ): 98% Aflatoksin B 2 (AFB 2 ): 99% Aflatoksin G 1 (AFG 1 ): 50% Aflatoksin G 2 (AFG 2 ): 98% (**) IAC kurtarma oranlarının oranı eğer kolon başına 5ng Aflatoksin toplamının bir miktarı analiz edilirse C) B-TeZ IAC Aflatoksin M1 3ml Kolonun Kapasitesi (***) : Maksimum Kolon Kapasitesi: 0.9µg AFM1 (***) Aşırı AFM1, ör. 3µg, 2 ml PBS küçük bir hacmi 5 dakika için IAC ile inkübe edilir; daha sonra IAC 2ml PBS ile yıkanır ve bağlı olmayan bölümü analiz edilir. Eklenen analitin farklılığı ve bağlı olmayan analit maksimum kolon kapasitesine eşittir. D) B-TeZ IAC Aflatoksin M1 3ml Kolon Raf Ömrü: Raf ömrü: 2-8 C de 2 yıl oda sıcaklığında (20-25 C) 1 yıl AnalitikMetod: HPLC: Shimadzu; Kolon: Trentec Reprosil-Pur RP C ODS3 5µm; 125x3,0mm koruma kolonu ile; Mobil Faz A: metanol / deiyonize su (85/15 v/v); Mobil Faz B: metanol / asetonitril / deiyonize su (18/18/64 v/v/v); Meyil: 0.01 dk B 100 %; 16 dk B 100 %; 17 dk B 0 %; 19 dk B 0%; 20 dk B 100 %; Akış Oranı: 0.5ml/dk; Analiz Süresi: 30dk; Enjektör Hacmi:100µl Post Column Türevlendirme ( sadece aflatoksin B1 analizinin eşlik ettiği durumda tavsiye edilir): Dioksan / deiyonize su içinde 32 ppm piridinium hidrobromid perbromid (0.1/99.9, v/v); AkışOranı: 0.2ml/dk; T-cihaz tarafından dedektör ve kolonun sonu arasında reaksiyon kapiller koymak: PEEK-kapiller, 1/16 x 0.25 mm ID; uzunluk: 40 cm Floresan-Tespit: λ EX [nm]: 362nm; λ EM [nm]: 440nm. Sıcaklık: Makine ve çözücüler oda sıcaklığındadır. Çözücülerin helyum gazıyla gazı giderilir. AFM 1 içeriğinin Örnek Hesaplaması: (AFB 1 hesaplaması benzerdir) A) HPLC enjeksiyon başına Örnek Gram Eşdeğerlerinin Hesaplanması 50g Örnek 55ml Özüt 0.1ml 12.5g x x enjektör = Örnek 55ml Ekstraksiyon 0.4ml hacmi Eşdeğerleri Karışımı B) ng/g da incelenen hammaddenin Aflatoksin M1 kontaminasyonunun hesaplanması: # ng enjekte edilen AFM = ng/g AFM 1 hammaddede Örnek Eşdeğerleri [g] 3/5

4 Tampon Kimyasallar Cihaz ve Literatür: 10X PBS tampon: 12.4g KH 2 PO g K 2 HPO g NaCl Fosfat Tamponlu Tuzlu ph 7.4 (= 50mM PBS): 1L son hacme deiyonize su ile 100ml 10X PBS seyreltin. ph 7.4 (± 0.2) kontrol edin. Kimyasallar: asetonitril, HPLC grade metanol, HPLC grade asetik asit, 100% ultrapure deiyonize su dipotasyum hidrojenfosfat, >98% potasyum dihidrojenfosfat, >98% sodyum klorür Buharlaşma: nitrojen gazı 5.0 [Hava Likit M ] (IAC-elüatın buharlaşması için) 1L deiyonize su içinde çözün. Gerekirse 1N NaOH veya 1N HCI ile ph 7.2 (± 0.2)'e ayarlayın Consumerables: B-TeZ IAC Aflatoksin M1 3ml [BTAFM311005] Consumerables: Elüsyon Çözücü: Metanol Mycotoxin Standart: Aflatoksin M1 [ör. Biopure] Tutucu: Asetikasit/su (50/50 v/v): 10ml asetik asit ve 10ml deiyonize su karıştırın. Reaktif: dioksan/deiyonizesu içinde 32 ppm piridin hidrobromid perbromid (0.1/99.9, v/v): 1ml dioksan içinde kısmen 32 mg piridin hidrobromid perbromid çözün ve 1L gazı alınmış deiyonize su içine yağlı süspanse sıvı pipetleyin. İyice karıştırın. Postcolumn Türevlendirme : piridin hidrobromid perbromid, >95%. dioksan, 99.5% 4/5

5 Cihaz: HPLC; Shimadzu; pump: LC-6A (2 parça); otomatik örnekleyici: SIL 6B; floresan dedektör:rf- 10AXL; veri işleme: CLASS LC10 Buharlaştırıcı (tripod ile) [VLM EVA EC1-S] Vakum SPE Manifold (BAKER spe-24g Kolon İşlemci 24 örneğe kadar işleme ) [J.T. Baker 7208] BioTeZ Berlin-Buch GmbH 1 " TLC/HPLC TANIMLAMA İLE IMMUNOAFİNİTE KOLON CLEANUP İLE SÜTTE AFLATOKSİN M1" Luzia Shundo; Myrna Sabino, Brazilian Journal of Microbiology 2006, 37, /5

Benzer belgeler

B-TeZ IAC Aflatoksin 3ml kullanarak Temizleme Süreci talimatı

B-TeZ IAC Aflatoksin 3ml kullanarak Temizleme Süreci talimatı Immunoafinite Kromatografisi ile Aflatoksinler içeren Gıda ve Yem Örneklerinin Hammadde Özütlerinin Temizlenmesi ve Piridinyum perbromid kullanılarak Postcolumn türetilmesi ile sonraki HPLC Analizi Prensip: