MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II. ( WESTERN BLOTTING (WESTERN EMDİRİMİ) ve İMMÜNODETEKSİYON

Transkript

1 MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II ( WESTERN BLOTTING (WESTERN EMDİRİMİ) ve İMMÜNODETEKSİYON

2

3 Western blotting: Akrilamit jeldeki protein bantlarının daha kararlı ve sabit bir ortama (örneğin, nitroselüloz kağıda) aktarılması.

4 Western blotting Böylece jelde yürütülmesi mümkün olmayan ya da güç olan analitik teknikler uygulanabilir. Örneğin;; işaretli DNA veya RNA problar ile işaretleme, antikorlarla saptama, özel boyama yöntemleri uygulama, otoradyografi yöntemlerini uygulama gibi. Belirteçler membran yüzeyindeki proteinlerle daha kolay etkileşir. Böylece jelin içinde gömülü durumdayken saptanamayan, ancak membrana aktarıldıktan sonra yüzeyde toplanan çok az miktardaki proteinler bile kolaylıkla belirlenebilir. İşlemler daha az belirteçle daha kısa sürede gerçekleştirilir. Membran jele göre daha dayanıklı olduğundan uzun süre saklanabilir.

5 Yöntem genel olarak iki aşamadan oluşur: Birinci aşamada jel üzerindeki proteinler boyama yapılmaksızın membrana aktarılır. 2. aşamada hedeflenen proteine ÖZGÜ bir belirteçle(örneğin, spesifik bir antikorla) işlemle saptama yapılır.

6

7 Aktarımda çeşitli tipte membranlar kullanılır (ayrıntı için bkz. Tablo 7-1) Örneğin: Nitroselüloz, Polivinilidin diflorür (PVDF), Modifiye edilmiş naylon, Karboksimetilselüloz (CM) Uygulama temelde iki yöntemle yapılır: Pasif (kapiler) emdirim Elektro-emdirim (electroblotting)

8 PASİF EMDİRİM Membranla jel tam üstüste getirilerek filtre kağıtları arasında paketlenir.

9 Daha hızlı ve etkin olan bu yöntem iki farklı şekilde uygulanabilir. Tank aktarım sistemi (tank transfer veya wet blotting), Yarı-kuru emdirim (semi-dry blotting) ELEKTRO-EMDİRİM

10 TANK AKTARIM SİSTEMİ

11 Tank sisteminde;; aktarım jel-membran paketi aktarım tamponu ile dolu tanka dikey olarak yerleştirilir. Akım geçirilerek işlem tamamlanır.

12 Yarı-kuru sistemde elektrotlarla temas halindeki tamponla ıslatılmış filtre kağıtları arasına yerleştirilmiş jelmembran paketi yatay durumda iken akım geçirilir.

13 İMMÜNODETEKSİYON

14 Hedeflenen protein immünolojik etkileşimle saptanacaksa: Bu işlemden önce membrana aktarılmış proteinlerin bulunduğu yerler dışındaki boşlukların kapatılması gerekir. ( BLOCKING ) Çünkü hedeflenen proteine (antijene) özgü antikor da bir proteindir ve işlem sırasında antijeni yerine membrandaki boşluklara bağlanabilir. Bu amaçla en çok BSA, yağsız süt tozu, jelatin ve deterjanlar kullanılır. Membrana ve saptama yöntemine uygun kapatma ajanları için bkz. Tablo 7.12)

15 Saptamaya hazır hale getirilmiş membran: Önce hedeflenen proteine özgü birincil antikor (örneğin, IgG) ile işleme sokulur. Daha sonra enzim (örneğin, alkalin fosfataz (AP) veya yabanturpu peroksidazı (HRP) bağlı veya radyoaktif işaretli ikincil antikorla (anti-igg) işleme sokulur. Saptamanın son aşamasında antijen-antikor etkileşimienzim bağlı antikor kullanılmışsa enzimatik bir dönüşüm aracılığıyla, radyoaktif etiket kullanılmışsa ootoradyografik yöntemle belirlenir.

16 Enzim deneylerine örnekler: 5-Bromo-4-kloro-3-indolil fosfat + nitroblue tetrazolium (NBT) oks AP 5-Bromo-4-kloro-3-indol + Pi + NBT red 4-Kloro-1-naftol red + H 2 O 2 HRP 4-Kloro-1-naftol oks + H 2 O + 1/2O 2

17

18 Son yıllarda geliştirilmiş saptama yöntemleri duyarlılığı ~1000 kat artırmıştır. İkincil antikorlar substratları fotoğraf filmi üzerinde ışık sinyali (kemiluminesans) oluşturacak ürünlere dönüştüren enzimlerle işaretlenir. Ör., HRP bağlı ikincil antikor kemiluminesans substrat luminol ile reaksiyona sokulur.

19

20 Alternatif Saptama Yöntemleri I 125 ile işaretlenmiş ikincil antikorlar, otoradyografi ile, Fluoresanlı izotiyosiyanatla işaretlenmiş ikincil antikorlar, fluoresanın UV ışık altında gözlenmesiyle, Altınla kaplanmış ikincil antikorlarmembran üzerinde oluşan kırmızı rengin doğrudan gözlenmesiyle, Biotin (yumurta proteini avidin ile çok sıkı bağ oluşturabilen küçük bir vitamin) ile etiketlenmiş ikincil antikorlar, enzim bağlı avidinin belirlenmesiyle, İkincil antikor yerine kullanılan I 125 ile işaretlenmiş protein A (S. aureus tan izole edilen ve IgG lere özgün şekilde bağlanan bir protein), otoradyografi ile saptanabilir. Radyoaktif işaretli DNA, özellikle DNA bağlayan proteinlerin saptanmasında kullanılır.

21 Glikoproteinlerin saptanması

22 Membrana aktarılmış glikoproteinlerin saptanması Glikoproteinlerin karbohidrat kalıntılarına seçinimli şekilde bağlanan lektinlerden (bitkisel veya bakteriyel kaynaklı proteinler) yararlanılır. Örneğin, bitkisel bir lektin olan konkanavalin A (Con A) mannoz kalıntılarına özgül şekilde bağlanır. Con A HRP ile bağlı durumdadır. İşlem sonunda HRP substratı eklenir. HRP bağlı Con A nın bulunduğu yerlerde renkli ürün oluşumu gözlenir.

23 LEKTİN ARRAY Farklı şeker kalıntılarına özgü lektinlerin yanyana dizilmesinden oluşan çip örnekle bir dizi işleme sokulur, örnekte hangi glikoproteinlerin bulunduğu anlaşılır.

24