ENZİMATİK ANALİZ VE AKTİVİTE TAYİNLERİ

Transkript

1 ENZİMATİK ANALİZ VE AKTİVİTE TAYİNLERİ

2 Enzim Tanımı Sınıflandırma Üç Boyutlu Yapı Etkime Şekli

3 Enzimler biyolojik katalizörlerdir, yani biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran biyolojik kökenli maddelerdir. Hemen hemen tüm enzimler protein yapıdadır. Enzimlerin en önemli özellikleri: katalitik etkinlik, spesifiklik ve regülasyondur.

4 Katalitik etkinlik Enzimler reaksiyonları yaklaşık 1 milyon kat hızlandırırlar. Normalde biyolojik sistemlerde bu reaksiyonlar gerçekleşir, fakat çok daha yavaş bir şekilde Bilinen en hızlı enzim karbonik anhidraz saniyede 10 5 CO 2 molekülü bağlayabilir (dokulardan kana CO 2 taşır). Reaksiyonu 10 7 kat hızlandırır.

5 Spesifiklik

6 Regülasyon

7

8 SINIFLANDIRMA Bilinen tüm enzimler hem reaksiyon özgüllükleri hem de substrat özgüllükleri dikkate alınarak Enzim Komisyonu (E.C.) tarafından 6 Temel sınıfa ayrılmıştır. 1. Oksidoredüktazlar 2. Transferazlar 3. Hidrolazlar 4. Liyazlar 5. İzomerazlar 6. Ligazlar

9

10 Enzimler şu şekilde numaralandırılmaktadır: W X Y Z Wà 6 büyük sınıf X à Alt sınıflar Y à Alt-alt sınıf Z à Enzimin seri numarası Laktat dehidrogenaz ( ) Oksidoredüktaz CH-OH grubu NAD(P)+ Seri no elektron donörü elektron alıcısı

11 Üç boyutlu yapı? Üreaz (EC )

12 Her enzimin en yüksek aktivite gösterdiği bir optimum ph değeri vardır.

13 Her enzimin en yüksek aktivite gösterdiği bir optimum sıcaklık derecesi vardır.

14 GENEL REAKSİYON: Enzim (E), reaksiyonda değişikliğe uğrayacak madde(ler) (Substrat, S) ile reaksiyona girer, reaksiyon tamamlandığında ürün (Ü)(ler) oluşurken enzim tekrar ilk şekline döner. E + S D ES " Ü1 + Ü2 + E

15 Enzimlerin Varlıklarını Etkinliklerini Dokuda/hücrede bulundukları yeri Kataliz mekanizmasını Miktarlarını Saflıklarını belirlemenin en etkin yolu; AKTİVİTE ÖLÇÜMÜDÜR.

16 ENZİM AKTİVİTESİNİN ÖLÇÜLMESİ ve HESAPLANMASI Enzimlerin doku ve hücrelerdeki konsantrasyonu son derece düşük olduğundan miktarlarını ölçmek çok güçtür. En iyi ölçme yöntemi enzimin katalitik aktivitesini ölçmektir. UV- VIS ABSORPSİYON SPEKTROFOTOMETRİSİ FLUORESANS SPEKTROFOTOMETRİSİ RADYOAKTİF YÖNTEMLER

17 SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLERLE ENZİM AKTİVİTESİNİ ÖLÇMEK: Belli bir zaman aralığında enzimin kataliz etkinliği sonucu oluşan DEĞİŞİMİ saptamaktır. ÜRÜN OLUŞUMU SUBSTRAT EKSİLMESİ Enzim miktarı, genelde, enzim konsantrasyonu ile doğru orantılı olarak meydana gelen ürün miktarı ölçülerek saptanır.

18

19 Başlangıç Hızı "Initial rate": v o Aktivite ölçümü, henüz reaksiyon hızında bir düşmenin olmadığı kısa zaman aralığında yapılır.

20 Bu dönemde güvenilir bir ölçüm için: Enzim ve substrat derişimi reaksiyonun optimum hızda gerçekleşmesine yetecek şekilde ayarlanmalı, Sıcaklık kontrol altında tutulmalı, Ölçüm yapılan karışımın homojen olması sağlanmalı, Çok sağlıklı kör ve kontrol ölçümleri yapılmalıdır.

21 KÖR (BLANK) Çalışılan dalga boyundaki ışını absorplayacak maddeyi içermeyen reaksiyon ortamı KONTROL(LER) Reaksiyon ortamındaki etkinliği şüpheli olan bileşenler (ör. Koenzimler)

22 Reaksiyonun başında değişim DOĞRUSAL, sonra ürün oluşumunda meydana gelen azalma nedeniyle doğrusallık bozulur. NEDENLERİ: Substratın tükenmesi (Substrat bitince reaksiyon durur. Ölçüm sırasında bitmemesi için yüksek substrat konsantrasyonunda çalışılır.) İki yönlü reaksiyonlarda dengeye yaklaşılması (Reaksiyonun geri dönmesi ileüründen substrat oluşmaya başlar. Bunu önlemekiçin ürün ortamdan uzaklaştırılır. Ortama, ürünü substrat olarak kullanacak 2. bir enzim veya bağlayacakbir madde eklenir.)

23 Ürün İnhibisyonu (Ürün enzimi inhibe ediyorsa aktivite kaybolur. Bu nedenle ürün ortamdan uzaklaştırılır.) Enzimin veya reaksiyon bileşenlerinin (substrat, kofaktörler, aktivatörler, reaktifler) stabilitesini kaybetmesi (Her bir bileşenin stabilitesi ön deneylerle saptanmalıdır.) ph değişimi (Reaksiyon sırasında hızlı bir ph değişimi meydana geliyorsa bu da aktiviteyi hızla düşürür. Ortam çok iyi tamponlanmalı, reaksiyonun başında ve sonunda ph kontrolü yapılmalıdır.)

24

25 İŞLEMLER Spektrofotometre ölçümden dak önce çalıştırılır; çalışma ortamının sıcaklığı ayarlanır; doğru ve temiz küvetler seçilir. Reaksiyonu başlatacak bileşen hariç diğer tüm bileşenler küvete (çift ışınlı aletlerde her iki küvete) konulur. Alet sıfırlanır ("Auto- Zero"). Reaksiyonu başlatacak bileşen eklenir ve etkin bir şekilde karışması sağlanarak ölçümyapılır.

26 TEKNİK OLARAK DİKKAT EDİLECEK NOKTALAR Yüksek K m değeri söz konusu ise aktivite ölçümünde substrat konsantrasyonu yüksek tutulmalıdır. Olanaklar el verdiğiölçüdesaf enzimleçalışmakta yarar vardır. Çözelti şeklinde saklanan enzimlerde zamanla aktivite kaybı olacağı unutulmamalıdır. Liyofilize haldesaklamak daha elverişlidir. Ölçümlerde kullanılan kimyasalların saf olması şarttır. Kalite ne kadar yüksek olursa, hata payı o kadar azalır. Cam eşyaların temiz olması, deterjan artığı bulunmaması, saf suyun yüksek kalitede olmasına özen gösterilmelidir. Reaksiyon karışımına katılacak maddelerin ph'ları elverişli olmalıdır.

27 ENZİM AKTİVİTESİNİN HESAPLANMASI: Birimler ve Spesifik Aktivite Absorpsiyon (Ekstinksiyon) Katsayısı Spektrofotometrik ölçümün dayandığı Beer- Lambert yasasına göre Absorbans (A; ya da Optik Dansite, O.D.), absorpsiyon yapan maddenin derişimi (c) ve ışının katettiği yol (d) ile doğru orantılıdır: A=ε λ cd Buna göre: c = A ε λ d c = A ε λ 1 cm old.

28 A=ε λ cd 1 M 1 cm Derişimi 1 M olan bir kromoforun ışık yolu 1 cm olan bir spektrofotometrede ortaya koyduğu absorbans Molar Absorpsiyon (Ekstinksiyon) Katsayısı (ε λ ) olarak tanımlanır. Birimi M - 1 cm - 1 'dir. (lmol - 1 cm - 1 veya mmol - 1 cm 2 'ye eşdeğerdir) cm 2 mol - 1 (M - 1 cm - 1 'in 1000 katı) olarak da ifade edilir

29 Bu durumda hesaplanan derişimin (c'nin) birimi M (mol/l)'dır.

30 Enzim Aktivitesinin Tanımlanması Bir enzimin aktivitesini çeşitli biçimlerde ifade etmek mümkündür: Örneğin, Birim zamanda enzim tarafından meydana getirilen absorbans değişimi: (da/dt) Ancak daha standart bir birim olan ÜNİTE (U; "International Unit", IU) daha geniş kullanım alanı bulur. Buna göre 1 Ünite Enzim, 1 dakikada 1 µmol ürünün oluşumunu (veya 1 µmol substratın dönüşümünü) katalizleyen enzim miktarıdır (U= µmol /dak).

31 Deneysel Ölçümlerin Üniteye Dönüştürülmesi Örnekteki Enzim Ünitesi = V t x da/dt x 1000 x sulandırma faktörü ε λ v s x d V t = Reaksiyonkarışımınıntoplam hacmi (ml) da/dt = dakikada Absorbansdeğişimi (dak - 1 ) ε λ = Absorpsiyonkatsayısı(cm 2 mol - 1 ) V s = Reaksiyonortamına katılan örnek (enzim) hacmi (ml) D = küvettekiışık yolu (genellikle 1 cm) 1000 çarpanı enzimi µmole çevirmek içindir.

32 SPESİFİK AKTİVİTE = U/mg protein Saf bir enzimin spesifik aktivitesi sabittir ve o enzime özgü bir değerdir. Bu aktivite birimi, enzimin saflığını tanımlayan bir ölçüttür. Ham özütlerde protein derişimi yüksektir. Dolayısıyla ilgilenilen enzimin spesifik aktivitesi DÜŞÜK çıkar. Enzimi SAFLAŞTIRDIKÇA spesifik aktivitesi YÜKSELİR.

33