GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ-2

Transkript

1 DNA nın replikasyonu GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ DNA Replikasyonu (DNA çoğalması, DNA ikileşmesi, DNA sentezi) Bir hücrenin bölünebilmesi için DNA nın da çoğalması gerekir. DNA replikasyon mekanizmasının anahtarı, DNA ikili sarmalındaki iki ipliğin de aynı bilgiyi taşımasıdır (birbirleriyle komplementer olmaları). Böylece oluşan iki yavru hücre de aynı DNA ya sahip olur. Replikasyon sırasında iki atasal iplik ayrılır, tamamlayıcı yavru ipliklerin oluşmasında kalıp (template) olarak görev yapar. Daha sonra oluşan yeni çift zincirli DNA moleküllerin bölünme sırasında iki yavru hücreye geçer. Yavru (Yeni) iplik Atasal (eski) iplik Yavru (Yeni) iplik 3 4 Bu yüzden DNA nın replikasyonu yarı korunumludur (semikonservatif). Yani oluşan ikili sarmalin zincirlerinden biri yeni sentezlenen zincirken, diğeri eski var olan zincirdir. Replikasyonun aşamaları 1) replikasyon orijinine özel başlangıç proteinlerinin bağlanması Replikasyon orijini: replikasyonun başladığı genomdaki sabit bir noktadır. Prokaryotlarda OriC (E.coli) olarak bilinir. Replikasyon orijini özel başlangıç proteinleri (dnaa) tarafından tanınan ve yaklaşık 300 bazlık özel bir diziden oluşur.(e.coli de 245 bazdır). Replikasyon orijini AT zengin bölgelerdir. Böylece zincirlerin ayrılması daha kolay olur

2 Prokaryotlarda tek bir replikasyon orijini vardır. Ökaryotlarda çok fazla orijin bulunmaktadır Replikon: tek bir orijinden başlayıp sentezlenen DNA ya replikon denir (insan genomumda orijin bulunmaktadır) Mayalarda arasındadır.. Replikasyonun ilk aşamasında Orijin bağlama proteinleri (dnaa) orijine bağlanır ve kompleksi açmak için erimeyi gerçekleştirir. Bu bağlanma daha sonra zincirin açılmasını kolaylaştırır ) Çift zincirin açılması dnaa orijine bağlandıktan sonra helikaz enzimi (dnab) çift sarmaldaki H bağlarını kırarak zinciri açar ve replikasyon çatalı oluşur. Genellikle orijinden itibaren iki replikasyon çatalı çift yönlü olarak çalışır ve iplikler terminale ulaşıncaya kadar ayrı ayrı kopyalanır. Replikasyon çatalı: İpliklerin ayrıldığı ve yeni DNA sentezinin gerçekleştiği noktaya replikasyon çatalı denir. Replikasyon çatalı DNA replikasyonu E.coli hücrelerinde açığa kavuşturulduğundan, Replikasyon için E. Coli örnek oluşturmaktadır. Ökaryotlarda replikasyon çok daha karmaşık olmakla birlikte temelde bakteriyel DNA replikasyonuna benzer Replikasyon süresince helikaz DNA üzerinde ilerleyerek sürekli olarak ikili zinciri açar. Helikaz sarmalın çözülmesini çok hızlı gerçekleştirir. Helikaz ile çift zincir açıldıktan sonra, tek iplikler üzerine tek iplik bağlama proteinleri (ssb) bağlanarak ipliklerin yeniden birleşmesini (renatürasyonunu) önlerler. 3) RNA primer sentezi Yeni DNA sentezinde nükleotitlerin eklenmesini (zincirin uzamasını) sağlayan enzim DNA polimerazdır. Bütün bilinen DNA polimerazlar deoksirobozun 3 OH grubuna nükleotit ekleyebilirler. Bu nedenle DNA nın replikasyonu daima 5-3 yönünde olur. Zincir açıldıkça oluşan süpersarmal yapı topoizomerazlar (DNA giraz)tarafından giderilir

3 Ancak hiçbir DNA polimeraz DNA sentezini başlatamaz. Bu enzim sadece daha önce var olan 3 -OH grubuna nükleotit ekleyebilir. Bu nedenle yeni DNA zincirinin başlayabilmesi için mutlaka önce primer sentezlenmesi gerekir. Helikaz enzimi ile çift zincir açılır açılmaz primaz enzimi replikasyon çatalının hemen başında yerini alır ve gerektikçe primer sentezler. Primer eklendikten sonradna polimeraz sentezi sürdürür. Primer: nükleotit dizisinden oluşmuş kısa bir RNA parçacığıdır ve özel bir RNA polimeraz olan primaz enzimi tarafından sentezlenir. Daha sonra zincirin uzaması DNA polimeraz tarafından gerçekleştirilir ) Zincirin uzaması Replikasyon çatalında yer alan helikaz ve primaz enzimlerinin ardından açılan her iki polinükleotit kalıbına yerleşen DNA polimeraz enzimi sentezi her iki zincir de de sürdürür. DNA polimeraz yeni DNA zincirini yalnızca 5-3 yönünde gerçekleştirir. Ancak, kalıp DNA zincirlerinin antiparaleldir (zincirin biri 5-3, diğeri 3-5 yönünde) 3-5 yönündeki sentez mekanizması Okazaki tarafından çözülmüştür Okazaki DNA sentezinde bir zincirdeki sentezin 5-3 yönünde sürekli devam ettiğini karşı zincirde ise kesikli sentezin gerçekleştiğini belirlemiştir. Açılan kalıp DNA zincirlerinde sadece birinde komplementer polinükleotit sentezi sürekli olur. Her zaman yeni bir nükleotitin ekleneceği serbest bir 3 -OH grubu olduğundan kesiksiz olarak DNA sentezi gerçekleşir. Diğer zincirde ise ters yönde ve kesikli ve kısa zincirler halinde sentez gerçekleşir. Bu durumda DNA polimeraz ters zincirdeki sentezi diğeri ile aynı anda nasıl gerçekleştirir? DNA sentezinin kesintisiz sürdüğü zincire kesintisiz DNA zinciri (leading strand), diğerine ise kesintili DNA zinciri (lagging strand) denir. Kesikli zincirde zincir uzaması replikasyon çatalına ters yönde olur. Kesintisiz DNA zinciri tek bir primer kullanarak ve başlangıç noktasından başlayarak 5-3 yönünde replikasyon çatalının açılma yönünde sentezi sürdürür. Kesintili zincirde ters yönde herbiri ayrı primer gerektiren nükleotitlik fragmanlar sentezlenir ve bunlar birbirine eklenir. Bu nükleotit fragmanlarına Okazaki fragmanları denir. Kesikli zincirde primaz tarafından defalarca RNA primerleri sentezlenerek serbest 3 -OH grubunun oluşmasını sağlarlar. Bunun aksine kesiksiz zincire sadece başlangıç yerinde olmak üzere bir defa primer eklenir

4 E. Coli de 3 tip DNA polimeraz belirlenmiştir. DNA polimerazlar: Nükleotitlerin eklenmesini katalizleyen enzim. Bilinen bütün DNA polimerazlar DNA yı 5-3 yönünde sentezler. Zincirdeki her yeni nükleotitin öncüsü bir deoksiribonükleotit trifosfatdır (dntp) dntp: datp, dttp, dgtp, dctp, dntp lerin iki terminal fosfatı uzaklaştırılır, ve internal fosfat büyüyen zincirin deoksibozunun 3 -OH grubuna bağlanır. DNA polimeraz I (Pol I): Birden fazla aktiviteye sahiptir. RNA primerlerini uzaklaştırıcı 5-3 ekzonükleaz aktivitesi (bu özellik sadece bu enzimde vardır) DNA sentezi kesintili zincirde kalan boşlukları tamamlar. Daha önce oluşmuş olan RNA primerlerini uzaklaştırır ve yeni sentez yapar. Hücredeki konsantrasyonu DNA pol lll den daha fazla DNA pol l: 400 mol/hücre DNA pol lll: mol/hücre DNA polimeraz II (Pol ll): görevi henüz olarak bilinmiyor. Ancak çeşitli çevresel faktörlerle (UV ışık, kimyasallar vs) oluşan DNA tamirinde kullanıldığı düşünülüyor. Bu onarımlar DNA replikasyonu tamamlandıktan sonra yapılır. DNA polimeraz III (Pol lll): Her iki zincirde de replikasyonu gerçekleştiren ana enzimdir. Polimerazlar Kofaktör olarak Mg iyonlarına gereksinim duyarlar Ayrıca her 3 DNA polimerazın da 3-5 ekzonükleaz aktivitesi vardır. Polimerizasyon sırasında yanlış bir nükleotitin zincire eklenmesi durumunda, kalıp DNA da bu bazın tamamlayıcısı olmayacaktır. Bu hatanın düzeltilmesi için geriye dönüp bu nükleotitin çıkarılması ve ve yerine doğrusunun bağlanması gerekir. Her 3 polimeraz da 3-5 ekzonükleaz aktiviteleri ile bu düzeltmeyi (proofreading) yapabilmektedirler. Hata düzeltme fonksiyonu sayesinde replikasyondaki hata oranı milyarda 1 dir Kesikli zincirde Pol lll daha önce sentezlenen DNA ya ulaşıncaya kadar sentez yapar. Bu noktada Pol lll durur. Sentezde rol alan bir sonraki enzim olan DNA polimeraz l, önce, RNA primerlerini uzaklaştırır ve bunların yerini DNA ile doldurur. DNA ligaz bazların 5 fosfat uçları ile 3 OH uçlarını birleştirirek ayrı ayrı oluşan DNA parçalarını fosfodiester bağları ile birleştirir. DNA ligaz DNA parçalarını birleştirebilen tek enzimdir. Son fosfodiester bağı ise DNA ligaz ile yapılır

5 5) Terminasyon ve ayrılma İki replikasyon çatalı oric nin yaklaşık 180 karşısındaki bölgede buluşur. Bu bölgede Helikazı durduran tus gen ürününün bağlandığı bir sonlanma noktası vardır. Replikasyon tamamlandığında iki halka birbirine bağlı olarak kalmaktadır. Bunlar bir topoizomeraz olan topoizomeraz IV aracılığıyla birbirinden ayrılır ve daha sonra membran tutunma yerlerinin bir kısmıyla hareket ederek iki yavru hücreye ayrılırlar 25 ÖZET DNA replikasyonundaki enzimler DNA nın replikasyonunda çok sayıda protein yer alır. Bunların hepsine DNA replikaz sistemi veya replizom denir Orijin bağlama proteinleri: replikasyon orijinine bağlanarak ilk denatürasyonu gerçekleştirir. Helikaz :Replikasyonun başlaması için ikili sarmalı ayrılmasını sağlayan enzimler Topoizomerazlar: Zincir ayrılması ile oluşan kıvrımları giderir. Tek zincir bağlama proteinleri: Ayrılmış zincirler tek zincir bağlama proteinleri (ssb) ile stabilize edilir. Primazlar, RNA parçacıkları olan primerleri sentezler. DNA polimeraz III 5-3 OH yönünde dntp leri ekleyerek sentezi gerçekleştirir. DNA polimeraz l primerleri çıkararak boşlukları yeni DNA ile doldurur DNA ligaz: RNA primeri çıkarılıp yeni DNA sentezi yapıldıktan sonra boşluğu kapatır. 26 Özet Replikasyon orijinine orijin bağlama proteinleri bağlarak bu bölgeyi denatüre eder. Helikaz enzimi zinciri iki yönlü olarak açarak replikasyon çatalları oluşturur. Zincir bağlama proteinleri her iki zincire de tutunarak zincirin tekrar birleşmesini önler DNA primaz enzimi her iki zincir üzerinde de primerleri sentezler. DNA pol lll 5-3 yönünde dntpleri zincire ekleyerek sentezi gerçekleştirir. Ters yönde olan zincirde ise replikasyonda ters yönde gerçekleşir. Burada primer bazda bir yeni primer sentezlenerek Pol lll Okazaki fragmentlerinin sentezini yapar. DNA Pol I sentezlenen primerleri zincirden uzaklaştırır ve yerine DNA sentezler. Son nükleotitler arasındaki boşluk DNA ligaz ile kapatılır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) (DNA nın in vitro çoğaltılması) Hücrede doğal olarak (in vivo)gerçekleşen replikasyon, in vitro koşullarda da (hücre dışında) yapılabilmektedir. İn vitro koşullarda DNA çoğaltılmasının nedenlerinden başlıcaları: - özgün bir DNA parçasının bol miktarda elde edilmesi, moleküler analizinin yapılması -Genetik mühendisliği amaçları doğrultusunda rekombinant organizmalar elde edilmesi gibi PCR ile istenilen genlerin ya da DNA dizilerinin replikasyonu hızlandırılmış bir şekilde gerçekleştirilir. Doğal hücre bölünmesinde olduğu gibi, PCR replikasyon sürecini taklit ederek yaklaşık 30 jenerasyon sonra seçilmiş bir DNA dizisinin yaklaşık milyar katını elde edebilir

6 Polimeraz zincir reaksiyonunun oluşum mekanizması Polimeraz zincir reaksiyonu spesifik bir DNA parçasının kopyalarının primerler tarafından yönlendirilerek, enzimatik olarak sentezlenmesine dayanan bir yöntemdir yılında Cetus (Kary Millus) firması araştırıcıları tarafından geliştirilmiş ardından temel moleküler biyolojik araştırmalarda (klonlama, dizi analizi, DNA haritalaması gibi) ve birçok hastalığın DNA temeline dayalı tanısı için de klinik tıpta hızla kullanılmaya başlanmıştır. PCR, çift iplikli bir DNA molekülünde hedef zincirlere iki oligonükleotit primerin bağlanması ve uzaması esasına dayanır. Kalıp DNA molekülleri yüksek sıcaklıklarda denatüre edildikten sonra, primerler tek iplikli DNA molekülleri üzerinde kendilerine tamamlayıcı olan bölgelerle düşük sıcaklıklarda birleşir. DNA polimeraz enzimi, uygun tampon ve 4 çeşit deoksiribonükleotit trifosfat (dntp) varlığında primerin 3 OH ucundan uzamasını sağlar. Böylece kalıp DNA ipliğine tamamlayıcı olan yeni DNA molekülü sentezlenmiş olur PCR ın temel bileşenleri Kalıp DNA olarak kullanılan DNA molekülü DNA polimeraz enzimi Primerler dntp karışımı Tampon ve MgCl2 Kalıp DNA: Çoğaltılacak olan DNA saf bir şekilde hücreden izole edilir 1) Hücrenin parçalanması ile yüksek molekül ağırlıklı DNA nın açığa çıkması, 2-Denatürasyon veya proteoliz ile DNA-protein kompleksinin ayrılması ve DNA nın çözünür duruma getirilmesi, 3-DNA nın basit enzimatik ve/veya kimyasal yöntemlerle proteinler, RNA ve diğer makromoleküllerden ayrılması, Hücre membranının parçalanması Membran lipitlerinin ayrılması Hücre içi ve DNA ya bağlı proteinlerin uzaklaştırılması Fiziksel, kimyasal ve enzimatik yolla SDS (sodium dodesil sülfat) CTAB (setiltrimetil bromid gibi deterjanlar ile Proteinaz Primerler: DNA nı çoğaltılması için kalıp DNA ya tamamen tamamlayıcı olan primere gereksinim vardır. Primerler laboratuvarlarda oluşturulan kısa zincirli DNA molekülleridir nükleotit uzunluğundadırlar. DNA nın çöktürülmesi Soğuk etanol veya isopropanol ile

7 Polimerazlar Genellikle Thermoccus aquaticus tan izole edilen Taq DNA polimeraz kullanılır. Bu enzim DNA nın denatürayon sıcaklığında (95 C) aktivitesini koruyabilmektedir. dntp (deoksiribonükleotit trifosfat) karışımı datp, dgtp, dttp, dctp Yüksek saflıkta ticari olarak tek tek veya karışım halinde sağlanır. Tamponlar ve MgCl 2 Enzime özgü tamponlar kullanılır (Genellikle KCl ve Tris HCl içeren tamponlar) MgCl 2 tamponla birlikte veya ayrı olarak sağlanabilir. MgCl 2 ün PCR ın verimi üzerine önemli etkisi vardır. Mg +2 iyonları dntp ler ile çözünebilir kompleksler oluşturur Polimeraz aktivitesini stimüle ederler Primer kalıp etkileşimi sağlarlar PCR ın yapılışı PCR aletleri (thermal cycler) PCR farklı sıcaklık derecelerini istenilen sürelerde otomatik olarak ayarlayabilen özel aletlerde gerçekleştirilir. İşlem mikrotüpler içinde yapılır PCR aletlerinde DNA nın çoğaltılması 3 aşamada gerçekleşir 1) denatürasyon (92-95 C/1-2 dak) 2) primerlerin bağlanması (annealing) (50-55 C/1-2 dak) 3) zincirin uzaması (72 C/1-2dak) Bu süre ve sıcaklıklar peşpeşe uygulanarak döngü olarak gerçekleştirilir Bu işlem kez tekrarlanır (döngü) PCR ın kullanım alanları PCR kullanımı kolay, oldukça duyarlı, özgün ve yüksek derecede verimlidir. Koşullar iyi optimize edilmişse hemen hemen hiç yanlış baz eşleşmesi olmaz. Gen klonlaması ve dizi analizleri için oldukça kullanışlıdır. Gen bölgeleri bilindiğinde istenilen gen veya genler kolaylıkla çoğlatılabilir. PCR aynı zamanda farklı kaynaklardan olan genleri çoğaltarak karşılaştırmalı veya filogenetik çalışmalarda kullanılır

8 Çok duyarlı bir teknik olduğundan çok küçük miktarlardaki DNA yı çoğaltmak için de kullanılır. Örn: mumyalanmış insan kalıntıları ve fosilleşmiş bitki ve hayvanlardan elde edilen DNA ları çoğaltmak için kullanılmaktadır. Bireylerin tanımlanmasını veya bireyler arasındaki ilişkiyi küçük bir miktar DNA örneğinden belirlemede kullanılan güçlü bir adli tıp aracı olan DNA parmak izinde de kullanılmaktadır. Genetik hastalıkların teşhisi GDO lu ürünlerin tespiti 43 8