Köpeklerde Taenia hydatigena enfeksiyonunun indirekt floresan antikor testi (IFAT) ve enzyme linked immunosorbent assay (ELIS'A) yöntemi ile teşhisi*

Transkript

1 l Ankara Ünv Vet Fak Derg, 51, ,2004 Köpeklerde Taena hydatgena enfeksyonunun ndrekt floresan antkor test (IFAT) ve enzyme lnked mmunosorbent assay (ELIS'A) yöntem le teşhs* Esma KOZAN!, Ayşe BURGU2 1 Afyon Kocatepe Ünverstes,Veterner Fakültes, Paraztoloj Anablm Dalı, Afyon 2 Ankara Ünverstes,Veterner Fakültes, Paraztoloj Anablm Dalı, Ankara Özet: Bu çalışmada Taeııa hydatgena olgunlarından hazırlanan antjenler kullanılarak köpeklerde T. hydatgena enfeksyonunun erken teşhsnde IFAT ve ELlSA yöntemlernn geçerllğnn araştırılması amaçlanmıştır. İk aylık köpeklerden enfeksyon (6 köpek) ve kontrol (3 köpek) olmak üzere k grup oluşturulmuştur. Enfeksyon grubundak köpekler, Cystcercus fenucolls kstler (5-7adet) yedrlerek enfekte edlmştr. Her k gruptan çalışma öncesnden başlanarak, çalışma süresnce her hafta kan ve dışkı örnekler alınmıştır. Enfeksyon grubunda köpeklern tümü dışkılarında halkalar görüldükten sonra, nekrops yapılarak bağırsaklarında bulunan T.hydafgeııa 'lar toplanmıştır. IFAT çn T. hydatgena halkalarından kest antjen, ELlSA çn somatk antjen hazırlanarak serum örnekler k yöntemle test edlmştr. IFAT'da, lk poztf reaksyonlar enfeksyondan 2 hafta sonra gözlenmş, en yüksek antkor ttreler haftalarda tespt edlmş, enfeksyon grubundak köpeklern serumlarının yüksek sulandırmalarda ble poztf reaksyon verdğ, ancak düşük sulandırmalarda kontrol grubundak köpeklern serumlarının da yanlış poztf reaksyonlar verdğ gözlenmştr. ELlSA'da lk poztf reaksyonlar, enfeksyondan 3 hafta sonra gözlenmştr. Genelde antkor ttreler düşük düzeylerde tespt edlmştr. Enfeksyon ve kontrol grubundan elde edlen verlern, statstksel analznde, gruplar arasındak farklılığın statstksel açıdan öneml olduğu saptanmıştır (p<0,05). Kontrol grubunda köpeklern hçbrnde yanlış poztf reaksyon gözlenmemştr. Köpeklerde T. hydafgena enfeksyonunun teşhsnde, lfat'ın daha spesfk testlerle desteklenmes, ELlSA çn purfye antjenlern kullanılması gerektğ belrlenmştr. Anahtar kelmeler: ELISA, lfat, köpek, Taena hydatgena, teşhs Dagnoss of Taena hydatgena n dogs wth ndrect fluorescence antbody test (IF AT) and enzyme Inked mmunosorbent assay (ELISA) Summary: In ths study, t was amed to research the valdty of lfat and ELlSA methods on dogs for early dagnoss of Taeııa hydatgeııa nfecton by usng mature T. hydatgena antgens. From two month-old puppes, two groups of dogs were establshed as an nfecton (6 dogs) and control (3 dogs) groups. The dogs, n nfecton group, were nfected wth Cystcercus teııucolls cysts (wth 5-7) by oral route. Before and durng the study, blood and fecal samples were collected every week from both groups. After T. hydatgena proglottd had been seen n the faeces of all dogs, n the nfecton group, T. hydatgena parastes were collected from smal ntestnes of these dogs necropsed. Cross-secton antgen of T. hydatgeııa proglottd was prepared for [FAT, and somatc antgen was prepared for ELISA, and all serum samples were tested by both methods. By IFAT method, frst postve reactons were observed two week s after the nfecton. The hghest antbody ttres were found n 8th- 12th week, blood sera of the dogs n nfecton group have gven postve reacton at even hgh dlutons, but at low dlutons, blood sera of the dogs n control groups have gven false postve reactons. By ELlSA method, frst postve reactons were observed after 3 weeks from the nfecton. [n general, although antbody ttres were found at low Ievels, n the datum obtaned from the nfecton and the control groups, the dfference between n two groups were found to be statstcally sgnfcant (p<0.05). False postve reacton has not been observed n the dogs of control groups. It has been found that IFAT should be supported wth more specfed tests n the dagnoss of T. hydatgeııa n dogs and for ELlSA, prufed antbody should be used. Key words: Dagnoss, Dog, ELlSA, IFAT, Taeııa hydatgeııa Grş Taeııa hydatgena başta köpek olmak üzere kurt, çakal, tlk gb kamvararın nce bağırsaklarında yaşamaktadır. Taena cns sestod enfeksyonlarının son konaklarda teşhs, genellkle arecolne hydrobromde kullanılarak veya doğrudan hayvanlardan elde edlen dışkıların makroskobk ve mkroskobk olarak ncelenmes le yapılmaktadır. Arecolne hydrobromde kul- lanılması zaman alıcı olduğu gb bazı köpeklerde yan etklere neden olablr. Mkroskobk muayene yöntemler kolay, hızlı sonuç veren, ucuz yöntemlerdr. Ancak, taena yumurtalarının morfolojk olarak ışık mkroskobu le ayrımları mümkün değldr (ll). Bu nedenle son yıllarda köpeklerde taena cns sestodların teşhsnde alternatf teknkler gelştrlmştr (3,4,1 I). Türkye'de köpeklerde oldukça yaygın olduğu bldrlen (1,5,21) * Aynı başlıklı doktora teznden özetlenmştr

2 128 T. hydatgena'nın larvası olan Cystcercus tenucolls'e se kesm sırasında sıklıkla rastlanmakta olup, karacğer göçler dönemnde öneml ekonomk kayıplar meydana getrmektedr (2,17,22). Köpek paraztler üzernde yapılan çalışmalar, genellkle zoonoz özellğ gösterenler üzernde yoğunlaşmış olup T. hydatgena le lgl çalışmalar oldukça sınırlıdır. Taena hydatgena gb sonkonakda öneml br etk oluşturmayan, ancak arakonak canlılarda hastalıklara yol açablen paraztler üzernde fazla araştırma yapılmamış olması ger kalmış ve gelşmekte olan ülkelerde olayın ekonomk boyut potansyel nedenyle eksklktr. Bu çalışmada T. hydatgena olgunlarından hazırlanan antjenler kullanılarak köpeklerde enfeksyonun erken teşhsnde (halkalar atılmaya başlamadan önce) IF AT ve ELISA yöntemlernn geçerllğnn araştırılması amaçlanmıştır. Materyal ve Metot Bu çalışmada, 2 aylık sokak köpeklernden 6 köpek ( erkek 5 dş) enfeksyon grubu ve 3 köpek (heps erkek) kontrol grubu olarak ayrılmıştır. Çalışmaya başlamadan önce, her k gruptak hayvanlar helmntolojk açıdan muayene edlmş ve oluşablecek çapraz reaksyon rskn ortadan kaldırılmak amacıyla, antelmentklerle (m. 0,2 mg/kg Vlmectn-VİLSAN kullanımından 3 gün sonra oral 5 mg/kg Paratak Plus Topkm-TOP- KAPI) sağaltılmıştır. Sağatırnın etkl olup olmadığını gözlernek açısından laç uygulanmasından 1 hafta sonra tüm köpeklern dışkı bakıları tekrarlanmış, negatf bulunan köpeklere uygulanan laçların etk sürelernn sona ermes çn 3 hafta beklenerek, Ankara'nın Kazan İlçes Beledye Mezbahası 'nda keslen koyunlardan elde edlen C. tenucolls'ler canlılık kontroller yapıldıktan sonra enfeksyon grubundak köpeklerden 5'ne 5'er, kstlern küçük olması sebebyle 'ne 7 adet kıyma çnde yedrlerek enfeksyon oluşturulmuştur. Enfeksyon grubundak tüm köpekler n dışkılarında T. hydatgena halkaları görüldükten 3 hafta sonra köpeklern nekropss yapılmış, olgun paraztler toplanmıştır. Enfeksyon grubundak köpeklere kstlern yedrlmesnden hafta önce başlanarak, çalışma süresnce her hafta tüm hayvanlardan düzenl olarak kan ve dışkı örnekler alınmıştır. Kan örneklernden serumlar çıkarılmış, çalışmada kullanılmak üzere -20 C'de muhafaza edlmştr. Dışkı örnekler se alındıkları gün ncelenmştr. Çalışma süresnce gruplardak hayvan sayıları, hayvanların bakım ve beslenmes, çalışmaya alınmaları ve çıkarılmaları, çalışma süresnce yapılacak şlemler Ankara Ünverstes Veterner Fakültes tarh ve 12 nolu Etk Kurul Kararı le Deney Hayvanları Yönetmelğ Krterlerne göre yapılmıştır. Nekrops sonucu elde edlen paraztlerden IFAT çn kest antjen, ELISA çn somatk antjen hazırlanmış ve serumlar IFAT (16) ve Gasser'n öner- Esma Kozan - Ayşe Burgu lerne uygun olarak (kşsel görüşme) ELISA yöntemyle ncelenmştr. I. ;.. Çalışmada lfa T son uçlarının ıstatıstıksel değerlendrmesnde geometrk ortaıamalar, ELI~A yöntemnde, çeştl haftalarda enfeksydn ve kontroııgrupıarı arasındak farklılıkların karşılaştı~ılmasında, "Mann- Whtney U Test" kullanılmıştır. Bnfeksyon gı'-ubunda, enfeksyon önces hafta le dğer haftalar arasın(,aak kl karşılaştırmalarda, "Wlcoxon Eşıbştrlmş İWj Örnek Test"nden yararlanılmıştır. ELISA referans te~t olarak kullanılıp, IFAT'ın senstvle ve s1\esftes belrlenmştr. : Bulgular Çalışma öncesnde enfeksyoli ve kontrol ~rubunda bulunan köpekler n dlşkl yokl~masında 6 köpeğn dışkısında Toxocara can s yumurtası tespt e(hlmesne rağmen, antelmentk uygulamasından sonra dış'kı yoklamalarında, hçbr parazt veya geldme dönemde rastlanmamıştır. Enfeksyon grubundakl köpeklern prepatent süreler ve nekrops sonuçları Tablo 1'de verlı.l1ştr. IF AT' da gebe halkalardad yapılan kestlerde, uteruslar le yumurta ve tests hücrelernn parlak sarımtrak-yeşl renk verdğ durumlar poztf LI (ŞekII) olarak, kırll11z1 veya mat gr rjnk verdğ. durumlar negatf (Şekl 2) olarak değerlendhlmştr. Köbeklerden alınan kan örneklernn IFAT le rermş oldu*ları reaksyonlar ve geometrk ortalamaları Tablo 2'de verlmştr. : Tablo I. Enfeksyon grubunda prep~tent süreler,lenekrops sonuçları. Table I. Prepatent perods and results of necropsy lnnfecton group! Köpek no Prepatent süre (Hafta) yedjlen C.teı\ucolls sayısı II 7 4! : Neı~opsde eld\~edlen T.h~daıgena sayıısı ELISA'da negatf kontrol Jerumunun 4~2 nm'dek absorbans değer 0,076, standart Isapması (SD;) da 0,0062 olarak saptanmıştır. Eşk değer I(cut-off) neg.atfkontroı serumunun absorbans değerne 2 SD ekıerterek 0,088 olarak belrlenmştr. Enfeksyon ve kontrel grubunda ELISA ortalamaları ve standart sapmaları Şe/<j]3 ve 4'te verlmştr. Enfeksyon grubu lle kontrol Igrubundak köpeklerden elde edlen verlern statstkse,! analznde gruplar arasında enfeksyondah sonrak Ük haftadan tbaren çalışma sonuna kadar ahlamlı br fa~klılık tespt edlmştr (p<0,05). Enfeksyoh grubundak~ köpeklern enfeksyon önces hafta le dğe~ haftalar ardsındak kl karşılaştırmalarında statstk~el olarak :a. haftadan

3 Ankara Ünv Vet Fak Derg, 51, Tablo 2. Köpeklerden alınan kan örneklernn IFAT le vermş oldukları reaksyonlar ve geometrk ortalamaları. Table 2. The reactons and geometrcal mean of the blood samples collected from dogs by IFAT Haftalar Enfekte köpek no GO Kontrol köpek no GO E.Ö. E /2 1/2 1/2 1/2 3 1/4 1/4 1/8 1/ /5 1/4 1/4 4 1/8 1/ / / /8 1/ /32 1/20 1/2 1/2 6 1/ / /32 1/64 1/45 1/2 1/ /32 1/64 1/ / /256 1/128 1/128 1/ /256 1/ ]/256 1/256 ]/256 1/ /181 1/2 1/2 LO /256 1/256 1/256 1/64 1/ /256 1/64 1/256 1/ / / / /32 1/128 1/ /32 1/32 1/32 1/256 1/] / /2 1/ / /32 1/8 1/16 1/16 S 1/8 1/8 1/16 1/32 1/8 1/8 1/11 1/2 112 E.Ö. : Enfeksyon önces, E: Enfeksyon haftası, GO: Geometrk ortalama Şekl 2.!FAT'da negatfteaksyon. Fh'Ure 2.Negatve ceacton wth IF AT ~ 0.13 o> 0.12 ~ 0.11 Ô 0,10 Q. 0, ,05 0,05 0, , E.b. E Hafta ŞekII. lfa T' da poztf reaksyon. Fgure 1.Postve reacton wth IFAT Şekl 3. Enfeksyon grubunda ELlSA ortalamaları ve standart sapmalar. Fgure 3.The mean valuc of ELlSA and standard devatans n nfecton group E 0.13 c.0.12 N o> 0.11 ~ o :;; O.OB ~ 0.07 'C> ~ "' c ol e ~ 0.03.o « E.c. E Hafta Şekl 2. lfa T'da negatf reaksyon. Fgure 2.Negatve reacton wth IFAT Şekl 4. Kontrol grubunda ELlSA ortalamaları ve standart sapmal ar. Fgııre 4. The mean value of ELlSA and standard devatans n control group

4 130 tbaren 4. ve 10. hafta dışında anlamlı br farklılık belrlenmştr. ELISA referans test olarak kullanıldığında lfa T'ın senstvtes %100, spesftes se % 41,02 olarak belrlenmştr. Tartışma ve Sonuç Taena hydatgena'nın prepatent süresn Neveu- Lemare (12) 8-12 hafta, Güralp (8) hafta, Soulsby (20) 51 gün, Deplazes ve ark. (4) gün olarak bldrmşlerdr. Bu çalışmada se köpeklerde prepatent sürenn hafta arasında değştğ tespt edlmştr. Bu süre Neveu-Lemare (12) ve Güralp (8)'n kaydettğ süreler le benzerlk göstermştr. Parmeter ve ark. (13) köpeklerde T. hydatgena'nın büyüme ve gelşmesne populasyon yoğunluğunun etklern ncelemşler, hayvanlara 5 sstserkten fazla sstserk yedrldğnde hem parazt sayısının hem de büyüklüğünün etklendğn bldrmşlerdr. Bu çalışmada hayvanlara yedrlen sstserk sayıları arasında büyük br farklılık olmamakla brlkte, 7 sstserk yedrlen' köpekten toplanan T. hydatgena sayısının ve büyüklüklernn 5 sstserk yedrlen dğer hayvanlardan elde edlen T.hydatgena 'lardan daha az olması Parmeter ve ark. (13)'nın saptamalarını anımsatmıştır. IFAT ve ELISA yöntemlern çeştl sestod enfeksyonlarının tanısında kullanan araştırıcılar (6,9,19)!FAT le en erken günlerde, ELISA le günlerde, genellkle 2. haftadan tbaren bu enfeksyonların tanılarının yapılableceğn bldrmşlerdr. Bu çalışmada da IFAT le en erken enfeksyon sonrası 2. haftada, ELISA le 3. haftada antkorlar tespt edleblmş, değerlendrmeye alınan paraztn sestod olması, bu benzer sonuçlara ulaşmamızda etkl olmuştur. Deneysel olarak enfekte ettkler köpeklerde Echnococcus granulosus antkorlarını lfa T le teşhs eden Sngh ve Dhar (19) enfeksyondan 5 gün sonra tespt edlen antkorların 50. günde pk sevyeye ulaştığını bldrmşlerdr. Antkor ttresnn 50. günde en yüksek olmasının sebebn, gelşmn tamamlamış olan yumurta sayısının bu zamanda artması olarak bldrmşlerdr. Bu çalışmada da, enfeksyonun 2. haftasından tbaren antkorlar tespt edleblmş, bu ttre haftalar arasında pk sevyeye ulaşmıştır. En yüksek antkor ttrelernn bu haftalar arasında olması konusunda Sngh ve Dhar (l9)'ın görüşlerne katılmaktayız. Paraztsz ortamda yetşmş köpekler le monospesfk olarak sestodlar le enfekte edlmş köpeklerdek serolojk verlern değerlendrldğ br araştırmada (lo), hçbr köpeğn antkor ttrelernde çok büyük değşmn olmadığı bldrlmştr. Taena hydatgena le doğal enfekte köpeklerde bu parazte karşı oluşan antkor yanıtlarını nceleyen Jenkns ve ark (ll) da enfekte ve enfekte olmayan köpekler arasında büyük br fark olmadığım ve zaman zaman kanda bulunan antjenlern antkorları bağlaması nedenyle yanlış negatf sonuçların alındığını bldrmşlerdr. Gasser ve ark. (7) doğal enfekte köpeklerde E.granulosus'un teşhs amacıyla protoskoleks ve onkosfer antjenlern Esma Kazan - Ayşe Burgu kullanarak ELISA yöntemn denedkler br çahşmada, ağır enfekte olduğu blnen hayvajların ELIS+ yöntemnde negatf bulunmasının kandal bulunan E.granulosus antjenlernn antkorları Jağlamasındhn ler gelebleceğ ne dkkat çekmşlerdj. Bu çalış~nada da antkor ttrelernn genelolarak! düşük dü~eylerde kalması, enfeksyondan sonrak hhftalarda eı4e edlen yanlış negatf sonuçlar, 4. ve 10./haftalarda b;elrlenen anlamsızlık araştırıcıların da kaydettğ nedenlere lgl olabl.r... I. I. lndırekt Floresan Antıkor Testı ve ELISA yöntemn, çeştl sestod enfeksyonların~n teşhsnde; kullanan araştırıcılar!fat'ın duyarlı, E~ISA'nın s~ spesfk sonuçlar verdğn bldrmşlerd~r (3,1l,14,p,18,19). Bu çalışma. da da, hem enfıeksyon grı'ubundak köpekler n kan serumlarının IF AT le yüksek sulandırmalarda ble poztf reaksyon vermd, hem de kontrol grubundak köpekler n kln serumlarıhın düşük sulandırmalarda yanlış poztf relksyon verdjes, buna karşın ELISA yöntemnde Ikontrol grubundak köpeklern hç brnde yanlış poztf reaklsyonların görülmemes IFAT'ın duyarlı, ELISA'nın sbesfk br test olduğunu (ELISA referans teslt olarak kullanıldığında lfa T'ın senstvtes % 100, spesftes %41,02) göstermştr.. Bununla beraber, bu çalışma le hazırlanlan antjenlern purfye edlmeden kullanılması ve IEtl T'ın daha spesfk teşhs metotlarıyla destjklenmemesl durumunda, her k testn de köpeklerde IT. hydatge)ıa enfeksyonunun teşhsnde çok hassas \Legüvenlr (~lmadıkları sonucuna varılmıştır. Kaynaklar 1. Aydenzöz M (1996): Konıa Yöres Köpeklernde Helmntolojk Araştırmalar. Doktora Tez,!selçuk Ün v Sağlık Blmler Ensttüsü, Ko~ya 2. Cantoray R, Aytekn H, Güçlü F (1992): KQnya yöresndek keç/erde lıelmntolojk aj'aşttrlnalar.,leternarum 3, ' 3. Crag PS, Gasser RB, Parada L, Cabrera P Parıettı S ', Borgues C, Acuttıs A, Agulla I J, Snowden K, PaolIlo E (1995): Dagnoss of canne e9lınoc.occoss;j' C. ompars.on oj coproantljen and serum anttbody test walı arecolne purgallon.. U ' III ruguay. Yet Parastol, 56, Deplazes P, Gottstem B, StJgeln Y, Eck1ert J (1990): Detecton of Taena lıydatgen1a copro-anlglens by EL/SA n ~ogs. Yet Parasto!, 36,. 9I-ll~ Doganay A (1992): Turkıye de kedı vh köpeklerde görülen paraztler. Ankara Ühv Yet Fak d)erg, 39, Flentje B, Buchwalder R, Hepe T (1978)! Dagnoss of bovne cysıcercoss by "ıeans of ımılunojloresce11l anıbody teclınque. Arch EXB Yet Med, 32!, Gasser RB, Lghtowlers Mr"', Obendorf DL, Jenkms DJ, Rıckard DMD (1988): Bvaluaıon ofsbrologcal test system for ılıe dagnoss of nblural Eclınoboccus granu- I. f:.. d. os us 1/!leCllOn111 ogs usll1g Eclınococcus granulosus proıoscolex and oncosplıenl antgens. Aılıst Yet l, 65, Güralp N (1981): Helmnlol.. 2. Baskı. Ankara Ünverstes Basımev. Ankara. :

5 Ankara Ünv Yet Fak Derg, 51, Heath DD, Lawrence SB, Glenne A, TwaalOıoven H (I 985): The use of exeretory and seeretory antgens of the seolex of Taena ovs for the serodagnoss of nfectan n dogs. J Parast, 71, LO. Jenkıns DJ, Rckard MD (1984): Haemotologeal and serologeal data from dogs rased worm-free and monospesjeally nfeeted wth helmmhs. Anst Yet J, 61, Jenkns DJ, Gasser RB, Romng T, Zeyhle E (I 99 ): Antbody responses aganst natural Taena hydatgena nfectan n dogs n Kenya. Int J Parastol, 21, Neveu-Lemare M (I 936): Tralte d'helmntologe Medcale et Veternare Ygot Freres, Pars. 13. Parmeter SN, Heath DD, TwaalOıoven H (1981): Effeet of populaton denstyon growth and developmem of Taena hydatgena n dogs. Res Yet Sc, 30, Proudman CJ, Trees AJ (1996): Use of exeretorylsecretory amgens for serodagnoss of Anoploeephala perfolata eestodoss. Yet Parasİtol, 61, Raltson MJ, Heath DD (1995): Adefned anlgen for serodagnoss oftaena ovs nfectan n dogs. J Parastol, 51, Sarımehmetoğlu HO (1995): Toxoeara eans le Deneysel Enfekte Farelerde Vseeral Larva Mgransm İndrekt HemaglutnasYOlı ve İndrekt Floresan Antkor Testler le Teşhs. Doktora Tez, Ankara Ün v Sağlık Blmler Ensttüsü, Ankara. 17. Sarımehmetoğlu HO, Gönenç B, Pşkn ç, Ayaz E (1993): Koyun, keç, sığır ve mandalarda Cysteereus tenueolls'n yayı/ışı. Ankara Ünİv Yet Fak Derg, 40, Shn IW, Lao WT (2002): Humoral mmun responee to Dpyldum eannum nfectan of stray dogs n Tawan. Yet Parastol, 104, Sngh BP, Dhar, D.N. (1988): Indreet jloreseent antbody test for the deteeton of antbodes to Eehnocoeeus granulosus n expermentally nfeeted pups. Yet Parasİto!, 28, 185- ı Soulsby EJL (1982): Helmnths, Arthropods and Protozoa of Doıııestcated Anıııals. 7th Ed. Ballere Tndall, London. 21. Şahn İ, Eknc N, Şen İ, Özcan M, Gödekmerdan A (1993): Kayser yöres köpeklernde Eelınoeoeeus granu-. losus (Batseh, 1786) ve dğer paraztlern yayı/ışı. T Parastol Derg, 17, Zeybek H (1980): Samsun yöres koyun ve kuzulamıda parazter fauna saptama çaltşmaları. Ankara Ünv Yet Fak Derg, 27, Gelş Tarh Kabul Tarh Yazışma Adres: Dr. Esma KOZAN Ankara Ünverstes, Veterner Fakültes Helmntoloj Blm Dalt 061 lo-ankara