T.C ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİYOTEKNOLOJİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ

Transkript

1 T.C ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİYOTEKNOLOJİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ GENÇ ve YAŞLI TROMBOZLU HASTA GRUPLARINDA OLASI GENETİK RİSK ETMENLERİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ Dilara Fatma AKIN Danışman Öğretim Üyesi Prof. Dr. Nejat AKAR ANKARA 2010

2 KABUL ONAY Prof.Dr. Nejat AKAR danışmanlığında Dilara Fatma AKIN tarafından hazırlanan bu çalışma, tarihinde aşağıdaki jüri tarafından Temel Biyoteknoloji Anabilim Dalı nda yüksek lisans tezi olarak kabul edilmiştir. Başkan: Prof Dr. Nejat AKAR İmza: Üye: Prof.Dr.MuhitÖZCAN İmza: Üye: Doç.Dr. Hilal ÖZDAĞ İmza: Prof. Dr. Orhan ATAKOL Enstitü Müdür V. ii

3 ÖZET Dünya Sağlık Örgütünün (WHO) verilerine göre kalp damar hastalıkları ölüm sebeplerinin ilk sırasında yer almaktadır. Tahminlere göre 2005 yılında Dünya genelinde 17.5 milyon insan kalp ve damar hastalıkları nedeni ile yaşamını yitirmiştir. Türkiye de de kalp ve damar hastalıkları tüm Dünya da olduğu gibi ölümcül hastalıkların ilk sırasında gelmektedir. Bu hastalıklar içinde bulunan tromboz çok sayıda kalıtsal ve edinsel etmenin tek başına ya da birlikte seyrettiği çok etmenli bir hastalıktır. Bu çalışma; FV 1691 G-A gen değişimi ile birlikte, PT G-A, MTHFR 677 C-T ve ACE I/D gen değişimlerinin genç ve yaşlı çalışma gruplarında tromboza ve dolaylı olarak da uzun yaşama olan etkisinin, Türk toplumunda değerlendirilmesi amacı ile gerçekleştirilmiştir. Çalışmamıza klinik olarak tromboz geçiren 0 18 yaş aralığında 362, 70 yaş ve üzeri 209 birey, tromboz geçirmeyen 0 18 yaş aralığında 332, 70 yaş ve üzeri 266 birey dâhil edilmiştir. Klasik fenol- klorofrom yöntemi ile ayrılan DNA örneklerinde FV 1691 G-A, PT G-A ve MTHFR 677 C-T gen değişimlerinin tespiti için Real- Time PCR tekniği kullanılmış ve erime eğrisi incelemesi yapılmıştır, ACE I/D polimorfizmi tespiti için ise uygun primerler kullanılarak istenilen bölge Klasik PCR tekniği ile çoğaltılmış ve agaroz jel elektroforezinde sonuçlar değerlendirilmiştir. FV 1691 G-A MTHFR 677C-T, PROTROMBİN G-A ve ACE I/D gen değişimleri tek başına incelendiğinde, yaş gruplarında sağlıklı ve hasta grup arasında istatiksel farklılık görülmemiştir, ancak çalışma gruplarında risk etmenleri birlikte değerlendirildiğinde istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Anahtar Kelimeler: FV 1691 G-A, PT G-A, MTHFR 677 C-T, ACE I/D, Tromboz, İnsan Ömür Uzunluluğu iii

4 ABSTRACT According to The World Health Organization (WHO) s data, cardiovascular diseases the leading cause of death With respect to WHO s estimate, worldwide 17,5 million people has lost their lifes because of cardiovascular diseases in In Turkey cardiovascular diseases is one of the deadly diseases as all over the world. Thrombosis is a disease with many factors where inherited and acquired factors is acting together or alone. The aim of this study was to evaluate the effect of some cardiovascular, thrombotic risk factors on longevity such as FV 1691 G-A, PT G-A, MTHFR 677 C-T and ACE I/D and to determine the role of combination of mutations in young and old groups. In our study as a clinical thrombosis of age between 0 18, 362 individual, 70 years and over 209 individual, with 332 individual in the 0 18 age range do not have thrombosis 70 years and over 266 individuals were included. DNA was extracted by classical phenolclorofrom method and genotyping of FV 1691 G-A, PT G-A, MTHFR 677 C-T polymorphisms were performed by Real-Time PCR technique. Genotyping of ACE I/D polymorphism, perfect- matched primers used to amplify the target region and agarose gel electrophoresis was performed for the identification of this polymorphism. In the two age groups between healty 8 patient groups FV 1691 G-A, PT G-A, MTHFR 677 C-T and ACE I/D polymorphisms were not found statistically significant when analyzed one by one. But our study showed that when analyzed together these polymorphisms are thrombotic risk factor in the studied groups. Key words: FV 1691 G-A, PT G-A, MTHFR 677 C-T, ACE I/D, Thrombosis, Longevity iv

5 ÖNSÖZ Yüksek lisans eğitimim süresince, sahip olduğu engin bilgi ve tecrübeleri ile beni yönlendiren, her zaman desteğini hissettiğim ve bundan sonraki eğitim ve çalışma hayatım süresince de desteğine ihtiyaç duyacağım danışman hocam Sayın Prof.Dr. Nejat AKAR a: Tezimin deney ve yazım aşaması süresince, benden desteğini esirgemeyen, sosyal yaşantımda ihtiyaç duyduğum her anda ve her konuda büyük bir sabır ve ilgi ile yaklaşan, insanlığı, yardımseverliği ve hoşgörüyü yaşam tarzı ile bana örnekleyen, hayatımın bundan sonraki süresinde her zaman yanımda olmasını dilediğim Uzm. Bio. Yonca EĞİN e; Güler yüzü, sevgi ve ilgisini bizden eksik etmeyen ve ihtiyaç duyduğumuz her anda yardımını esirgemeyen Uzm. Bio. Ece AKAR a; Tez çalışmam süresince, her zaman yardım ve desteğini gördüğüm, zor anlarımda hep yanımda olduğunu bildiğim ve bileceğim ve tezimin en önemli materyali olan DNA ların izole edilmesini sağlayan Bio. Emel USLU ya; Çalışmam süresince bilgi ve önerilerini esirgemeyen Bio. Dr.Ayşenur ÖZTÜRK e; birlikte çalışmaktan mutluk duyduğum, keyifli birçok anı paylaştığımız çalışma arkadaşlarım; Uzm. Bio. Duygu SANLIDİLEK, Uzm. Bio. Cennet YILDIZ, Uzm. Bio. Didem TORUN, Uzm. Bio Afife KARABIYIK, Uzm. Bio. ÖZGE CUMAOĞULLARI, Uzm. Bio Hamit Emre KIZIL, Uzm. Bio. Esin GÜNGÖR, Bio. Gülin GÜLBAHAR, Bio. Sezen BALLI, Tek. Kadir SİPAHİ, Tek. Çiğdem ARSLAN, Uzm. Bio. Duygu DUMAN, Uzm. Bio Filiz Başak CENGİZ ve ismini sayamadığım tüm Pediatrik Moleküler Genetik Ailesi ne; Hayatımın her aşamasında maddi ve manevi desteklerini benden esirgemeyen ve bana attığım her adımda inanan, her zaman kendilerine layık olmaya çalıştığım ve çalışacağım varlıklarını hiçbir şeye değişmeyeceğim annem, babam ve kardeşime, Teşekkürlerimi sunarım v

6 İÇİNDEKİLER KABUL ve ONAY... ii ÖZET... iii ABSTRACT... iv ÖNSÖZ... v İÇİNDEKİLER... vi ÇİZELGELER DİZİNİ... viii ŞEKİLLER DİZİNİ... x DİZİLER LİSTESİ... xi SİMGELER DİZİNİ... xii 1.GİRİŞ ve AMAÇ GENEL BİLGİLER Kalp Damar Hastalıklarının Görülme Sıklığı Doğuşta Beklenen Yaşam Süresi Hemostaz Damar bütünlüğü Trombositler Pıhtılaşma mekanizması Ekstrinsik yolak İntrinsik yolak Ortak yol Pıhtılaşma mekanizmasının kontrolü Feed-Back inhibisyon Fibrinilotik Sistem Doğal İnhibitörler Protein C ve Protein S Endotel Tromboz Kalıtsal risk etmenleri Antitrombin (AT) III eksikliği Protein C (PC) Eksikliği Protein S ( PS) Eksikliği Artmış FVIII, FIX ve FXI düzeyleri Trombomodulin vi

7 Lipoprotein (a) eksikliği Faktör V geni ve Faktör V Leiden (1691 G-A) mutasyonu Protrombin G-A mutasyonu Angiotensin Dönüştürücü Enzim (ACE) Gen Polimorfizmi Homosistein Metilentetrahidrofolat redüktaz geni (MTHFR) ve Özellikleri Metilentetrahidrofolat redüktaz (MTHFR) Enziminin Tarihçesi ve MTHFR 677C-T Değişimi Metilentetrahidrofolat redüktaz Enzimi (MTHFR) ve Özellikleri MTHFR 677C-T Gen Değişiminin Dağılımı MTHFR 677C-T Gen Değişiminin Klinik Önemi Moleküler teknikler Kullanılan çözeltiler DNA ekstraksiyonu Polimeraz Zincir Reaksiyonu ( PCR Restriksiyon Enzimleriyle Kesim Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Real Time PCR) İstatiksel Yöntemler MATERYAL VE YÖNTEM Yöntem DNA İzolasyonu Polimeraz zincir reaksiyonu ( PCR ) ile ACE Geni İnsersiyon / Delesyon Değişimi Tayin Agaroz Jel Elektroforezi Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Analizi (Real Time PCR) FV 1691 G A, Protrombin G-A ve MTHFR 677 C-T Gen Değişimlerinin Belirlenmesi ARAŞTIRMA BULGULARI Gerçek Zamanlı PCR Analiz Bulguları PCR Analiz Bulguları İstatiksel Analiz Bulguları.62 5.TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ vii

8 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1.Türkiye Ulusal Düzeyde Ölümlerin Temel Hastalık Gruplarına Göre Yüzde Dağılımı... 5 Şekil 2.2. Ülkelerin sahip olduğu yaşam süreleri sıralaması... 6 Şekil 2.3. Türkiye de çeşitli yıllarda doğuşta beklenen yaşam süresi... 6 Şekil 2.4. Pıhtılaşma Mekanizmasını Başlatan Ekstrinsik Yol Şekil 2.5. Pıhtılaşma Mekanizmasını Başlatan İntrinsik Yol Şekil 2.6. Protein C Yolağı Şekil 2.7. Kromozom Şekil 2.8. Kromozom Şekil 2.9. Kromozom Şekil 2.10.Elementinin ACE Gen Bölgesine Alu girişi ve buna bağlı olarak oluşan iki farklı homozigot genotipin görüntüsü Şekil 2.11.Metiyonin, homosistein ve sisteinin kimyasal yapısı Şekil 2.12.Homosistein- Metiyonin Metabolizması Şekil 2.13.Kromozom Şekil 2.14.Metilentetrahidrofolat Redüktaz Enzimi substrat ve ürün Şekil.2.15.Homosistein transsülfürasyon ve remetilasyon metabolize yolakları Şekil 2.16.Farklı toplumlarda MTHFR 677 C-T polimorfizminin mutant olan TT genotipi sıklığı Şekil 2.17.RT- PCR Light Cycler Mutasyon Analiz Yönteminin Çalışma Prensibi Şekil 2.18.Erime Eğrisi Analizi: Dizide ( Örn.FV 1691 G-A, Protrombin G-A MTHFR 677 C-T) oluşabilecek genotiplerin görünümü Şekil 3.1. ACE (I/D) insersiyon/ delesyon için elde edilen PCR ürünlerinin elektroforez fotoğrafı Şekil 3.2. RT- PCR, FV 1691 G-A ve Protrombin G-A primerlerinin bağlanarak çoğalttıkları gen Bölgesi Şekil 3.3. Erime Eğrisi Analizi: Dizide (Örn.Faktör V Leiden) oluşabilecek genotiplerin görünümü Şekil 4.1. FV 1691 G-A Gerçek Zamanlı PCR analizi. A A: Homozigot CC alleli; B:Heterozigot CT alleli; C: Homozigot mutant AA görüntüsü...60 Şekil 4.2. PT G-A Gerçek Zamanlı PCR analizi. A A: Homozigot CC alleli; B:Heterozigot CT alleli; C: Homozigot mutant AA görüntüsü...61 Şekil 4.3. MTHFR 677 C-T Gerçek Zamanlı PCR analizi. A A: Homozigot CC alleli; B:Heterozigot CT alleli; C: Homozigot mutant TT görüntüsü Şekil 4.4. ACE I/D insersiyon/ delesyonu için elde edilen PCR ürünlerinin Agaroz Jel Elektroforez fotoğrafı...61 viii

9 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1. Kalıtsal ve Edinsel Trombotik Risk Etmenleri Çizelge 2.2: Farklı toplumlarda FV 1691 G-A gen değişimi sıklığı Çizelge 2.3: Farklı toplumlarda PT G-A Gen Değişimi sıklığı Çizelge 2.4. Farklı Toplumlarda ACE I/D insersiyon/ delesyon polimorfizim sıklığı Çizelge 3.1. Light Cycler cihazında kullanılan FVL kit içerikleri ve reaksiyonda kullanılan miktarlar Çizelge 3.2. Light Cycler cihazında kullanılan PT G-A kit içerikleri ve reaksiyonda kullanılan miktarlar Çizelge 3.3. Light Cycler cihazında kullanılan MTHFR kit içerikleri ve reaksiyonda kullanılan miktarlar Çizelge 3.4. Faktör V geni genotiplemesi için kullanılan primer dizileri ve hibridizasyon probları Çizelge3.5.Protrombin geni genotiplemesi için kullanılan primer dizileri ve hibridizasyon probları Çizelge 3.6. MTHFR 677 C-T geni genotiplemesi için kullanılan primer dizileri ve hibridizasyon probları Çizelge 4.1: 0 18 yaş aralığında kontrol ve hasta çalışma gruplarında FV 1691 G-A gen değişimi genotip dağılımı ve allel frekansı Çizelge ve üzeri yaş aralığında sağlıklı ve hasta çalışma gruplarında FV 1691 G-A gen değişimi genotip dağılımı ve allel frekansı Çizelge 4.3. FV 1691 G-A gen değişiminin 0 18 yaş kontrol ve hasta grupları arasındaki korelasyonu Çizelge ve üzeri yaş aralığında kontrol ve hasta çalışma gruplarında FV 1691G-A gen değişimi genotip dağılımı ve allel frekansı Çizelge yaş aralığında kontrol ve hasta çalışma gruplarında PT G-A gen değişimi genotip dağılımı ve allel frekansı Çizelge ve üzeri yaş aralığında kontrol ve hasta çalışma gruplarında PT G-A gen değişimi genotip dağılımı ve allel frekansı Çizelge 4.7. PT G-A gen değişiminin 0 18 yaş kontrol ve hasta grupları arasındaki korelasyonu Çizelge 4.8. PT G-A gen değişiminin 70 ve üzeri yaş aralığında kontrol ve hasta grupları arasındaki korelasyonu Çizelge yaş aralığında kontrol ve hasta çalışma gruplarında MTHFR 677 C-T gen değişimi genotip dağılımı ve allel frekansı Çizelge ve üzeri yaş aralığında kontrol ve hasta çalışma gruplarında MTHFR 677 C-T gen değişimi genotip dağılımı ve allel frekansı Çizelge MTHFR 677 C-T gen değişiminin 70 ve üzeri yaş aralığında kontrol hasta gruplar arasındaki korelasyonu Çizelge 4.12.MTHFR 677 C-T gen değişiminin 18 ve üzeri yaş aralığında kontrol hasta ve grupları arasındaki korelasyonu Çizelge yaş aralığında kontrol ve hasta çalışma gruplarında ACE I/D delesyon/insersiyonunun genotip dağılımı ve allel frekansı Çizelge ve üzeri yaş aralığında kontrol ve hasta çalışma gruplarında ACE I/D delesyon/ insersiyon unun genotip dağılımı ve allel frekansı Çizelge ACE I/D insersiyon/ delesyonunun 0 18 yaş kontrol ve hasta grupları arasındaki korelasyonu ix

10 Çizelge ACE I/D İnsersiyon/ delesyonun 0-18 yaş aralığında kontrol hasta ve grupları arasındaki korelasyonu Çizelge ACE I/D insersiyon/delesyon unun 70 ve üzeri yaş aralığında kontrol ve hasta grupları arasında korelasyonu Çizelge FV 1691 G-A ve MTHFR 677 C-T gen değişimlerinin 0 18 yaş aralığında kontrol ve hasta grupları arasındaki korelasyonu Çizelge FV 1691 G-A ve MTHFR 677 C-T gen değişimlerinin 70 ve üzeri yaş aralığında kontrol ve hasta grupları arasındaki korelasyonu Çizelge FV 1691 G-A ve MTHFR 677 C-T gen değişimlerinin 0-18 yaş / 70 ve üzeri yaş aralığında kontrol grupları arasındaki korelasyonu Çizelge FV 1691 G-A ve MTHFR 677 C-T gen değişimlerinin 0-18 yaş / 70 ve üzeri yaş aralığında hasta grupları arasındaki korelasyonu Çizelge FV 1691 G-A ve PT G-A gen değişimlerinin 0-18 yaş aralığında kontrol ve hasta grupları arasındaki korelasyonu Çizelge FV 1691 G-A ve PT G-A gen değişimlerinin 70 ve üzeri yaş aralığında kontrol ve hasta grupları arasındaki korelasyonu Çizelge FV 1691 G-A ve PT G-A gen değişimlerinin 0-18 yaş aralığında hasta grupları arasındaki korelasyonu Çizelge FV 1691 G-A ve PT G-A gen değişimleri bağımsız MTHFR 677 C-T gen değişiminin 0-18 yaş aralığında kontrol ve hasta grupları arasındaki korelasyonu Çizelge FV 1691 G-A ve PT G-A gen değişimleri bağımsız MTHFR 677 C-T gen değişiminin 70 ve üzeri yaş aralığında kontrol ve hasta grupları arasındaki korelasyonu Çizelge FV 1691 G-A ve PT G-A gen değişimleri bağımsız ACE I/D insersiyon/ delesyon unun 0-18 yaş aralığında kontrol ve hasta grupları arasındaki korelasyonu Çizelge FV 1691 G-A ve PT G-A gen değişimleri bağımsız ACE I/D insersiyon/ delesyon unun 70 ve üzeri yaş aralığında kontrol ve hasta grupları arasındaki korelasyonu x

11 DİZİLER LİSTESİ Dizi Dizi 1. ACE I/D değişiminin tespit edilebilmesi için PCR ile çoğaltılmış dizi Dizi 2. FV 1691 G-A değişiminin tespit edilebilmesi için RT-PCR ile çoğaltılmış dizi primerler altı çizili olarak gösterilmiştir Dizi 3.Protrombin G-A değişiminin tespit edilebilmesi için RT-PCR ile çoğaltılmış dizi primerler altı çizili olarak gösterilmiştir Dizi 4.MTHFR 677 CT değişiminin tespit edilebilmesi için RT-PCR ile çoğaltılmış dizi primerler altı çizili olarak gösterilmiştir xi

12 SİMGELER DİZİNİ A : Adenin bazı APC : Aktif Protein C A I : Angiotensin I A II : Angiotensin II ACE : Angiotensin Dönüştürücü Enzim AT III : Antitrombin III Arg : Arginin aminoasidi bç : Baz çifti C : Sitozin bazı Ca +2 : Kalsiyum C : Santigrat derece ddh20 : Deiyonize Su dntp : Deoksinükleotid tri fosfat DNA : Deoksiribonükleotid DVT : Derin Ven Trombozu EDTA : Etilendiamintetraasetikasit FVL : Faktör V Leiden G : Guanin bazı µg : Mikrogram µl : Mikrolitre µm : Mikromolar kda : Kilo dalton LDL : Düşük dansiteli Lipoprotein Lip (a) : Lipoprotein a MgCl2 : Magnezyum klorür M : Molar mm : Milimolar MTHF : Metilentetrahidrofolat MTHFR :Metilentetrahidrofolat Redüktaz MS :Metiyonin sentetaz NADH :Nikotin amid Dinükleotidin indirgenmiş hali NADPH :Nikotin amid Dinükleotid fosfatın indirgenmiş hali xii

13 ng p PAI 1 PCR PT Pmol RBC RFLP SAH SAM q T vwf FII FVIII FVIIIa FVII FVIIa FV FIX FIXa FX FXa FXII kda kb TE TBE : Nanogram : Kromozomun kısa kolu : Plazminojen Aktivatör İnhibitörü : Polimeraz zincir reaksiyonu : Protrombin : Pikomol : Red Blood Cell : Restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi : S-Adenozil Homosistein : S-Adenozil Metiyonin : Kromozomun uzun kolu : Timin bazı : von Willebrand Faktör : Protrombin : Faktör VIII, Antihemofilik Faktör : Aktif Faktör VIII : Faktör VII : Aktif Faktör VII : Proakselerin : Faktör IX : Aktif Faktör IX : Faktör X : Aktif Faktör X : Hageman Faktör : Kilo Dalton : Kilo Baz : Tris EDTA : Tris borik asit, EDTA xiii

14 1.GİRİŞ VE AMAÇ Tıp, bilim-teknoloji, beslenme ve sosyo-ekonomik alanlarındaki gelişmeler nedeniyle yaşam beklentisi (süresi) giderek artmaktadır. Eski Roma da ömür uzunluğu ortalama 22 yıl, 1800lü yılların ortalarında Kuzey Amerika da 40 yıl, günümüzde ise gelişmiş ülkelerde bu değer 80 yıldır. Türkiye de 2008 yılı itibari ile yaşam beklentisi kadınlarda 74.3, erkeklerde 69.4 olarak belirlenmiştir (Anonim, 2008). Yaşam beklentisi, iklim, sağlık durumu, çevre şartları, yaşam biçimi ve genetik özellikler gibi etmenlerden doğrudan ya da dolaylı olarak etkilenmektedir. Genetik özellikler bireyin çeşitli hastalıklara olan eğilimini gösteren somut göstergelerdir. Dünya Sağlık Örgütünün (WHO) verilerine göre kalp damar hastalıkları ölüm sebeplerinin ilk sırasında yer almaktadır. Tahminlere göre 2005 yılında Dünya genelinde 17.5 milyon insan kalp ve damar hastalıkları nedeni ile yaşamını yitirmiştir. Türkiye de de kalp ve damar hastalıkları tüm Dünyada olduğu gibi ölümcül hastalıkların ilk sırasında gelmektedir. Bu hastalıklar içinde bulunan, Dünyada en önemli morbidite ve mortalite nedenlerinden biri olan tromboz çok etmenli bir hastalıktır. Çok sayıda kalıtsal ve edinsel etmenin çeşitli mekanizmalar ile tromboza neden olduğu bilinmektedir. Kalıtsal risk etmenleri trombozun etyopatogenezinde tek tek ya da birlikte rol alabilirler. Kalıtsal risk etmenlerinin başında Aktive Protein C direnci oluşturarak tromboza neden olan Faktör V Leiden mutasyonu gelmektedir. Faktör V geninde meydana gelen nokta mutasyonu sonucunda (1691 G-A) FV molekülünün doğal antikoagülan Protein C-Protein S sistemine karşı duyarlılığı azalmakta ve aktif Protein C ye karşı direnç oluşturmaktadır (Bertina 1997). Bu mutasyonun varlığı heterozigot bireylerde tromboz riskini yaklaşık 5 10 kat, homozigotlarda ise kat artırmaktadır (Madonna vd 2002). Protrombin genindeki G-A değişimi sonucu artmış protrombin düzeyinin venöz tromboz oluşumu için bir risk etmeni olabileceği birden çok çalışmada ileri sürülmüş bu mutasyonun sağlıklı bireylerdeki sıklığı %2 iken, hastalarda ise % 6.2 olarak bildirilmiştir. 1

15 Angiotensin dönüştürücü enzimi (ACE), kodlayan gen olan ACE geninin 16. intronundaki insersiyon/ delesyon (I/D), ACE nin plazma seviyeleri ile ilişkilendirilmiştir. Yapılan çalışmalarda, ACE (I/D) polimorfiziminin koroner arteriyel hastalık, miyokardial infarkt, beyin infarktı ve hipertansiyon gelişimini etkileyebileceği belirlenmiştir. Çeşitli mekanizmalar ile tromboza neden olan hiperhomosisteineminin oluşumunda kalıtsal ve edinsel birden çok etmen rol oynamaktadır, bunlardan biri de MTHFR enziminin aktivitesini azaltarak, plazma homosistein seviyesinin artmasına neden olan 677 C-T gen değişimidir. Homosistein, metiyonin metabolizması sırasında oluşan ve sülfür içeren bir aminoasittir. Bu aminoasit, diyetle alınan ve endojen proteinlerden sentezlenen esansiyel bir aminoasit olan metiyoninin metil grubu alınmış bir türevidir. Plazma homosistein düzeyi çeşitli etmenler tarafından belirlenmektedir. Homosistein metabolizmasında rol oynayan enzimlerin kalıtımsal defektlerinde hiperhomosisteinemi görülmektedir. MTHFR (Metilentetrahidrofolat redüktaz) enziminin aktivitesinde azalma, plazma homosistein düzeyinin artmasına, folat düzeyinin azalmasına neden olmaktadır. Çünkü plazmada folat başlıca metiltetrahidrofolat şeklinde bulunmaktadır ve MTHFR, metiltetrahidrofolatı oluşturan enzimdir, MTHFR 5,10 metilen tetrahidrofolat ı 5 metiltetrahidrofolata katalize etmektedir. Bu enzimi kodlayan genin 677. nükleotidindeki sitozin yerine timin gelmesi (MTHFR 677C-T) enzim aktivitesinin azalmasına ve ısıya dayanıklılığınının değişmesine neden olmaktadır. Azalan enzim aktivitesi 5-metiltetrahidrofolat seviyesinde azalmaya sebep olurken bunun sonucu olarak, homosisteinin metiyonine dönüşememesi nedeniyle plazma homosistein seviyesinde artmaya neden olmaktadır. MTHFR 677C-T mutasyonunda, enzim aktivitesi homozigot mutant TT genotipinde, heterozigot CT ve homozigot normal CC genotiplerine göre azalırken, homosistein seviyesi önemli oranda yükselmektedir ( Kang vd 1991, Dikmen 2004, Kluitjmans vd 1996). Hiperhomosisteinemi vücutta birçok zararlı etkilere yol açmaktadır. Bunlardan bazıları; serbest radikaller gibi davranıp endotel hasarı oluşturması bunun sonucunda, endotelin antitrombotik özelliğini protrombotik yönde değiştirmesi, pıhtılaşma faktörlerinin modifikasyonu, biyolojik membranlarda oksidasyon yapması, LDL oksidasyonun artması ile kolesterol esterlenin birikimi, damar düz kasındaki hücre büyümesini artırmak gibi etkiler ortaya çıkarması sayılabilmektedir. MTHFR 677 C-T değişimi sonucu ortaya çıkan 2

16 hiperhomosisteineminin kalp ve damar hastalık riskini artırdığını ya da bunun aksini bildiren birden çok çalışma mevcuttur. Kluitjsman vd (1996) 677 C-T mutasyonunun kalp ve damar hastalıkları için üç kat artırdığını belirtiken, L.Brattström vd (1998) ise 677 C-T mutasyonu taşımanın kalp ve damar hastalıkları için herhangi bir risk getirmediğini belirtmişlerdir. Bu mutasyonun uzun yaşamaya etkisi Japon toplumunda incelenmiştir (Matsushita vd 1997). Ancak bu toplum, ikinci dünya savaşı sırasında genç nüfus kaybı nedeniyle sağlıklı sonuç vermemiş olabilir, oysa Türk toplumu, doğal bir gelişme evresi göstermektedir. Sonuç olarak çalışmalar, yapıldığı ülkelere ve olgu seçimine göre değişim göstermektedir. Türk toplumu doğal bir gelişme sürecinin görülmesi sebebiyle genlerin etkilerinin araştırılabileceği bir model olarak görülmektedir. Bu çalışma; FV 1691 G-A gen değişimi ile birlikte, PT G-A, MTHFR 677 C-T ve ACE I/D gen değişimlerinin genç ve yaşlı çalışma gruplarında tromboza ve dolaylı olarak da uzun yaşama olan etkisinin, toplumumuzda değerlendirilmesi amacı ile gerçekleştirilmiştir. 3

17 2. GENEL BİLGİLER 2.1 Kalp ve Damar Hastalıkları Görülme Sıklığı Kalp ve damar hastalıkları Dünyada ölümcül hastalıkların en başında gelmektedir. Kalp ve damar hastalıkları, koroner kalp hastalıkları, konjenital kalp hastalıkları, derin damar trombozu ve akciğer embolizmasını içeren bir grup kalp damarlarının ve kalbin bozukluğu olarak tanımlanabilmektedir. Kalp damar hastalıkları üç temel başlıkta sınıflandırılabilmektedir. 1. Koroner kalp hastalıkları 2. Beyin damar hastalıkları 3. Diğer damar hastalıkları Tahminlere göre 2005 yılında Dünya genelinde 17.5 milyon insan kalp ve damar hastalıkları nedeni ile yaşamını yitirmiştir. Bu değer Dünya genelindeki toplam ölümlerin % 30 unu oluşturmaktadır. Bu ölümlerin 7.6 milyonu koroner kalp hastalıklarından dolayı, 5.7 milyonu ise inme nedeniyledir. Kalp damar hastalıklarının % 80 inden fazlası düşük ve orta gelirli ülkelerde meydana gelmektedir ( Türkiye de Sağlığa Bakış 2007). Hastalıkların mortalitesi, görülme sıklığı ve ölüm oranları; çoğu Kuzey, Güney ve Batı Avrupa ülkesinde azalmakta ancak orta ve doğu Avrupa ile Asya ülkelerinde artmaktadır (Avrupa Kalp Sağlığı Sözleşmesi 2007). Kalp ve damar hasta sayısının önümüzdeki 10 yılda belirleyecek başlıca üç etken nüfus artışı, nüfusun ortalama yaşının ilerlemesi ve bireylerdeki kalp hastalığına yatkınlığın artmasıdır (Ulusal Kalp Sağlığı Politikası 2006) yılı için yapılan tahminlere göre ise çoğunlukla kalp hastalıkları ve inmeden olmak üzere hemen hemen 20 milyon insanın kalp ve damar hastalıklarından dolayı yaşamını yitirebileceği öngörülmektedir. 4

18 Türkiye de de kalp ve damar hastalıkları tüm Dünyada olduğu gibi ölümle ölümcül hastalıkların ilk sırasında gelmektedir. Bu değer tüm ölüm nedenlerinin % ünü kapsamaktadır (Türkiye de Sağılığa Bakış 2007). Ülkemizde koroner kalp hastalığının yaygınlığını tespit etmek için yapılan çalışmanın sonuçlarına göre 1990 yılı taramasında koroner kalp hastası, hipertansif kalp hastası olmak üzere toplam kalp hastası bulunduğu belirtilmiştir yılından beri geçen sürede koroner kalp hasta sayısının 2.8 milyona yükseldiği ve artış oranının % 5 6 dolayında olduğu tahmin edilebilir (Ulusal Kalp Sağlığı Politikası 2006). Şekil 2.1.Türkiye Ulusal düzeyde ölümlerin temel hastalık gruplarına göre yüzde dağılımı 5

19 2.2. Doğuşta Beklenen Yaşam Süresi Göstergeleri Ülkelerin nüfus özellikleri iklim, sağlık, çevre, genetik özellikler, yaşam biçimi ve beslenme, sosyo-ekonomik gibi nedenler ile farklılık gösterebilmektedir. Toplumda belirli bir sürede oluşan ölümler, kaba ölüm hızı, bebek ölüm hızı, yaş ve cinse özel ölüm hızları ve standartlaştırılmış ölüm hızları gibi ölçütlerle ölçülür. Bu ölçüler insanların hayatları boyunca çeşitli yaşlarda karşı karşıya bulundukları ölüm riskini şematik bir şekilde gösteremedikleri gibi ortalama olarak ne kadar yaşadıkları hakkında da bir fikir veremezler. Toplumun ölüm durumunu belirtmede kullanılan diğer ve ayrıntılı bir yöntem olan yaşam tabloları ise herhangi bir toplumda, mevcut sosyal, ekonomik ve çevresel koşullar içinde, bir kuşağın doğumda ve doğumu izleyen değişik yaş basamaklarının her birinin başında, daha kaç yıl yaşama şansına sahip olduğunu göstermek için o bölgenin mortalite istatistiklerinden faydalanılarak hazırlanan tablolardır (Şekil 2.3), (Otlu vd 2004). Bu göstergelere göre Uluslar arası yönetim geliştirme enstitüsü (IMD) tarafından 55 ülke ve yerel yönetim arasında yapılan bir araştırmada, ülkelerin ortalama yaşam süreleri belirlenmiştir. Buna göre; en uzun yaşam süresi 82 yaş ortalaması ile Japonya dadır. Japonya yı, Fransa, Almanya, İngiltere gibi gelişmiş ülkeler izlemektedir. Türkiye ise 71 yaş ortalamasıyla 51 inci sırada yer almaktadır ( Şekil 2.2. Ülkelerin sahip olduğu yaşam süreleri sıralaması 6

20 Şekil 2.3. Türkiye de çeşitli yıllarda doğuşta beklenen yaşam süresi (TİK 2008) 7

21 2.3. Hemostaz Hemostaz, kanın dolaşımda sıvı halde kalmasını sağlayan fizyolojik bir mekanizmadır. Fizyolojik mekanizmanın kanın sıvı halde kalmasını sağladığı gibi kan damarlarında herhangi bir travma sonucu oluşan kanamayı durdurduğu ve daha sonra aynı damarın fonksiyonunu devam ettirmesi için damarın pıhtıdan temizlenerek açıldığı ve bu fonksiyonu da hemostaz-fibrinolitik aktivitelerin bir denge içerisinde çalışması aracılığı ile gerçekleştirdiği bilinmektedir (Celkan vd 2005). Bu dengenin koagülasyon lehine bozulması trombüs oluşumuna, fibrinolizisin artışı ise kanamaya neden olmaktadır (Ermiş vd 2006). Hemostaz mekanizması 3 ayrı bölümü olan bir fonksiyondur. 1-) Damar Bütünlüğü 2-) Trombositler 3-) Koagulasyon mekanizması (Kanbak 2005) Kanamanın durması için bu 3 bileşenin normal fonksiyonunu göstermesi gerekmektedir Damar bütünlüğü: Damarların çeperleri endotel hücreler ile çevrelenmiştir. Endotel hücreleri, hemostaz-pıhtılaşma sisteminin çeşitli fonksiyonlarını düzenlemektedirler. Bir yandan antitrombosit, antikoagulant ve diğer fibrinolitik özelliklere sahip iken diğer taraftan pıhtılaşmayı başlatıcı fonksiyonları vardır. Travmadan sonraki 1 2 saniye içinde refleks olarak zedelenen damarda oluşan vazokonstriksiyon o damarda kan akımının yavaşlamasına neden olur (Celkan vd 2005). Antitrombosit etkileri; sağlam endotel trombositleri ve pıhtılaşma sistemi proteinlerini şiddetli trombojen etkiye sahip olan subendotelyal yapılardan özellikle kollajenden yalıtır. Kan akımı içindeki trombositler endotele yapışmazlar. Bu antitrombositer etki, prostaksiklin yapımına ait olmayıp endotelin plazma membranın iç yüzüne ait olarak görülmektedir. 8

22 Antikoagülant özellikler, bu özellik membrana ilişik heparin benzeri moleküller ve özgün bir trombin reseptörü olan trombomodulin tarafından oluşturulur (Cotran vd 1994). Heparin benzeri moleküller etkilerini dolaylı olarak yaparlar. Bunlar trombini ve Faktör Xa da dâhil olmak üzere birçok başka pıhtılaşma faktörünü inhibe eden, serumda doğal olarak bulunan anti-koagülant protein olan anti-trombin in etkisini güçlendirir. Trombomodulinde dolaylı etki gösterir, trombine bağlanır ve bu şekilde onu pıhtılaşmayı sağlayan bir faktörden pıhtılaşmayı engelleyici bir faktöre dönüştürür. Trombomoduline bağlanan trombin, güçlü bir antikoagülan olan Protein- C yi aktive eder. Aktive olan protein-c, Faktör Va ve VIIIa yı enzimatik olarak parçalar ve pıhtılaşmayı inhibe eder. Endotel hücreleri tarafından sentez edilen Protein-S, Protein- C nin antikoagulan etkisine kofaktör olarak yardım eder ( Cotran vd 1994) Trombositler: Trombositler yuvarlak ya da oval, 2 4 mikron çapında küçük disk şeklinde hücrelerdir. Kemik iliğinde megakaryositlerden oluşurlar. Megakaryositler kemik iliğinde hematopoetik serinin en büyük hücreleridirler. Kemik iliğinde ya da kana geçtikten bir süre sonra özellikle pulmoner kapillerden geçmeye çalışırken parçalanarak trombositleri oluştururlar. Trombositlerin kanda normal konstrasyonları milimetreküpte dir (Guyton vd 1996). Tespit edilmiş ve uygun bir boya ile boyanmış olan trombositlerin içinde spesifik 3 tür granül bulunur. Bunlardan ilki olan alfa granülleri; fibrinojen, fibronektin, trombosit kökenli bir büyüme faktörü (PDGF), von Willebrand faktörü (vwf) ve diğer pıhtılaşma faktörlerini içerir. İkinci tip olan granül elektron yoğun cisimcikler olup Ca², adenin nükleotidleri (adenozin difosfat, adenozin trifosfat) iyonize kalsiyum, histamin, serotonin ( 5- hidroksitriptamin) ve epinefrinin metabolizma dışı birikiminin depolama yerini oluştururlar. Üçüncü tip granül ise lizozomal granül olup hidrolitik enzimler taşır (Perry vd 1999, Smith 2007). Trombosit hücre zarı, kollajen ve vwf ye bağlanan, tombositin subendotele yapışmasını sağlayan glikoproteinler içerir. Trombosit yüzeyinde en çok bulunan glikoproteinler, glikoprotein IIa ve IIb dır. Heterodimer olan bu iki glikoprotein fibrinojen, vwf ve 9

23 fibronektin gibi adhesiv proteinler için reseptör görevi yapar. IIa- IIb kompleksi integrin ailesinin bir üyesidir (Perry vd 1999 ). Bir damarın zarara uğramasıyla birlikte trombositler, subendotelyal kollajen, kapiller bazal membranı, fibroblastlar ve düz kas hücreleri gibi damar duvarının birçok elemanı ile temas ederler. Bunların hepsi trombosit yapışmasına neden olmakla birlikte, en kuvvetli uyaran kollajendir. Kollajenle temas eden trombositler; 1- Yapışma, 2- Serbestleştirme reaksiyonu ve 3-Kümeleşme olarak sıralanabilecek bir dizi reaksiyona uğrarlar. Bunların tümüne birden trombosit aktivasyonu adı verilir. Trombositin kollajene yapışması büyük ölçüde endotel hücrelerden ve megakaryositlerden sentezlenen bir protein olan vwf bileşeni sayesinde olur. Bu büyük molekül, trombositin yüzey reseptörleri özellikle glikoprotein IIb ile açığa çıkan kollajen arasında köprü işlevi görür (Cotran vd 1994). Trombositlerin subendotelyal kollajene yapışmalarını hemen ADP, serotonin ve diğer çeşitli trombosit içeriğinin serbestleştiği sekresyon izler. ADP salınımı özellikle önemli bir olaydır, çünkü ADP trombosit kümeleşmesine neden olur ve aynı zamanda diğer trombositlerden ADP salgılanmasını artırır. Böylece giderek büyüyen bir trombosit kümesinin oluşmasına yol açarak, kendi kendini yineleyen bir mekanizma kurulmuş olur. Başlangıçta trombosit kümeleşmesi geri dönebilir niteliktedir, dolayısıyla damar duvarındaki hasar geçici bir hemostatik bir tıkaç ile kapatılır. Fakat çok geçmeden trombosit, tromboxan A2 ve artan miktardaki ADP nin etkisi altında trombositler sıkışır ve kalıcı bir trombosit kümesi oluştururlar ve pıhtılaşmanın son ürünü olan fibrin, kümeleşmiş trombositleri birbirine kaynaştırır (Cotran vd 1994, Marks Basic Medical Biochemistry A Clinical Approach). Tromboxan A2 trombositler tarafından sentezlenen bir prostaglandindir ve prostaksiklin (PGL2) gibi araşidonik asit metabolizmasının siklooksijienaz yolunun bir ürünüdür. Tromboxsan A2 (TXA2) ve prostaksiklin (PGL2) ters etkilere sahiptir. Prostaksiklin, trombosit kümeleşmesini inhibe eder ve damarları genişletir, oysa Tromboxsan A2 güçlü bir kümeleştirici ve damar daraltıcıdır. TXA2 ve PGL2 karşılıklı rolleri, insanda trombosit fonksiyonunun düzenlenmesinde, normal koşullarda trombosit kümeleşmesini ve 10

24 pıhtılaşmayı önleyen, endotel hasarı oluştuğunda ise hemostatik tıkacın oluşmasını sağlayan hassas bir denge kurar (Smith 2007,Cotran vd 1994) Pıhtılaşma Sistemi: Kanın dolaşımda sıvı olarak kalmasını sağlayan fizyolojik mekanizmanın en önemli ve son bileşenidir. Kanın pıhtılaşmasındaki esas olay, çözünebilen plazma proteini olan fibrinojenin kısmen çözünmeyen iplikçikler halindeki fibrin proteinine dönüşmesidir. Pıhtılaşma proteinleri dolaşımda zimojen denilen inaktif halde bulunurlar. Pıhtılaşmanın başlamasıyla sınırlı bir proteolize uğrayarak aktif hale dönerler. Bu aktif proteinler diğer zimojenleri aktifleştiren bir zincirleme olayı başlatırlar ve en sonunda çözünebilen plazma proteini olan fibrinojen kısmen çözünmeyen iplikçikler halindeki fibrin proteinine dönüşerek pıhtı oluşur (Celkan vd 2005). Pıhtılaşma mekanizması, intrinsik, ekstrinsik ve ortak yolak olmak üzere üç sisteme bağlı olarak gelişir. İntrinsik yolak, kanda bulunan prokoagülan yapıların aktive olması ile başlar. Ekstrinsik yolak, protein kofaktörlerini ve enzimleri içermektedir ve doku faktörünün aktive olması ile başlamaktadır. Ortak yolak ise hem intrinsik hem de ekstrinsik yolakta Faktör X un aktivasyonu ile başlamaktadır (Riddel vd 2007) Ekstrinsik Yolak: Doku faktörü aktivasyonu ile başlamaktadır. Doku faktörü pek çok hücre tipinin integral membran proteinidir. Normal koşullar altında kan ile karşı karşıya gelmez. Travma sonucu açığa çıkan doku faktörü(tf), doğrudan Faktör VII ile kompleks oluşturur ve Faktör VIIa şeklinde aktive eder. TF membran proteini olduğundan Doku faktörü-faktör VIIa kompleksi membran yüzeyine yapışır. Bu yapışma pıhtılaşma mekanizmasının sadece bölgesel olarak gerektiği yerde aktive olduğunu göstermektedir. Daha sonra oluşan bu yapı kalsiyum ve fosfolipid varlığında Faktör IX u Faktör IX a ya ve Faktör X u, Faktör Xa ya aktive eder (Green 2006, Ferhanoğlu 2003, James vd 1999). 11

25 Şekil 2.4. Pıhtılaşma mekanizmasını başlatan ekstrinsik yol İntrinsik Yolak: İntrinsik yolağın uyarılması Faktör II nin bozulmuş damar duvarı veya negatif elektrik yüklü yüzeyle aktifleştirilmesi ile olur. Bu yolda en önemli rolü FXII oynamaktadır. Faktör XII nin aktifleştirilmesine yardımcı olan kofaktörler arasında prekallikrein, yüksek molekül ağırlıklı kininojen ( YMAK) ve Faktör XI bulunur. Faktör XIIa, Faktör XI yı aktif şekli olan FXIa ya ve prekallikreinin aktif şekli olan kallikreine dönüştürür. Ayrıca FXIa, YMAK kofaktörlüğünde FIX i FIXa ya aktifleştirmektedir. FIXa, FVIII eşliğinde FX u FXa şeklinde aktifleştirir (Riddel vd 2007, Ferhanoğlu 2003). 12

26 Şekil 2.5. Pıhtılaşma mekanizmasını başlatan intrinsik yol Ortak Yol: Hem ekstrinsik hem de intrinsik yolak tarafından aktifleşebilen Faktör Xa, Faktör Va ile birlikte yine fosfolipid ve Ca varlığında protrombini (FII), trombine (FIIa) ya dönüştürür. Oluşan trombin, fibrinojeni fibrine çevirir, trombosit agregasyonunu artırır, Faktör XIII ü aktive eder. Aktive olan FXIII, fibrin monomerleri arasındaki kovalent bağları güçlendirerek fibrini daha dayanıklı hale getirir. Trombin aynı zamanda güçlü bir antikoagülan ve profibrinolitik olan Protein C nin aktivasyonunu sağlar (Guyton vd 1996) Pıhtılaşma Mekanizmasının Kontrolü Koagülasyon mekanizması; negatif ve pozitif geri besleme reaksiyonları, çoklu enzim sistemleri, humoral ve hücresel prokoagülant ve antikoagülantları içinde barındıran karmaşık bir reaksiyon dizisidir (Ulutin 1986). Herhangi bir sebeple pıhtılaşma mekanizması aktive olduğunda bunun kontrolü gerekmektedir. Koruyucu mekanizmalar 13

27 devreye girmezse kontrolsüz koagülasyon tehlikeli tromboza neden olmaktadır. Bu nedenle pıhtılaşma mekanizması aktive olduğu andan itibaren, bunu kontrol eden mekanizmalarda aktive olmaktadır. Bu mekanizmalardan ilki: Feed-back İnhibisyon: Kan koagülasyonunda feed- back inhibisyonunun klasik örneği vücutta trombinin duyarlı kontrolüdür. Trombin, koagülasyonun başlangıcında çok düşük konsantrasyonlarda olduğu için, FV ve FVIII in oluşum ve aktivitesi üzerine pozitif bir etkisi vardır. Koagülasyonu ilerletmek için bu kritik kofaktörün aktivitesini uyarır. Koagülasyon ilerledikçe, daha yüksek konsantrasyonlarda trombin oluşmaya başlar. Trombin FV ve FVIII in oluşumunu otokatalitik olarak düzenler. Böylece trombinin oluşumu, hem pozitif hem de negatif feed- back yoluyla koagülasyonun ilerlemesini ya da inhibisyonunu sağlar (Ateş 2001). Koagülasyondaki benzer etkileşimler FXa-FVIII, FXIII, trombin- FXIII, FXII in aktivasyonu ve prekallikreinin kallikreine dönüşümü arasında gözlenir (Ateş 2001) Fibrinolitik Sistem: Kan akımının ve damar açıklığının yeniden sağlanabilmesi için, fibrinin bir serin proteaz olan plazmin tarafından proteolitik olarak parçalanmasını sağlayan fizyolojik süreçtir (Francis vd 1987). Plazminojen, doku sıvılarında ve kanda bulunan beta globulin yapısında bir proenzimdir. Fibrinolitik sistemin, major aktivasyonu endotelyal hücrelerden salınan doku plazminojen aktivatörü ile (tpa) ile olmaktadır. tpa, karaciğerde sentezlenen, serin proteazdır ve fibrine bağlanır. Bu bağlanma plazminojenin plazmine çevrilme kapasitesini artırmaktadır (Bithel 1993) Doğal İnhibitörler: Üç tip doğal antikoagülant pıhtılaşma reaksiyonunu düzenler ve sınırlarlar. Antitrombin III(ATIII), trombin ve FIXa, FXa, FXIa ve FXIIa gibi diğer serin proteazları inhibe edici özelliğe sahiptir. Antitrombin endotel üzerindeki heparin benzeri moleküllere bağlanarak aktive olur (Riddel vd 2007). 14

28 Protein C, Protein S: FVa ve FVIIIa yı inaktive yetenekleri belirlenen vitamin K bağımlı iki proteindir ve pıhtılaşma sisteminde reaksiyon hızlandırıcılar olarak görev alırlar. Protein C endotele ilişkin trombomodulin tarafından aktive edilir (Riddel vd 2007 ) Endotel: İnhibitör mekanizmalarından önemli biri TF ve FVIIa aracılığı ile başlayan pıhtılaşmanın aktivasyonunun doku faktör yolağı inhibitörü olan ( TFPI) aracılığı ile inhibe edilmesidir. TFPI, mikrovasküler endotel hücreler tarafından sentez edilir ve endotelde, plazmada, trombositlerde depolanır. TFPI; TF-FVIIa kompleksinin inhibitörüdür, bu kompleksin enzimatik yapısını ortadan kaldırır (Ferhanoğlu 2003). 15

29 2.5. Tromboz Devamlılığı bozulmamış kalp damar sistemi içersinde pıhtılaşmış bir kan kitlesinin oluşması tromboz olarak bilinir ve kitlenin kendisine trombüs denilmektedir. Kanın pıhtılaşması yırtılmış bir damara tıkaç oluşturduğunda hayat kurtarıcı olabilir, yaşamsal bir yapıyı besleyen damarı tıkadığında ise yaşamı tehlikeye sokabilir. Ayrıca trombüsün bir bölümü ya da tamamı kopup ayrılarak, kan akımı ile uzak bölgelere sürüklenen bir embolus oluşturabilir (Cotran vd 1994). Trombozun fizyopatolojik tanımı ilk olarak 1856 yılında Rudolph Virchow tarafından yapılmış ve Virchow Triadı olarak kabul edilen damar hasarı, kan akımında yavaşlama(staz), kanın bileşimindeki değişiklikler olarak belirlenen üç faktörün tromboz oluşumunda etkisi olduğu ileri sürülmüştür (Rosendal 1999). Tromboz gelişimine birden çok faktör sebep olmaktadır. Çok sayıda edinsel ve kalıtsal faktör değişik mekanizmalar ile tromboz gelişimine neden olmaktadır. Arteriyel ve venöz sistemde tromboz gelişimi farklı şekilde seyretmektedir. Arteriyel sistemde, endotel hasarı ve trombositlerin fonksiyonel bozukluklarının önemli rol oynadığı, venöz sistemde ise daha çok kan akımındaki değişiklikler ve pıhtılaşma sistemine ait bozuklukların tromboza neden olduğu bilinmektedir (Rosendal 1999). Venöz trombozların çoğu tıkayıcı trombozlardır. Bu trombozların büyük bir bölümü yüzeysel veya derin bacak venlerinde ortaya çıkar. Venöz tromboz, kan akımının yavaşladığı veya türbülan olduğu büyük venlerde veya sinüslerde çoğunluğu fibrin, ve eritrositlerden, daha az oranda lökosit ve trombositlerden oluşan kırmızı tıkaçlar şeklinde meydana gelmektedir (Baykal vd 1999, Hoffman vd 2003). Arteriyel sistemde oluşanlar ise, beyaz tıkaçlar adı verilen pıhtılar asıl olarak fibrin lifleri ve trombosit içerir. Venlerde kan akımı yavaş olduğu için venöz trombozların gelişmesi arteriyel trombozlara göre daha sıktır. Arteriyel trombozlar genellikle, miyokard enfarktüsü, romatizmal kalp hastalığı, ağır aterosekleroz, aort ya da diğer büyük arterlerde anevrizması olan hastalarda gelişir (Baykal vd 1999, Hoffman vd 2003). 16

30 Çizelge 2.1.Kalıtsal ve Edinsel Trombotik Risk Etmenleri Kalıtsal Risk Etmenleri Edinsel Risk Etmenleri AT eksikliği Protein C eksikliği (PC) Protein S eksikliği (PS) APC direnci (FV 1691 G-A) Protrombin G-A Plasminojen Eksikliği Trombomodulin defekti Lipoprotein (a) yüksekliği Hiperhomosisteinemi Faktör VIII yüksekliği Faktör IX yüksekliği Faktör XII yüksekliği Faktör XI yüksekliği Disfibrinojenemi Heparin Kofaktör II yüksekliği Yaşlılık Obezite Hipertansiyon Genel Cerrahi Girişimi Travma Lipoprotein (a) yüksekliği Varisler Gebelik Diabetis mellitus İnfeksiyonlar Kan protein bozuklukları Hareketsizlik Hipertrigliseridemi Varisler Aşırı sigara tüketimi Kalıtsal Tromboz Risk Faktörleri Antitrombin (AT) III Eksikliği Antitrombin, trombin inhibitörü olarak pıhtılaşma sisteminde doğal antikoagülant olarak önemli bir rol oynar. FXa, FIXa, FXIa gibi serin protezları da dönüşümsüz olarak zamana bağlı inhibe etmektedir. AT III, FVIIa-doku faktörü kompleksinin ayrılmasını hızlandırarak FVIIa nın fizyolojik inhibisyonun da önemli rol oynar (Baykal vd 1999). Dolayısıyla fibrin oluşumunda en güçlü inhibitördür. Heparin varlığında bu inhibisyon yaklaşık olarak 1000 kat artmaktadır (Ulutin 1991, High 1988 ). 17

31 ATIII, ilk kez Brinkhousc vd. (1939) tarafından tanımlanmıştır. ATIII, insan plazmasında 196 g/mol olarak bulunan, karaciğerde sentezlenen mol ağırlığında alfa 2 globulindir. 1.kromozomun q23 25 bölgesinde konumlanan bir gen tarafından kodlanmaktadır (Pratt 1991). ATIII eksikliği kalıtsal ve edinsel olarak görülmektedir. Kalıtsal olarak ATIII eksikliği olan kişide, venöz tromboz ve pulmoner emboli riski artmaktadır (Ferhanoğlu 2003). Kalıtsal olarak otozomal dominant kalıtım gösteren bir hastalıktır. Heterozigot ve homozigot şekli tanımlanmıştır ve homozigot şekli yaşam ile bağdaşmaz (Nachamn vd 1993). Kalıtsal ATIII eksikliği iki ana tipe ayrılarak incelenmektedir. Tip I eksiklikte, ATIII, molekülü biyolojik olarak az sentezlenmektedir. Miktar azlığına bağlı olarak fonksiyonel aktivitesi de düşmüştür. Bu bozukluğun moleküler temelini ya AT III geninin başlıca sentezinde bir delesyon, yaygın bir şekilde küçük insersiyonlar / delesyonlar ya da tek baz değişiklikleri oluşturmaktadır ( Bick 1998). Tip II eksiklikte ise, genin bazı özel bölgelerinde defekt sonucu varyant ATIII molekülü oluşmaktadır. ATIII molekül olarak normaldir fakat fonksiyonu bozuktur. Bu varyantlar; Tip II RS reaktif bölge üzerine etkili defekt (reaktif site), Tip II HBS, heparin bağlayıcı üzerine etkili defekt (heparin binding site) ve Tip II PE, çoklu fonksiyonel defekttir (Esmon 2001). ATIII eksikliğinin sıklığı, genel populasyonda %0,02, trombozlu olgularda ise %1 dir (Akar vd 2005). Antirombin III eksikliği, Protein C ve Protein S yetersizliğinden daha ciddidir. 18

32 Protein C (PC) Eksikliği Mammen vd (1960) tarafından tanımlanan PC, hemostazın düzenlenmesinde rol oynayan, karaciğerde sentezlenen dalton molekül ağırlığında vitamin K bağımlı bir proteindir. Protein C molekülünü kodlayan gen 2.kromozomun q13 14 bölgesinde konumlanan 11 kb uzunluğundadır ( Mammen vd 1960, Broze vd 1994). Plazmada inaktif preküsör halde (zimogen) halde bulunmaktadır. Protein C nin aktivasyonu damar duvarındaki trombin tarafından olmaktadır. Trombin burada pıhtılaşma sistemindeki rolünden tamamen farklı bir fonksiyon göstererek Protein C yi aktive eder. Sağlam endotel yüzeyindeki bu trombin, trombomodulin olarak bilinen endotel hücre reseptörüne yüksek afinite ile bağlanır. Bu reaksiyon sonucunda trombin fibrinojeni fibrine çevirme yeteneğini kaybeder (Ferhanoğlu 2003). Trombomoduline bağlı trombin, bağlı olmayandan kat daha etkilidir. Aktive protein C (APC), FVa ve FVIIIa yı parçalar ve inaktif hale getirir. Böylece pıhtılaşma engellenmiş olur. Bu proteolitik etki diğer vitamin K bağımlı Protein S varlığında önemli derecede artmaktadır (Dahlbäck 1995). Kalıtsal ve edinsel şekilde eksiklik görülmektedir. Kalıtsal Protein C eksikliği otozomal dominanttır ve iki tipi gözlenmektedir. Kantitatif veya Tip I,Protein C nin hem antijen hem de aktivitesi normalin %50 si kadardır (Sayınalp 2007). Tip II de ise antijenik protein C miktarı normal fakat protein C molekülü bozuk ve işlevsizdir (İliçin 1996, Esmon 2001). Protein C eksikliği olan hastaların çoğu Tip I heterozigottur (Ateş 2001). Venöz tromboembolisi olan hastaların %2 5 inde protein C eksikliği saptanmıştır. Bu sıklık genç ve tekrarlayan vakalarda %10 15 e çıkmaktadır. Kalıtsal PC eksikliğinin sıklığı trombozlu vakalarda % 3, populasyonun genelinde ise %0,2 dır (Akar vd 2005). 19

33 Edinsel protein C eksikliği nedenleri ise, sentezi karaciğerde ve K vitamini bağımlı olduğu için, K vitamini eksikliğinde, karaciğer hastalıklarında plazma düzeyi azalmaktadır. Yaygın damar içi pıhtılaşma, yaygın derin ven trombozu, ağır infeksiyonlar ve kronik böbrek yetmezliği de eksikliğe sebep olabilmektedir (Sayınalp 2007, Lane 1996). Şekil 2.6. Protein C yolağı Protein S (PS) Eksikliği İlk kez 1977 yılında bulunan PS, molekül ağırlığı dalton olan K vitamini bağımlı bir proteindir. Karaciğerde, endotel hücrelerinde, megakaryositlerde ve testis Leyding hücrelerinde sentezlenir. Protein S molekülünü kodlayan gen 3. kromozomun p11,1 11,2 bölgesinde konumlanan 80 kb uzunluğundadır. PS, normalde plazmada ve trombositlerin alfa granüllerinde bulunur. Plazmada iki şekilde bulunmaktadır. Yaklaşık %35 50 si kompleman düzenleyici protein C4b- bağlayan protein C4b-BP ile bağlıdır ve inaktifdir diğeri serbesttir ve kofaktör aktivitesine sahiptir. Serbest PS, APC' nin FVa ve FVIIIa ' nın inaktivasyonunda kofaktördür (Furmaniak-Kazmierczak 1993, Atakan 2006). 20

34 Kalıtsal Protein C eksikliği otozomal dominanttır ve 3 tipi mevcuttur. Tip I, toplam ve serbest PS miktarları azalmıştır ve fonksiyonu bozuktur. Tip II PS eksikliğinde, toplam ve serbest miktarları normal fakat fonksiyonu bozuktur. Tip III PS eksikliğinde ise, toplam PS miktarı normal, serbest azalmış ve fonksiyonu bozuktur. Kalıtsal PS eksikliğinin sıklığı trombozlu vakalarda %1,2, populasyonun genelinde ise 0,1 dır (Akar vd 2005) Artmış FVIII, FIX ve FXI Düzeyleri FVIII, FIX ve FXI düzeylerinin artmasıyla tromboza yatkınlığın artmasını bildiren raporlar mevcuttur. Pediatrik tromboembolizmli hastalarda sıklık %63 normalde ise %11; FIX yüksekliği normal bireylerde %2, Türk pediatrik trombotik hastalarda ise %5,5 dir (Akar vd 2005). Derin ven trombozu olan hastalarda FVIII düzeyinin yüksek olduğu ve bu durumun ailesel olabileceği bildirilmektedir, fakat henüz FVIII düzeyinde artışa sebep olabilecek bir mutasyon tespit edilememiştir Trombomodulin Trombomodulin, 1981 yılında Esmon ve Owen tarafından bulunan, beyin kapiller endoteli hariç tüm endotel hücre yüzeyine yerleşmiş integral bir proteindir. Trombomodulin geni, 20. kromozomun p12 bölgesinde konumlanmış olup, 3,7 kb uzunluğundadır ve intron içermemektedir. Molekül ağırlığı dalton olan trombomodulin, kalsiyum iyonları varlığında trombine bağlanır (Ermiş 2006). Trombomodulin, pıhtılaşma sistemini üç yol ile etkilemektedir. Birincisi PC nin trombin ile aktivasyonunda kofaktör olarak rol oynamakta ve PC aktive edilmesini 1000 kat 21

35 artırmaktadır. İkincisi trombomodulin trombini bağlayarak pıhtılaşma sisteminde trombinin diğer basamaklardaki etkisini yok eder ve büyük moleküller üzerindeki proteolitik etkisini engeller. Üçüncüsü ise, yapısında galaktozaminoglakin içerdiğinden ATIII yolu ile trombinin inaktivasyonunu artırmaktadır (Esmon 1987,Lawrence 1986). Trombomodulin geni üzerinde, işlevsel eksikliğe yol açan, bir mutasyon tromboembolik hastalık riskini artırmaktadır ( Ermiş 2006) Lipoprotein (a) Yüksekliği Lip (a), LDL metabolizmasından bağımsız olarak karaciğerde sentezlenmektedir. 6. kromozomda plazminojen genine çok yakın bir konumda bulunmaktadır. Lipoprotein, apoproteine bağlanır. Normal şartlar altında yüksek lipoprotein (a) seviyesinin erişkinlerde kalp damar hastalıklarına neden olduğu bilindiği gibi, antifibrinilotik etkisinden dolayı venöz trombozlar için risk faktörü oluşturduğu bilinmektedir (Celkan vd 2005). Çocukluk çağında 30 mg/dl üzerindeki Lip (a) düzeyi inme riskini 1,6 kez artırmaktadır. Lip (a) sıklığı normal bireylerde %13, trombozlu hastalarda ise % 30 dur (Akar vd 2005) Faktör V geni ve Faktör V Leiden Mutasyonu (1691 G-A) Cripe vd (1992) tarafından tanımlanan Faktör V, molekül ağırlığı dalton olan tek zincirli bir glikoproteindir. Karaciğer, megakaryositler ve lökositler tarafından üretilmekte olup trombositlerin, endotel hücrelerin ve monositlerin yüzeyinde bulunmaktadır. FV in % 80 i plazmada serbest halde, %20 si ise trombositlerde bulunmaktadır. Faktör V geni 1.kromozom q21 25 bölgesinde konumlanan 25 ekzona sahiptir ve olgun proteini 2196 aminoasitten oluşmaktadır (Segers vd 2007). FV domain yapısı sırayla A1-A2-B-A3-C1-C2 olan çeşitli tipte internal tekrarlar ile oluşmuş proteinlerden oluşmaktadır. A,B,C domainleri sırasıyla 350,836 ve 150 aminoasit içermektedir (Cripe vd 1992). Bunlar içerisinde pıhtılaşmadan sorumlu olan B alt birimidir. Trombin tarafından aktifleştirilir. Oluşan FVa, N- terminal ve C- terminal 22

36 kısımlardan oluşan heterodimerik bir yapıdır. Her iki alt birim Ca iyonu ile nonkovalent bir şekilde bir arada tutulmaktadır (Cripe vd 1992, Sılan vd 2004). Şekil 2.7. Kromozom 1 FV proteini, koagülasyon mekanizmasının hem intrinsik hem de ekstrinsik yolaklarında kofaktör olarak görev yapmaktadır bu sebepten Janus yüzlü protein olarak ta bilinmektedir. (Segers vd 2007). İntrinsik mekanizmada FXa ve trombosit fosfolipitleri ile, ekstrinsik mekanizmada ise doku tromboplastinin bir parçası olarak sentezlenen fosfolipit ve FXa ile birleşerek protrombin aktivatörünü oluşturur, bu kompleks de protrombini trombini dönüştürür. Pıhtılaşma kaskadının aktive olmasıyla ortaya çıkan trombin bir yandan fibrojeni fibrine dönüştürürken, diğer yandan endotel bir membran proteini olan trombomoduline bağlanır. Bu olay trombinin prokoagulan formdan antikoagülan bir forma dönüşmesine yol açar. Daha sonra trombin, Protein C yi aktive eder. Protrombin aktivatör kompleksi içinde FV tek zincirli ve inaktiftir. Pıhtılaşma başlayınca FV molekülü; trombin tarafından, B bölgesindeki, Arg 709- Ser 710, Arg1018-Thr 1019, Arg1545-Ser 1546 noktalarından kesilerek aktive edilir. Tek zincirli FV molekülü, birbirlerine Ca² iyonları ile bağlı olan çift zincirli aktif molekül haline dönüşür ( Haliloglu 2004). Aktive edilmiş Protein C, FVa ve FVIIIa yı inaktive ederek kanın pıhtılaşmasını düzenleyen bir serin proteaz enzimidir. APC, FVa proteinini 679, 506' daki Arginin bölgelerinden keserek inaktive eder, FVa ilk önce 506 dan sonra 306 dan kesilerek inaktive olur (Sılan vd 2004). 23

37 Bertina vd (1994) tarafından FV gen bölgesinde 10. eksonda bir nokta mutasyonu (G1691A) tanımlanmıştır. Bu değişim FV molekülünde aminoasit dizisindeki 506.sıradaki Argininin Glutamine dönüşmesine sebep olmaktadır. FV Leiden, R506Q ya da G506A şeklinde tanımlanmaktadır. Bu mutasyon APC tarafından tanınan majör proteolitik kesim bölgesini yok eder ve FV, APC ye karşı dirençli hale gelir fakat normal prokoagulant aktiviteye sahiptir (Sılan 2004) pozisyondaki mutasyona bağlı olarak FVL, normal FVa dan 10 kat daha yavaş inaktive edilmekte ve dolaşımda daha uzun süre kalarak hiperkoagülasyona sebep olmaktadır (Richard vd 1998). Faktör V Leiden mutasyonu taşıyan bireylerde venöz tromboz, periferal vasküler hastalıklar, inme, pulmoner embolizm görülme riski artmaktadır (Sılan vd 2004). Venöz tromboz riski heterozigotlarda normal populasyondakinin 5 10, homozigotlarda ise katına ulaşmaktadır (Madonna vd 2002). Venöz trombozlu hastalar arasında, FVL taşıyıcılığı tüm vakaların % 20 sinde, seçilmiş trombozlu hastların ise % 50 sinde görülmüştür (Segers vd 2007). Rosendaal vd (1995) heterozigot formda tromboz riskinin 7 kat artırdığını, homozigot formda ise 80 kat artırdığını rapor etmişlerdir. FV 1691 G-A gen değişimi farklı toplumlarda ve çalışma gruplarında tromboz kaynaklı hastalık ve ölümlere etki edebildiğinden dolayı ömür uzunluğu ile ilgili çalışmalara konu olmuştur. Literatürde bu gen değişiminin ömür uzunluğu üzerinde etkisi olduğunu ya da aksini bildiren birden çok çalışma mevcuttur. Bu mutasyonun sıklığı ülkeler ve toplumlar arasında farklılık oluşturmakla birlikte genel olarak %2 14 arasındadır. İngiltere ve ABD için %4 6, Flemenk toplumu için %2 4, İspanya ve İtalya da %2 civarında, İsveç toplumu için de % 7 bulunmuştur (Sılan vd 2004). Türk populasyonunda FVL (FV 1691 G-A) mutasyonu en sık mutasyonlardan biri olarak bildirilmiş ve sıklığı %7,9, Kıbrıslı Türkler de bu oran % 12,2 olarak bulunmuştur (Akar vd 1997 ). Yeni doğanlarda yapılmış iki çalışmada FVL taşıyıcı sıklığı % 10,9 olarak saptanmıştır (Akar 2009). 24

38 Mutasyonu otozomal dominant kalıtım göstermektedir. Mutasyonu taşıyan tüm bireylerde sağlık problemleri görülmeyebilir. Çizelge 2.2: Farklı Toplumlarda FV 1691 G-A Gen Değişimi Sıklığı Toplumlar Sıklık (%) Normal beyazlar 2 7 Zenci Afrika 0 Asya 0.1 Fas 1.1 Hollanda 2.9 Almanya 7.1 Polonya 5 Arjantin 5 İtalya 2.2 İsveç 7.0 İspanya 2.2 Japonya 0 Brezilya 2 Azerbaycan 14 Türkiye 7.9 Kıbrıs Türkleri

39 Protrombin Mutasyonu Protrombin veya FII karaciğer tarafından üretilen ve fibrinojenin fibrine dönüşümünde aktif formu anahtar görevi yapan, dalton molekül ağırlığında, vitamin K bağımlı bir zimojendir. Protrombin serin proteaz olan trombinin prekürsörüdür. Prokoagülan, antikoagülan ve antifibrinolitik aktivite göstermektedir (Simioni vd 2000). Protrombin geni 11.kromozom p11 12 bölgesinde konumlanan 21 kb uzunluğunda, 13 intron ve 14 ekzondan oluşan, olgun proteini 579 aminoasit içeren bir gendir. Poort vd (1996) tarafından genin translasyona uğramayan 3 bölgesine (3 -UTR) rastlayan nükleotid pozisyonunda normalde guanin nükleotidi bulunmakta olduğu bildirilmiştir. Bu nükleotidin adenine dönüşmesi G-A mutasyonu olarak tanımlanmıştır. Bu mutasyon Glutamin aminoasidinin Arjinine değişimine neden olmaktadır, mrna da 3 transle olmayan poliadenilasyon bölgesini etkilemektedir (Yılmazer vd 2000, Celkan 2005, Reznikoff vd 2001). Şekil 2.8. Kromozom 11 Protrombin, FXa/Va kompleksi tarafından 271. ve 320. pozisyonlardan kesilir. Böylece katalitik domain olan trombin ve plazma protrombin aktivasyonunun bir belirteci olan protrombin fragman 1, 2 oluşmaktadır. Trombin, fibrinojenin fibrine dönüşümünü katalizler, FV, VIII, VII, XI, XIII ve trombositleri aktive eder (Finkelstein 1972). Venöz tromboz oluşumu için orta derecede risk getiren bu mutasyonu taşıyan kişilerde plazma protrombin seviyesi yüksek bulunmuştur (Yılmazer vd 2000). Bu mutasyonun heterozigot formları, sağlıklı bireylerde % 2.3 oranında, venöz trombozlu hastalarda ise

40 oranında görülmektedir (Lopaciuk 2001). Eğer hasta kişi G-A mutasyonu ile birlikte Faktör V Leiden (FV 1691 G-A) mutasyonu veya PC eksikliği, Anti trombin III eksikliği taşıyorsa venöz tromboz riski daha da artmaktadır. Protrombin tek başına venöz tromboz için 3.8 kat risk getirir iken Faktör V Leiden (FV 1691 G-A) mutasyonu ile birlikte 20 kat risk getirmektedir (Van Domburg vd 2000). Fakat bu mutasyonun Faktör V Leiden (FV 1691 G-A) ile birlikteliği oldukça nadirdir (%0.076). Protrombin G-A mutasyonunu heterozigot olarak taşımak iskemik inme riskini 3.8 kat artırmaktadır (Lopaciuk 2001, Longstreth vd 1998). Protrombin G-A gen değişimi bugüne kadar yapılan araştırmalarda klinik olarak derin ven trombozu, serebral ven trombozu, oral kontraseptiflere bağlı trombüslerde özellikle 40 yaş altı miyokard infarktüslerinde olmak üzere 50 yaş altı grupta risk etmeni olduğunu belirtmişlerdir. Sebep olduğu bu hastalıklar PT G-A gen değişimini tromboz kaynaklı hastalıklar ve ölümler nedeniyle birden çok toplumda çeşitli araştırmalara konu olmasına sebep olmuştur. Protrombin G-A mutasyonunun Dünya nın değişik bölgelerinde yaşayan sağlıklı bireylerdeki sıklığını tespit etmek için yapılan çalışmada Kuzey Avrupa da ki mutasyon sıklığı %1,7 iken Güney de bu oran % 3 tür (Gürgey vd 1998). Japonya-Uzak doğu ve Afrika kökenlilerde çok nadir görülmektedir. Ülkemizde bu mutasyonun sıklığının sağlıklı kişilerde %2,7, derin ven trombozlu olgularda ise %6.25, Kıbrıslı Türklerde %8,1 oranında olduğunu göstermiştir (Akar 1999). Çizelge 2.3: Farklı Toplumlarda PT G-A Gen Değişimi Sıklığı Toplumlar Sıklık (%) Kuzey Avrupa 1.7 Güney Avrupa 3.0 Japonya- Uzak Doğu, Afrika 0,67 Türkiye 2.7 KKTC

41 Angiotensin Dönüştürücü Enzim (ACE) Gen Polimorfizmi Angiotensin dönüştürücü enzim çinko metalopeptidaz enzim ailesinden olup, akciğerlerde, endotel hücrelerinde ve plazmada bulunan bir glikoproteindir (Erdös 1990). Tüm memeli dokularının endotel hücreleri luminal yüzeylerinde ACE ifadelenir ve çözünebilir formda salınım olmaktadır. Akciğer ve beyin mikrovasküler ve kapiller hücreleri ACE bakımından zengindir. Vücutta su ve tuz kaybı olduğunda veya sempatik aktivasyon durumunda böbreğin juxtaglomerular aparatusundan renin salınımı meydana gelir. Bu da karaciğerde sentezlenen angiotensinojeni angiotensin I e dönüştürür. Angiotensin I ise birçok damarın endotelinde bulunan, pulmoner damarlarda ise yüksek konsantrasyonlarda bulunan ACE ile angiotensin II ye dönüşür. Angiotensin II ise adrenal korteksten aldosteron salınımını uyaran kuvvetli bir vazokonstriktördür (Baudin 2002, Turgut 2005). ACE, angiotensin I i angiotensin II ye dönüştürmesinden başka endotelyal yüzeyde vazodilatatör olan bradikinin parçalanmasını sağlayan ve bunun sonucu olarak vazoaktif peptid metabolizmasında önemli bir enzimdir (Soubrier vd 1993). Bradikinin damar düz kas hücrelerinin çoğalmasını inhibe eder ve nitrik oksit prostasiklin gibi vazodilatatörlerin endotelden salınımını inhibe eder. ACE, vazodilatatör bradikinin inaktivasyonunda birincil rol oynadığı için ve bu olayın kan basıncı ile elektrolit homoestazindeki önemi nedeniyle ACE inhibisyonun hipertansiyon ve konjestif kalp yetmezliği tedavisindeki başarısı bilinmektedir (Turgut 2005). ACE, aynı zamanda, PAI 1 ve t-pa arasındaki dengeyi de sağlamaktadır, bunu şu şekilde yapmaktadır, Ang I i Ang II ye dönüştürerek, PAI 1 üretimini artırır. Bradikinin yıkımını sağlayarak, t-pa üretimini inhibe eder. Bölgesel olarak PAI 1 üretiminin artması ve t-pa azalması ile ( ACE aktivitesinde artış) tromboz veya ateroskleroza eğilim artar. Angiotensin II renin- angiotensin sisteminin (RAS) önemli bir parçasıdır (Pehlivan vd 2008). RAS sistemi, homoestotik birçok olayda görev alan endokrin sistemidir, su-elektrolit dengesinin, kan hacminin ve arter kan basıncının düzenlenmesinde, fizyolojik düzeylerde devamının sağlanmasında görev alır. (Dzau vd 1988). RAS sistemi, volüm yetersizliği durumlarında aldestrona bağlı Na +1 seviyesinin artmasını sağlayarak, volümün uygun bulunduğu hallerde de aldestrona bağlı Na +1 seviyesinin azalmasını sağlayarak dolaşan kan miktarının sabit kalmasını sağlamaktadır. Angiotensin II hücrelerin yüzey reseptörlerine bağlanarak Ca +2 un hücreye girişini ve fosfolipid alışverişini uyarır. 28

42 Kandaki ACE düzeylerinin genetik olarak kontrol edildiği ilk kez Rigat vd (1990) tarafından bildirilmiştir. Angiotensin II hormonunun yapımında ve fonksiyonunda görev alan genler arasında Angiotensin Dönüştürücü Enzimini kodlayan ACE geni ve iki hücre yüzeyi reseptörleri yani Angiotensin tip I ve tip II reseptörlerini kodlayan AT1 ve AT2 genleri yer alırlar. ACE geni 17.kromozomun q23 3 bölgesinde konumlanmış, 21 kb boyutunda olup ve 26 ekzon ve 25 intron içermektedir. ACE geninde 78 polimorfizm belirlenmiştir bunların arasında en çok çalışılanı, ACE insersiyon/delesyon (I/D) polimorfizmdir. ACE genin 16. intronunda, 287 baz çiftlik Alu elementinin eklenmesi ve çıkarılması ile birbirinden farklı üç genotip oluşur. Bunlar DD, ID ve II dır (McKenzie vd 2001). Şekil 2.9. Kromozom 17 ADE gen bölgesinde I/D polimorfizmini sağlayan Alu elementi Alu ailesine ait bir elementtir. Alu ailesi, ismini AluI restriksiyon endonükleazı tarafından kesilen özgül nükleotit dizileri bulundurmaları nedeniyle almıştır. En önemli özellikleri, bç lik dizilerin her iki taraftan 7 20 bç lik tekrar dizileri ile çevrelenmiş olmalarıdır (Cömertpay 2007). Şekil Alu Elementinin ACE gen bölgesine girişi 29

43 ACE gen polimorfizmi insersiyon (I), ve delesyon (D) polimorfizmi içerir. II, ID ve DD genotiplerinin dağılımı etnik kökene bağlı olarak farklılık göstermektedir (McKenzie vd 2001). ACE etkinliğinin delesyon tipi polimorfizm için homozigot olan bireylerde (D/D) en yüksek, insersiyon tipi polimorfizm için homozigot olan bireylerde ise (I/I) en düşük olduğu, I/D heterozigotlarda ise ACE seviyesi orta derecede olduğu bilinmektedir. Dolayısıyla ACE düzeyi daha yüksek olan kişiler yani, D alleli için homozigot olan bireyler angiotensin II ye bağlı risklere daha fazla maruz kalırlar. ACE genindeki bu insersiyon/ delesyon a göre, II homozigotlar göre DD homozigotlar %65, ID heterozigotlar ise %31 daha fazla ACE ifadelenmesine sahiptir (Rigat vd 1990). I allelerde görülen düşük ACE aktivitesi, bradikinin yarı ömrünün artması ve anjiotensin II üretimindeki azalma, endotele bağlı artmış vazodilatasyon sebebiyle, ACE genotipinin fizyolojik önemi bilinmektedir Kalp dokusunda ACE aktivitesinin daha fazla olması, daha yüksek angiotensin II seviyesine ve böylelikle koroner arter hastalıklarına yol açmaktadır (Butler vd 1999, Turgut 2005) lı yılların başlarından itibaren, ACE D alelinin akut miyokard enfarktüsü, sol ventrikül hipertrofisi, ilerleyici diyabetik nefropati gibi birçok kalp ve böbrek hastalığı ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Türk toplumunda da koroner arter hastalığı ile D alleli arasında bir ilişki olabileceği saptanmıştır (Akar vd 1998). DD genotipli kişilerde, sol ventrikül dilatasyonunda, kalp yetmezliğindeki hastalarının mortalitesinde II genotipli kişilere göre, bir artış olduğu bilinmektedir (Anderson vd 1999). Arteriyel vazokonstriksiyona sebep olup kan basıncını da etkilenmesinden dolayı Angiotensin II hormonu kardiovasküler sistem için çok önemlidir. Yine delesyon alleli için homozigot olan kişilerde egzersizden sonra atrial natriüetik peptid (ANP) seviyesinin daha fazla olduğu yani kalpte sodyum düzeyini arttıran peptidin çoğaldığı ve kalp-damar problemlerin oluşma riskinin fazlalaştığı görülmüştür. Aynı zamanda Angiotensin II düz kas hücrelerinin büyümesi, göçü ve monosit/makrofaj aktivasyonunun sağlar İlaveten ACE, ateroskterotik plaktaki makrofaj ve düz kas hücrelerinde yoğun olarak gösterilmiştir. Erkeklerde, ACE genotipi ile diastolik kan basıncı arasında bir ilişki bulunduğunu bildiren çalışmalar olduğu gibi bunun aksini bildiren çalışmalar mevcuttur. ACE D allelinin, akut beyin iskemisi, sarkoidoz olgularında rolü olduğunu bildiren çalışmalar mevcuttur ( O Donnell vd 1997, Tiret vd 1998, Turgut 2005). 30

44 Sipahi vd. (2009) nın yaptıkları bir çalışmada 162 iskemik inme geçirmiş hasta ile 146 sağlıklı birey ACE I/D gen polimorfizmi bakımından incelendiğinde gruplar arasında belirgin anlamlı bir fark bulunamamıştır yılında yapılan bir çalışmada 108 iskemik inme hastası birey ile 79 sağlıklı bireyin ACE genotipleri belirlenmiş ve iskemik inme riski ile ACE genotipi arasında bir ilişki kurmaya çalışılmış ve sonuçta hasta bireylerde; DD %48, ID %43, II%17, sağlıklı bireylerde; DD %37, ID%30, II%12 olarak belirlenmiştir (Tuncer vd 2006). Akbulut vd (2004) yılında yapılan bir çalışmada, ACE gen polimorfizminin Türk toplumunda erken koroner arter hastalığının gelişiminde rol oynayan bir etken olmadığını bildirmişlerdir. ACE I/D gen polimorfizmi kalp ve damar hastalıkları oluşumunda için genetik risk etmenidir ve literatürde gen değişimlerini genotipde taşıyor olmanın uzun ömürde rol oynadığını ya da aksini bildiren çeşitli çalışmalar mevcuttur. Çizelge 2.4. Farklı Toplumlarda ACE I/D İnsersiyon/ Delesyon Polimorfizim Sıklığı Toplumlar % I allel sıklığı % D allel sıklığı Fransa 0,46 0,54 Almanya 0,46 0,54 ABD 0,44 0,56 Danimarka 0,45 0,55 İngiltere 0,45 0,55 Japonya 0,66 0,34 Tayland 0,70 0,30 Çin 0,60 0,40 31

45 Şekil Metiyonin, homosistein ve sisteinin kimyasal yapısı Homosistein Hücre içersindeki fazlalığı toksik olan birikimi damar endotelinin bozulmasına neden olan homosistein, protein yapısında olmayan sülfürlü bir aminoasittir. Esansiyel bir aminoasit olan metiyonin metabolizması sırasında oluşan bir ara üründür (Seshadri vd 2000, Ueland vd 2000). Homosistein sentezinde ilk basamak metiyoninden önemli bir metil vericisi olan S-adenozil metiyoninin (SAM) oluşumudur. SAM, S-adenozil homosisteine (SAH) e dönüştürülür. Bunun adenozil kısmının hidrolizi ile de homosistein oluşur (Dekou vd 2001). Şekil Homosistein- Metiyonin metabolizması 32

46 Metiyoninin göreceli eksikliğine ya da fazlalığına bağlı olarak homosistein transsülfürasyon ve remetilasyon yolaklarından birini kullanarak metabolize olur. Metiyonin depoları yeterli ise veya sistein sentezi gerektiği hallerde homosistein, vitamin B6 enzimler olan sistatyon-β sentaz (CBS) ve -sistatiyoninazin kataliz ettiği bir dizi tepkime ile sisteine dönüştürüleceği transsülfürasyon yolağına girer. Eğer metiyoninin korunması gerekli, ise homosistein remetilasyon yolağına girer. Remetilasyon iki yolak üzerine kurulmuştur. Birinci yolakta metiyonine, kobalamin (B12) bağımlı metiyonin sentetaz (MS) tarafından katalizlenen bir tepkime ile 5-metilentetrahidrofolattan bir metil grubunun aktarımı yolu ile dönüştürülür. 5- metilentetrahidrofolatın oluşumu, kofaktör olarak riboflavin (vitamin B2) gerektiren metilentetrahidrofolatredüktaz (MTHFR) tarafından katalizlenir. Diğer remetilasyon yolağında ise vitamin B12 ve folattan bağımsız olarak çalışmaktadır. Metil vericisi olarak betaini kullanmaktadır ve betain homosistein metil transferaz (BHMT) enzimi ile katalizlenir (Seshadri vd 2000,Sucu vd 2001,Ueland 1993). Folik asit, suda eriyen B grubu vitaminlerinde biri olup, pürin ve timidilat sentezi ile fosfolipidler, proteinler, DNA ve nörotransmitterleri içeren elzem biyolojik maddelerin metilasyonu için gerekli olan tek karbon ünitesini sağlamaktadır. Böylece nükleik asitlerin yapımı ve bazı aminoasitlerin birbirine dönüşmesi (serin, glisin ve homosisteinin metiyonine dönüşümü, histidinin glutamik asite katabolizması) sağlanmaktadır (Jacob vd 2000). Folat metabolizması iki önemli metabolik döngüde yer alır. Bunlardan bir tanesi DNA sentezi için pürin ve Timidin sentezi, diğeri ise bütün metiltransferaz reaksiyonlarındaki en önemli biyolojik metil verici olan SAM in sentezidir. Folat ve metiyonin döngüsünün bağlantısı, homosisteinin metiyonine dönüşümünü sağlayan reaksiyon ile kurulmuştur. Homosisteinin metionin sentaz enzimi yardımıyla metiyonine dönüşmesi için bir folat türevi olan B 12 (5-metiltetrahidrofolat) kofaktör olarak kullanılır. Metil grubu plazma folatın hücreye girmesinden kaynaklanır ve 5,10- metilentetrahidrofolatın MTHFR enziminin yardımıyla 5-metiltetrahidrofolat dönüşmesinde B 2 (riboflavin) gereklidir (Lee vd 1999, Trimmer vd 2001). İnsanlar, bitkiler ve mikroorganizmalar tarafından sentezlenen folatı bitkisel ve hayvansal kaynaklı besinlerle alırlar. Folat eksikliğinin erken dönemlerinde bulgu olmayabilir. Fakat homosistein gibi toksik metabolitler birikir ve düzeyleri artar. 33

47 Plazmada, total homosistein % 70 i proteinlere bağlanarak, % 25 i disülfid bağı ile birbirlerine bağlanarak( disülfid homosistein) ve % 5 i de homosistein tiolacton halinde bulunmaktadır. Plazma homosistein düzeyi standardize edilmemiş olmakla beraber, genellikle 5 15µ mol/l üzerindeki değerler hiperhomosisteinemi olarak kabul edilmektedir (Dikmen 2004). Çoçukluk döneminde yaşa bağlantılı olarak homosistein düzeyleri değişiklik göstermektedir. Altuntaş vd (2004), 177 sağlıklı çocukta yaptıkları çalışma sonucuna göre, ortalama toplam homosistein seviyesi belirlenmiştir (7.77 ± 4.13μmol/L). Homosisteinin genç çocuk ve adölesanlarda düşük iken yaşla artmakta olduğunu belirlemişlerdir. 1 6 yaş (3.87 ± 1.44μmol/L), 7-11 yaş (8.7 ± 1.4μmol/L) ve yaş (13.54 ± 1.49μmol/L). İleri yaşa bağlı olarak homosistein plazma seviyesi hafif artma eğilimi göstermektedir. Plazma homosistein seviyesi yaşa bağlı olarak hafif artma göstermektedir. Erkekler de homosistein miktarı kadınlara göre 1 μmol/l daha yüksek olabilir. Çünkü östrojen, total homosistein düzeyini, beslenme ve kas kitlesinden bağımsız olarak düşürmektedir. B vitaminlerinin düşük düzeyleri, sigara içimi, yüksek miktarda kahve alınımı ve düşük folat içeren diyetler plazma homosistein düzeyini azaltmaktadır (Dikmen 2004, Altuntaş vd 2004). Artmış plazma homosistein düzeylerinin damar tıkanıklığı için bir risk etmeni olabileceği çoğu araştırmacı tarafından desteklenmiştir. Hiperhomosisteineminin etkilediği birçok aterojenik mekanizma mevcuttur. Bunlara damar duvarının intima tabakasının kalınlaşması, damar intima tabakasındaki düz kas hücre proliferasyonunun uyarılması, damar duvarında lipid birikiminin artması, endoteliyal hücrelerin kopmasının zorlaşması, trombosit ve lökositlerin aktivasyonu, düşük dansiteli lipoprotein (LDL) oksidasyonunun artışı, platelet tromboxsan sentezinin aktivasyonu, homosistein oksidasyonu sırasında oluşan oksidatif hasarın artması örnek olarak verilebilir (Dikmen 2004). Mekanizması tam olarak bilinmemekle beraber, homosisteinin çeşitli düzeylerde damar endotel fonksiyon bozukluğuna neden olduğu kabul edilmektedir. Homosistein, Faktör V, X ve XII nin aktivitelerini hızlandırıp, Protein C nin aktivasyonunu baskılayarak, endotelin normal antitrombotik özelliğini değiştirir. Aynı 34

48 zamanda, endotelde trombodulin ve heparin sülfat salınımını baskılarken, doku plazminojen aktivatörleri salınımını uyarır. Böylece protrombotik bir ortam oluşturarak trombin oluşumunu hızlandırır (Sucu vd 2001, Reis vd 1995). Homosisteinin etkilerini oksidatif hasar yaratarak gösterdiğini ortaya koyan çalışmalarda mevcuttur. Homosistein plazmaya katılınca hızlıca disülfid homosistein veya homosistein tiolactona okside olur. Bu reaksiyon sırasında yan ürün olarak hidrojen peroksit ve süperoksit radikali gibi reaktif oksijen ürünleri oluşur. Oluşan hidrojen peroksit, damar endotelinde hasara neden olurken süperoksit radikalleri de, hem endotel hem de LDL partiküllerini etkileyerek lipid peroksidasyonunu başlatır (Dikmen 2004). Sağlıklı endotel hücreleri, homosisteinin toksik etkilerini ortadan kaldırmak için homosisteini bağlayan NO salgılar. NO nun bu koruyucu etkisi, endotelin uzun dönemli hiperhomosisteinemiye maruz kalması sonucunda bozulur. Çünkü homosistein, lipid peroksidasyonuna neden olarak endoteliyal NO sentaz salınımını azaltır. Sonuçta NO nun endoteliyal üretimindeki bozulma, endoteli, homosistein kökenli oksidatif hasara maruz bırakır ve endotelde fonksiyon bozukluğu ortaya çıkar. Homosisteinin, endoteliyal hasar oluşturarak aterosklerozu hızlandırmasına ek olarak, damar düz kas hücrelerinin aşırı çoğalmasına, ER daki katlanmış protein stresine de neden olduğu da açıklanmıştır (Reis vd 1995). Düşük dansiteli LDL lerden oluşan kolestrol esterlerinin birikimi, diğer mekaniksel, inflamatuar mekanizmalar veya hiperhomosisteinemi nedeniyle endotel hücreleri hasara uğrar. Kan monositleri, makrofaj, T lenfositleri endotel hasarının olduğu bu bölgeye tutunurlar ve orayı aşındırırlar. Sonuç olarak; subendotele bölgeye göç ederler. Orada lipid yüklü köpük hücrelerine dönüşürler. Bu lezyon bir yağ deposu olarak da adlandırılır. Çoğalan intimal düz kas hücrelerinin de buraya katılması ile damar içinde fibröz plak oluşur. Bu oluşuma ek olarak ortaya çıkan endotel yaralanması veya aşınması bu kısma trombositlerin tutunmasını sağlar. Sonuçta bu lezyon damar lümenine doğru genişler ve hem aterotromboz hem de embolinin bir kaynağını oluşturur (Bailey vd 1999). 35

49 Aynı zamanda yapılan hücre kültürü çalışmalarında, homosistein DNA nın hipometilasyonunun da kalp damar hastalıkları ve ilerlemiş yaşlarda ortaya çıkan hastalıklarda hücrenin fonksiyonunu yitirmesine, parçalanmasına ve kanser oluşumuna sebep olabildiği gözlenmiştir. Bu da genellikle 677TT homozigot mutant genotipli bireylerde gözleneceği hipotezini desteklemektedir (Mattson vd 2002). Plazma homosistein düzeyinin orta derecede artışlarının; serebral, koroner ve periferal damar hastalıkları ile ilişkisi olduğu bilinmektedir (Hanratty vd 2001). Homosisteinin kalp damar hastalıkları için bağımsız bir risk faktörü olduğu ve her 5µmol/L lik artışın kalp damar hastalık riskini erkeklerde 1.35, kadınlarda ise 1.42 kat arttırdığı bildirilmiştir (Dikmen 2004). Aynı zamanda homosistein düzeyinde 5 µmol/l lik bir artış total kolestrol düzeyinde 20 mg/dl lik artışa denk düzeyde kronik arter hastalıkları için risk getirmektedir (Kullo vd 2000). Homosistein yüksekliğinin, trombozis, inme, miyokard infarktüsü ve kronik renal yetersizlik için önemli bir risk faktörü olduğu birçok çalışmada bildirilmiştir (Engbersen vd 1995). Homosistein düzeylerini etkileyen birden çok faktör mevcuttur. 1) Metabolizmadaki genetik bozukluklar (CBS eksikliği, MTHFR eksikliği, MS eksikliği) 2) Kronik hastalıklar ( kronik böbrek yetmezliği, akut lenfoblastik lösemi, diabet) 3) Vitamin yetersizliği ve beslenme bozuklukları (vitamin B12, folat, vitamin B6) 4) Kişisel özellikler (ileri yaş, cinsiyet, sigara kullanımı, fiziksel yaşam, menapoz) 5) İlaçlar ( fenitoini, karpamazepin) (Dekou vd 2001). 36

50 Şekil.2.13.Kromozom Metilentetrahidrofolat Redüktaz (MTHFR) Geni ve Özellikleri İnsan MTHFR geni kromozom 1p 36.3 te konumlanan, 656 aminoasiten oluşan MTHFR enzimini kodlamaktadır (Rosenblatt 2001). Genin tamamı 1980 baz çiftinden oluşmaktadır ve yaklaşık molekül ağırlığı 74,6 kda dur. 11 ekzondan oluşan MTHFR geninde ekzon 1 ATG başlama kodonunu içerirken, ekzon 11 3 ucu poliadenilasyon bölgesi ile sonlanmaktadır (Goyette vd 1998, Daly vd 1999). Bu genin N-terminal ucunun yapısı tamamen açıklanmamıştır, genin promotor bölgesi transkripsiyon faktörlerinin bağlanması için belirli konsensus dizilerine sahip iken TATA kutusu içermemektedir. Bu gen bölgesinde alternatif kaynaşma (splicing) meydana gelmektedir ve bunun sonucunda değişik dokularda, farklı MTHFR transkriptleri (3 farklı transkript) oluşmaktadır. Goyette ve arkadaşları MTHFR geninin 2.8,7.2 ve 9,8 kb büyüklüğünde 3 tane mrna sı olduğunu bildirmişlerdir. Üç farklı mrna sının olması, poliadenilasyon sinyal dizileri ve transkripsiyon başlangıç bölgelerinin farklı olmasından kaynaklanmaktadır. İnsan uzun mrna transkripti, AATAAA konsensus sinyali ile başlamaktadır. Daha kısa olan transkript ise poliadenilasyon sinyali olmaksızın başlamaktadır ( Daly vd 1999). Goyette ve ark. MTHFR geninin çeşitli upstream elemanlarını tanımlamışlardır. Bunlardan biri sp1 bağlanma bölgesi olup GC bakımından zengindir. Bu bölge daha az TATA kutusuna sahip promoterlerin transkripsiyonunu düzenlemektedir (Tran vd 2002). 37

51 Şekil 2.14.Metilentetrahidrofolat Redüktaz Enzimi substrat ve ürün Metilentetrehidrofolat Redüktaz Enziminin Tarihçesi ve MTHFR 677 C-T Değişimi Kang vd (1991) da MTHFR enzim termolabilitesinin koroner arter hastalığı ile ilişkili olduğunu tespit etmişlerdir. Çalışmalarının sonucunda kalp hastalarının %17 sinde kontrol grubunun ise %5 inde MTHFR termobilite değişimini bulmuşlardır. Rosenblatt vd (1992) MTHFR geninde yeni bir form bulunmuştur. Bu yeni form %50 oranında enzim aktivitesi göstermesi ve özel sıcaklık koşullarında farklı MTHFR enzim termolabiletisinin olmasıyla karakterize edilmiştir. Fonksiyonel olarak kodlanan enzim 37 C sıcaklıkta düşük enzimatik aktiviteye sahiptir. Rosenblatt vd (1992) de MTHFR enziminin termolabil ve termostabil formlarını tanımlamışlardır. Goyette vd (1998) de domuz MTHFR enzimini pürifiye etmişler ve aminoasit dizisini çıkarmışlardır. Aynı yıl içersinde aynı grup, insan MTHFR geninin 1p36.3 te konumlandığı insitu hibridizasyon tekniğini kullanarak tespit etmişlerdir ve MTHFR eksikliği olan kişilerde yaptıkları SSCP analizi ile de MTHFR geninde bir tane anlamsız mutasyon ve iki tanede enzim termolabilitesini değiştiren yanlış anlam mutasyonu 38

52 belirlemişlerdir yılında bu grup tarafından bilinen mutasyon sayısına yedi tane daha eklenmiştir. Engbersen vd (1995) de damar hastalıkları olan bireylerde ve kontrol grubunda termolabil MTHFR nin hafif hiperhomosisteinemiye ve normohomosisteinemiye neden olduğunu bildirmişlerdir. Frosst vd (1995) da MTHFR geninin 677.nükleotidinde bulunan Sitozin yerine Timin bazının gelmesi sonucu MTHFR gen ürününde 266. pozisyondaki Alanin aminoasidi yerine Valin aminoasidinin geçtiğini ve bu polimorfizim enzimin termolabil formunu eksprese ettiğini rapor etmişlerdir. MTHFR enziminin C677T polimorfizminde, CC (Alanin/Alanin) homozigot normal, CT (Alanin/Valin) heterozigot ve TT (Valin/Valin) homozigot mutant genotipler oluşmaktadır ( Fodinger vd 2000, Sibani vd 2000). MTHFR C677T değişiminde görülen genotiplere enzim aktivitesi ölçümleri yapılmıştır. Buna göre normal CC genotipinde enzim aktivitesi %100, heterozigot olan CT genotipinde enzim aktivitesi %70 ve mutant olan TT genotipinde enzim aktivitesi % 34 tür. C677T mutasyonu sonucu, CC homozigot normal ve CT heterozigot genotiplerine göre TT homozigot mutant genotipinde homosistein seviyesi önemli oranda yükselmektedir (Kang vd 1993). Daha sonra Goyette vd (1998) insan ve fare MTHFR geninin yapısını tanımlamışlardır. Genin 11 ekzondan oluştuğunu, bu ekzonların büyüklüklerini, intronların sınırlarını, intron büyüklüklerini, fare ve insan MTHFR geni arasındaki benzerlikleri ve aminoasit sekanslarının % 90 oranında benzer olduğunu bildirmişlerdir. Aynı yıl içersinde Van der Put vd (1998) tarafından MTHFR geninde başka bir polimorfizim olan 1298 A-C Glutamin-Alanin değişimi tespit edilmiştir. 39

53 Metilentetrahidrofolat Redüktaz (MTHFR) Enzimi ve Özellikleri 5 10 metilen tetra hidrofolat redüktaz enzimi (MTHFR), bir flavoproteindir. Sitoplazmik bir protein olan enzim, iki alt dimerden oluşan homodimer yapıdadır. İki izoformu vardır. Bu izoformlar dokulara özel olup 70 kda luk küçük alt birimlere sahip izoform karaciğerden, 77 kda luk büyük alt birimlere sahip izoform ise diğer dokulardan saflaştırılmıştır. MTHFR enzimi, tripsin enzimi ile proteolize uğratıldığında 77 kda luk büyük alt birim, 40 kda ve 37 kda luk iki kısıma ayrılmaktadır (Rozen 1998, Sibani vd 2000). Bu ayrılma sonucunda enzimin katalitik aktivitesi değişmeyip, S- adenozil metiyoninin inhibisyonu ortadan kalmaktadır. Yapılmış olan çalışmaların sonucunda katalitik bölge olan 40 kda luk N-bölgesinin substrat ve koenzim bağlanma bölgesine sahip olduğu, düzenleyici bölge olan 37 kda luk C-uç bölgesinin ise SAM bağlanma kısmına sahip olduğu gösterilmiştir (Sibani vd 2000). Memeli ve bakteri enzimleri non-kovalent bağlı olarak FAD koenzimi içermektedir. FAD kofaktörü, NADPH ve NADH daki hidrid iyonlarının metilen tetrahidrofolata transferini sağlamaktadır (Rozen Unpublished Data). MTHFR enzimi, homosisteinin remetilasyonunda görev yapmaktadır. MTHFR enzimi, 5 10 metilentetrahidrofolatı 5-metiltetrahidrofolata dönüştürmede anahtar enzimdir. MTHFR enzimi folat metabolizmasında önemli göreve sahiptir. Folat ise homosistein metilasyonu ve nükleotid sentezi gibi birçok biyokimyasal yolakta görev alan bit vitamindir (Roben vd 2003). 5-metiltetrahidrofolat (5 10 metilen THF), DNA metilasyonu ve metiyonin sentezi için metil grubu sağlamaktadır. Bu şekilde 5 10 metilen THF, metil grubunu vererek homosisteinin dönüşümünde rol oynamaktadır. Oluşan metiyonin metil transferaz için metil grubu vericisi olarak yardım eden S-Adenozil Metiyonin (SAM) e dönüşür. Bu reaksiyonda oluşan diğer bir ürün ise S-Adenozil Homosistein (SAH) dir. Bu da S- Adenozil Homosistein hidrolaz tarafından homosistein ve adenozine hidrolizlenir metilen THF ise, deoksiüridilatın timidilata dönüşümünde kullanılırken bir taraftan da 40

54 pürin sentezi için 10- formil THF a okside olmaktadır. MTHFR enziminde olan bir mutasyon sonucu (en yaygın olanı C677T mutasyonu), enzim aktivitesi azalmaktadır. Azalan enzim aktivitesi sonucu 5-metil THF düzeyi azalmakta, 5 10 metilen THF miktarı ile plazma homosistein düzeyi artmaktadır (Rosenblantt 1994). MTHFR enziminin eksikliği durumunda klinik belirtiler geniş bir dağılım göstermektedir. Şekil Homosistein transsülfürasyon ve remetilasyon metabolize yolakları Hiperhomosisteinemi ve homosisteinürinin ortaya çıktığı ciddi MTHFR enzim eksiliği, kalp ve beyin damar hastalıkları için önemli bir risk faktörüdür. MTHFR eksikliğinin hafif olduğu durumlara populasyon genelinde oldukça sık rastlanmakta olup, özellikle arteriyel hastalıkların oluşumunda bir risk faktörü olduğu ileri sürülmektedir (Goyette 1994). MTHFR enzimi eksikliğinde, periferal nöropati, gelişme geriliği, tromboz gibi klinik belirtiler görülmektedir (Daly vd 1999, Roseblantt 2001) MTHFR C677T Gen Değişiminin Dağılımı Populasyonlar arasında 677 TT homozigot genotip sıklığı coğrafi bölge, ırk ve etnik gruba çok değişkenlik göstermektedir. İtalya ve Meksika da TT genotipinin görülme sıklığı % 30 iken, Afrika da % 1 den az, Afrika kökenli Amerikalılar ında % 2 ye ulaşmaktadır yılında yapılan bir çalışmada, TT genotipinin, Kuzey Çin de (% 20), Güney İtalya da (% 26), Meksika da (% 32) olduğu yaygın olduğu bulunmuştur (Wilcken 2003). Fransa, 41

55 Amerika ve İrlanda da (%35), Norveç (%29,2), İsveç te ise (%28,5) tir (Frosst vd 1995). Arap populasyonunda % 2 den % 12 ye kadar değişmektedir, İsrail Yahudilerinde (%12,9), İngiltere de (%12 13), Cezayir de %14.3 dür (Patti vd 2009,Frosst vd 1995, Bourouba vd 2008). Türkiye de TT genotipi görülme sıklığı ise %5 9 arasındadır (Güleç vd 2001, Sazcı vd 2003). Şekil Farklı toplumlarda MTHFR 677 C-T polimorfizminin mutant olan TT genotipi sıklığı MTHFR C677T Gen Değişiminin Klinik Önemi MTHFR eksikliği ile folat metabolizmasının doğuştan hatalı olması yaygın olarak görülen bir durumdur. MTHFR genindeki fonksiyon kayıplarına neden olan mutasyonlar klinik belirtiler ile ilişkilidir. MTHFR genindeki mutasyonlar ile hastalıklar arasındaki ilişki iki şekilde değerlendirilmektedir. İlki, hastalık total homosistein metabolizmasını etkiler ve ancak MTHFR polimorfiziminin varlığı değişikliklere neden olur. İkincisi ise genetik olarak bu eksikliği taşımak hastalık riski oluşturmaktadır. Bu eksiklik folat ve total homosistein mekanizmalarını etkilemektedir (Ueland vd 2000). 42

56 Yapılan birçok çalışma sonucu plazmadaki orta dereceli homosistein seviyesinin, koroner kalp hastalıklarında, miyokard infarktüsünde iskemik felçde ve venöz trombozda risk faktörü olduğu bildirilmiştir (Wu vd 2001, Rigamonti vd 2002, Rothenbacher vd 2002). Aynı zamanda arteriyel trombozlu hastalarda homosistein metabolizmasındaki genetik anormalliklere yönelik olarak yapılan çalışmalarda MTHFR geninde olan C677T mutasyonunun varlığında kalp damar hastalıkları riskinin üç kat arttığı gösterilmiştir (Kluitjmans vd 1996). MTHFR polimorfizimi ile ilişkili olan klinik belirtiler arasında periferal nörapati, gelişim gecikmeleri, hipotonia, felç ve vasküler hastalıklar sayılabilmektedir. MTHFR 677 C-T gen değişiminin neden olduğu hastalıkların yaşam süresini etkileyebilecek nitelikte olduğu ve bu sebeple vasküler hastalıklar ile ömür uzunluğu arasındaki ilişkiyi belirleyebileceği düşünüldüğü için literatürdeki birden çok çalışmaya konu olmuştur. 43

57 2.6. MOLEKÜLER TEKNİKLER Kullanılan Çözeltiler Bu çalışmada DNA izolasyonunda kırmızı kan hücrelerini parçalamak için RBC (Red Blood Cell) lizis çözeltisi, fenol/ kloroform ( Merck, Almanya) karışımı kullanılmıştır DNA Ekstraksiyonu Genomik DNA lar, kan örneklerinden proteinaz K, fenol/kloroform yöntemiyle izole edilmiş ve etanol ile muamele edilerek çöktürülmüştür Polimeraz Zincir Reaksiyonu ( PCR ) Hücreden kaynaklanmış bir yöntem olarak polimeraz zincir reaksiyonu, DNA klonlanmasını kolaylaştırarak, rekombinant DNA araştırmalarının güçlü bir tekniği olmuştur ve pek çok durumda konakçı hücrelerin kullanıldığı klonlamanın yerini almıştır. Yani, bir çeşit in vitro klonlamadır te Kary Mulis in geliştirdiği bu yöntem, günümüzde tıbbi ve biyolojik çalışmalarda araştırma laboratuarlarında sık kullanılan vazgeçilmez bir teknik haline gelmiştir. Bu yöntem dizileme için DNA klonlanması, DNA temelli filogenetik analiz, genetik parmak izi ile tanımlama, enfeksiyon hastalıklarının belirlenmesi ve tedavisinde kullanılmaktadır.1993 te Mullis, Nobel Kimya Ödülüne layık görülmüştür (Saiki vd 1985). Bu yöntemin Polimeraz zincir reaksiyonu olarak adlandırılmasının sebebi, döngünün anahtar elemanlarından biri olan DNA polimerazdan türetilmesidir. DNA polimeraz, invitro enzimatik replikasyon ile DNA nın bir parçasını çoğaltmak için kullanılır. 44

58 Yöntemin temeli, çoğaltılmak istenen bölgenin 2 ucuna özgü, bu bölgedeki baz dizilerine tamamlayıcı, bir çift sentetik oligonükleotit (18 20 baz uzunluğunda) kullanılarak, bu primerler ile sağdan ve soldan sınırlandırılan bölgenin DNA primelerine bağlanarak bunlara 3 ucundan nükleotidleri ekleyerek sentez yapacak olan ısıya dayanıklı DNA polimeraz, sentezde kullanılacak olan deoksinükleotidtrifosfatlar ( d NTP ler; A, G,C,T), polimerazın çalışması için uygun PH ve iyon koşullarını (Mg +2 ) sağlayan tampon karışımı ile enzimatik olarak sentezlenmesine dayanır ( Akar 1999, Klug 2000). PCR, DNA ipliklerinin yüksek sıcaklık ile birbirinden ayrılmasını (denatürasyon), sonra sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA ya bağlanmasını (hibridizasyon), daha sonra da zincir uzamasını (polimerizasyon), ve bu döngülerin istenilen belirli sayıda tekrarlanmasına dayanır. Bu üç adım bir PCR döngüsünü oluşturur. Elde edilecek ürünün miktarı teorik olarak, bu üç temel basamağın tekrar sayısına bağlıdır. Bir PCR işleminde n döngü sonunda kalıp DNA nın istenilen bir bölgesi yaklaşık 2 n kez çoğaltılmış olur. Oluşturulan DNA zincirlerinin sayısı her döngüde iki katına çıkar ve yeni zincirler bir sonraki döngüde kalıp görevi görürler. İşlem ısı dönüştürücüsü (thermocycler) denilen makinelerde, önceden döngü sayısı ve sıcaklık koşulları belirlenen programlarla otomatik olarak gerçekleştirilir. Bu yöntemle; klonlama, dizi analizi, klinik tanı ve genetik taramalar gibi diğer işlemlerde kullanılmak üzere bol miktarda hedef DNA fragmantleri elde edilir (Akar,1999, Bölüm 7; Klug ve Clummings, 2002, Bölüm 18). PCR reaksiyonunda ilk adımda çoğaltılacak olan çift zincirli DNA, C de yaklaşık 5 dakika ısıtılmak suretiyle denatüre edilir ve tek zincirli hale getirilir. İkinci adımda, sıcaklık C arasında bir değere düşürülerek (bağlanma sıcaklığı) primerlerin tek zincirli DNA ya bağlanması sağlanır nükleotid uzunluğunda olan yapay oligonükletidlerden oluşan bu primerler; çoğaltılacak DNA nın sınırlandırılması için başlangıç noktası ve bitiş noktası olarak görev yaparlar. Üçüncü aşama olan DNA sentezi aşaması ise C sıcaklıkları arasında gerçekleşir. DNA polimeraz enzimi, nükleotidleri 5 ucundan 3 ucuna doğru ekleyerek, primelerin uzamasını sağlar ve hedef DNA nın iki zincirli kopyasını oluşturur (Klug 2000). 45

59 PCR dan iyi sonuç alınabilmesi değişik faktörlere bağlıdır. DNA polimerazın iyi çalışabilmesi en etkin olduğu ph ın tüm uygulama boyunca korunabilmesi en önemli faktörlerdendir. Bu amaçla genellikle Tris.HCl ph: 8.4 tepkime karışımında son değişimi 10mM olacak şekilde kullanılır. PCR karışımında tek değerli katyonların özellikle mm düzeyinde K + bulunmasının, çoğaltılmayı önemli ölçüde artırdığı saptanmıştır. Yine karışımda 100µg/ml jelatin bulunmasının da benzer etki gösterdiği saptanmıştır. Ayrıca, serbest magnezyum (MgCl 2 ) konsantrasyonunun azaltılması ile Taq polimeraz doğruluğu artırılabilir. dntp, DNA ve proteinlerin tümü Mg +2 iyonuna bağlandıkları için her PCR protokolünde Mg +2 konsantrasyonu ampirik olarak ayarlanmalıdır. Fazla Mg +2, enzimin spesifikliğini azaltır, azı ise; enzimin inaktif olmasına yol açar (Akar, 1999, Bölüm 7). PCR için gerekli elementlerden olan primerlerin, hedef bölgeye özgün olacak şekilde tasarlanır baz uzunluğundaki primerlerin baz dizilimi ve kompozisyonu rastgele olmamalı, %45 55 oranında G/C den oluşmalıdır. Uygun bir primer çifti için, iki primer arasındaki kompozisyonu bç kadar olmalıdır. Aynı zamanda primerlerler birbirlerinin tamamlayıcısı olmamalıdır. Primerlerin DNA bağlanma sıcaklığı kabaca Tm ( erime sıcaklığı); 4 (GC)+ 2( AT) formülü ile hesaplanır. Bu değer oligonükleotidlerin nükleotid konsantrasyonlarına bağlı olarak değişmekte olup hesaplanan uygun sıcaklık değeri PCR spesifikliğini artırmaktadır (Akar, 1999, Bölüm 7). PCR yöntemi çok az miktarlardaki materyalin analizine olanak vermesi nedeniyle tıbbı genetik ve moleküler genetikte önemli işlemlerden biri haline gelmiştir Restriksiyon Enzimleriyle Kesim PCR ürünlerinin incelenmesinde değişik moleküler teknikler bulunmaktadır. Bu tekniklerin en sık kullanılanlarından biri, PCR ürünlerinin restriksiyon endonükleaz (RE) enzimleri ile muamele edilerek incelenmesidir. Restriksiyon enzimleri, DNA çift sarmalında kendilerine özgü tanıma dizilimini şeker ve fosfat omurgasından kırar ve bu şekilde DNA yı manüple etmeyi mümkün kılarlar. Tanıma dizileri çoğu restriksiyon enzimi için DNA zincirinin her iki iplikçiğinde de aynıdır, bunlar palindromik diziler 46

60 olarak adlandırılır. Bakterilerin büyük bir bölümü bir veya birkaç türde RE sentezler. Esas görevleri; dışarıdan bakteriye giren bazı özel gen veya markerları taşıyan genetik materyalleri ayrıştırarak mutasyonlara mani olmak ve genetik yönden kararlılığı korumaktır. Bu mekanizma, gerçekte bir savunmadır. Bakteriye özgü bu enzimler, çift sarmallı DNA üzerinde özgün bölgeyi tanırlar ve çift sarmallı DNA nın her iki zincirindeki fosfodiester bağını keserek DNA yı iki parçaya ayırırlar (Akar 1999). Restriksiyon endonükleaz enzimleri adlandırılırken izole edilen prokaryotun cins isminin ilk harfi ve tür isminin ilk iki harfi kullanılır. İzoşizomerler ise; farklı mikroorganizmalardan elde edilip, DNA üzerinde aynı diziyi tanıyıp kesim yapan RE lerdir (Akar 1999) Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Real Time PCR) DNA zincirinin önceden belirlenen bir bölgesini çoğaltmak için kullanılan Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) moleküler alanında devrim niteliği taşıyan bir yöntemdir. Son yıllarda PCR reaksiyonlarında sıcaklık döngüleri sağlamak için kullanılan cihazların (thermocycler) hassas ölçüm aletleriyle birleştirilmesi Real-Time PCR olarak adlandıran yeni bir yöntemin geliştirilmesine neden olmuştur. Real-Time PCR başlangıç miktarına göre oluşan son PCR ürünün miktarının özgün, hassas ve diğer metotlara göre daha kolay tespit edilebildiği, nükleik asit amplifikasyonu ile eş zamanlı olarak artış gösteren floresans sinyalin ölçülmesiyle kısa sürede, kalitatif ve kantitatif sonuç verebilen bir yöntemdir. Sinyal artışı PCR ürün artışı ile direkt orantılıdır. Her bir PCR döngüsündeki floresans ışımanın kaydedilmesi ile başlangıçtan itibaren üstel fazda ürün artışına hangi noktada ulaşıldığı, eş zamanlı (Real-Time) izlenebilir ( Floresans sinyal ölçümü DNA çift zincirine bağlanan boyalar (etidyum bromid, SYBR Green I) ve hibridizasyon probları Resonans Enerji Transferi (FRET) ile gerçekleştirilir. Hibridizasyon probları, iki farklı floresans boya ile boyanmış diziye özgü oligonükleotidlerdir. Floresans boyalar, probların 3,5 uçlarına veya iç bölgelerine eklenir. Hibridizasyon probu hedef DNA yı baştan sona hibridize edebilecek bir çift oligonükleotid 47

61 içerir. Oligonükleotidlerden biri 3 ucundan fluorescein (3-FL) ile diğeri de 5 ucundan LightCycler Red 640(LC 640) veya LC (5LC) ile işaretlenmiştir ve serbest olan 3 -hidroksi ucu genelde polimeraz etkisiyle oluşacak uzamayı önlemek için bir fosfatla bloke edilmiştir. Problar bölgeye özgü tasarlandığında ve iki prob arasında 1 5 nükleotidlik mesafe olduğunda bir enerji transferi oluşur, bunun bir avantajı olarak da non-spesifik ışımalar gözlenmez. Probların sahip olduğu floresans boyanın uyarılması ve enerjisini diğer floresansa aktarılmasına FRET denir ( Erime eğrisi analizi sırasında, ısı yavaş yavaş yükselir, hibridizasyon probları erir ve birbirine yakın durumda bulunan iki floresan boya birbirinden ayrılır, böylelikle floresans ışıma miktarı düşer. Eğer bir mutasyon mevcut ise; mutasyon probu ile hedef DNA arasındaki uyumsuzluk hibridin stabilizasyonunu bozar. Yabanıl tip genotipte ise uyumsuzluk oluşmaz ve hedef DNA ile bire bir olarak örtüşen hibrit daha yüksek erime eğrisine sahip olur. Mutant genotiplerde ise; hedef DNA ile hibrit bire bir örtüşmediğinden bazlar arasında oluşan bağlar daha gevşek olur ve bunun sonucu olarak düşük erime ısısına sahip olur. Erime eğrisi analizi sonucu elde edilen pikler; homozigot (yabanıl tip veya mutant) genotip ile heterozigot genotip arasındaki farkın ayırt edilmesini sağlamaktadırlar ( Real- Time PCR yöntemi, PCR ve RFLP yöntemlerine göre, genotiplerin kolay ve doğru analiz edilmesi, çabuk sonuç elde edilmesi gibi avantajları mevcuttur. Yöntem hızlı ve duyarlı olması nedeni ile klinik kullanım ve geniş-çaplı araştırmalar için uygun görülmektedir. Klinik uygulamaları giderek artan Real-Time PCR sistemleri, hastalıkların tanısında ve nokta mutasyonlarının belirlenmesinde sağladığı üstünlükler nedeniyle tercih edilmektedir. Tüm Dünya da olduğu gibi ülkemizde de yaygınlaşan Real-Time PCR sistemleri, hız ve kaliteye önem veren moleküler genetik laboratuarlarının pek çok sorununa çözüm olmaktadır ( 48

62 Şekil RT- PCR Light Cycler Mutasyon Analiz yönteminin çalışma prensibi Şekil Erime Eğrisi Analizi: Dizide ( Örn.FV 1691 G-A, Protrombin G-A, MTHFR 677 C-T) oluşabilecek genotiplerin görünümü 2.7. İstatistiksel Yöntemler Bütün veriler, File Express veri düzenleyici bilgisayar programı kullanılarak kaydedildi. Grup karşılaştırmalarındaki kare testi için TAD programı kullanılmıştır. P değeri 0.05 den küçük bulunan değerler istatiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Sıklık hesapları için yüzde(%), risk hesapları için Odds Ratio (OR) programı kullanılmıştır. 49

63 3.MATERYAL VE YÖNTEM Bu çalışma Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı; Pediatrik Moleküler Patoloji ve Genetik Bilim Dalı Laboratuarında gerçekleştirilmiştir. FV 1691 G-A, PT G-A ve MTHFR 677 C-T gen değişimleri, için tromboz ile ilişkilendirmiş yaş aralığı 0 ile 18 arasında olan 362, yaş aralığı 70 ve üzeri olan 209 birey ile herhangi bir trombotik hastalık ile ilişkilendirilmemiş yaş aralığı 0 ile 18 arasında olan 332, yaş aralığı 70 ve üzeri 266 sağlıklı birey çalışma grubu olarak belirlenmiştir. ACE İnsersiyon/ delesyon (I/D) değişimi için ise, tromboz ile ilişkilendirilmiş yaş aralığı 0 ile 18 arasında olan 288, yaş aralığı 70 ve üzeri olan 203, herhangi bir trombotik hastalık ile ilişkilendirilmemiş yaş aralığı 0 ile 18 arasında olan 307, yaş aralığı 70 ve üzeri olan 251 sağlıklı birey çalışma grubu olarak belirlenmiştir. DNA örnekleri Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Moleküler Genetik Bilim Dalı DNA Bankası ndan temin edilmiştir. Çalışmaya katılan tüm ailelere araştırmalarla ilgili bilgi verilmiş ve gönüllü olarak katıldıklarına dair onam formu alınmıştır. Bu çalışmada; çalışma gruplarına ait ilgili mutasyonların tarama sonuçları mevcut olup, bu sonuçların yaş dağılımı belirlenmiştir. Bölümümüze başvuran hastalardan alınan kan örneklerinden Fenol- Klorofrom yöntemiyle elde edilmiş DNA lardan FVL 1691 G-A Mutasyonu Light Cycler Factor V Leiden Mutation Detection System ( Roche Diagnostics, USA), Protrombin G-A Mutasyonu Light Cycler Protrombin G-A Mutation Detection System ( Roche Diagnostics, USA) ve MTHFR 677 C-T Mutasyonu belirleme kiti ( Roche Molecular Biochemicals) kullanılmış ve ACE İnsersiyon/ Delesyon Gen değişiminin (I/D) belirlenmesi için Klasik PCR yöntemi uygulanmıştır. Proje, Ankara Üniversitesi bilimsel araştırma projeleri tarafından desteklenen Tromboz konulu projeler bağlamında desteklenmiştir ( ). 50

64 3.1. YÖNTEM DNA İzolasyonu Çalışma grubunu oluşturan hastalardan 1 ml 0,5 Metilendiamintetraasetikasit (EDTA) (Sigma, ABD) içeren polietilen tüp içerisine 9 ml kan örneği alınır. Alınan kan örneği 50 ml' lik flakon tüp içersinde 25 ml RBC (Red blood cell) lizis solüsyonu [155 Mm amonyum Klorid (AppliChem, Almanya), 10 Mm Sodyum Bikarbonat ( Merck, Almanya), 0,5 Mm EDTA (AppliChem, Almanya)] eklenir, çalkalanarak 20 dk buzda bekletilir. Soğutmalı santrifüjde (Hettich, Almanya) + 4 C de 4000 rpm de 20 dk santrifüj edildikten sonra süpernatant dökülür, çökelek üzerine tekrar 25 ml RBC Lizis solüsyonu eklenir. Bu işlem tüm eritrositler giderilene kadar tekrarlanır. Son kez süpernatant döküldükten sonra dipte kalan lökositler üzerine 1000 µl RBC lizis solüsyonu eklenir ve bu karışımın 800 µl si ependorf tüpüne alınarak -20 C de stok olarak saklanır. Geriye kalan 200 µl bir ependorf tüpüne alınarak üzerine 20 µg/ml olacak şekilde Proteinaz K enzimi (MBI Fermentas, Litvanya), son lökosit hacminin 2.5 katı olacak şekilde nükleaz solüsyonu [10 Mm Trisklorid ( Amresco,ABD) ph: 8,100 Mm Sodyum Klorid ( Merck, Almanya), 1 Mm ph:8.0 EDTA ( AppliChem, Almanya)] eklenerek bir gece 56 C de sıcak su banyosunda bekletilir. İkinci gün tüplere 1:1 oranında Fenol/Kloroform [Fenol (Merck, Almanya ), Kloroform (Merck, Almanya)], izoamil alkol (Merck, Almanya) eklenerek 10 dk çalkalanır ve buz içersinde 20 dk bekletildikten sonra + 4 C de 4000 rpm de 20 dk santrifüj edilir. İki faza ayrılan karışımın üst kısmı başka bir ependorf tüpüne alınarak üzerine toplam hacmin 1/10 u kadar 3 M Sodyum Asetat (Sigma, ABD) ve toplam hacmin 2 katı kadar %95 lik alkol (Tekel, Türkiye) eklenir. Ependorf tüpü ters düz edilerek DNA görünür hale getirildikten sonra -20 C de bir gece bekletilir. Üçüncü gün tüpler + 4 C de 4000 rpm de 20 dk santrifüj edilerek DNA çöktürülür. Süpernatant dökülerek tüpe 500 µl % 70 lik alkol eklenerek + 4 C de 4000 rpm de 20 dk santrifüj edilir. Santrifüj sonrasında alkol dökülür ve tüpler kuruma kâğıdı üzerine kapakları açık bir şekilde kurumaya bırakılır. Kurutulduktan sonra tüplerin içerisine Tris EDTA ( 10 51

65 Mm Tris- HCL,1 Mm EDTA) solüsyonu eklenir, 37 C de bir gece bekletilerek DNA nın çözünmesi sağlanır. İzole edilen DNA + 4 C de veya -20 C de saklanır Polimeraz zincir reaksiyonu ( PCR ) ile ACE Geni İnsersiyon / Delesyon Değişimi Tayini Bu çalışmada PCR tekniği kullanılarak, ACE insersiyon/ delesyon (I/D) değişimini kapsayan enzim gen bölgesinin amplifikasyonu gerçekleştirildi. ACE geninin 16. intronundaki insersiyon/delesyon (I/D) değişiminin tayini için PCR tekniği kullanılarak çoğaltılan bölgeler 190 ( D alleli) ve 490 ( I alleli için) bç uzunluğundadır. Çoğaltmak istediğimiz bölgeyi sınırlamak için kullanılan primler (dizi 1) altı çizili olarak gösterilmiştir. ACE insersiyon/ delesyon (I/D) polimorfizmi tayini için yapılan PCR da son konsantrasyonları 0.1μg/ml olan iki primer kullanıldı: Bu çalışmada PCR tekniği kullanılarak, ACE insersiyon/ delesyon (I/D), enzim gen bölgesi amplifikasyonu gerçekleştirildi. CTGGAGAGCCACTCCCATCCTTTCTCCCATTTCTCTAGACCTGCTGCCTATACAGTCACTTTTATGTGGTTT CGCCAATTTTATTCCAGCTCTGAAATTCTCTGAGCTCCCCTTACAAGCAGAGGTGAGCTAAGGGCTGGAGC TCAAGGCATTCAAACCCCTACCAGATCTGACGAATGTGGATGGCCACGTC Dizi 1. ACE I/D değişiminin tespit edilebilmesi için PCR ile çoğaltılmış dizi Forward: 5 -CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT 3 Reverse: 5 -GATGTGGCCATCACATTCGTCAG 3 ( Alpha DNA, Kanada) 52

66 Diğer PCR komponentleri ise; Son konsantrasyon 2 mm olacak şekilde datp, dgtp, dttp, dctp (Fermentas, Litvanya), Taq DNA Polimeraz (Fermentas, Litvanya), 10mM Tris-HCl (oda sıcaklığında ph: 9.0), 50mM KCl ve 0.1% Triton, 25mM MgCl2 dür. Son hacim 50 μl ye ddh 2 O ile tamamlanarak polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirilmiştir. ACE insersiyon/ delesyon (I/D) polimorfizmi tayini için polimeraz zincir reaksiyonu sıcaklık şartları ise: 94 o C de 5 dk, 94 o C de 1 dk, 58 o C de 1 dk, 72 o C de 2 dk ve son siklusta 72 o C de 7 dk olarak gerçekleştirilmiştir (Biometra, ABD). Polimeraz zincir reaksiyonu sonrasında DD genotipine sahip örneklerde 190 bç lik, ID genotipine sahip 490 ve 190 bç lik ve II genotipine sahip 490 bç lik fragmentler beklenmektedir. PCR ürünleri için % 2 lik agaroz jel elektroforezinde değerlendirilmiştir Agaroz Jel Elektroforezi Bu çalışmada PCR ürünleri, %2 lik agaroz (Sigma, ABD) Jel e Brom Fenol Mavisi (BBF) takip boyası ile yüklenerek sonuçlar alınmıştır. Bunun için 2 g agaroz toplam hacim 100 ml olacak şekilde TBE 1X ( Tris- Borik- Asit- EDTA) ilave edilir ve mikro dalga fırında ısıtılarak agarın tampon içinde homojen bir şekilde erimesi sağlanır. Jel yapımı için kullanılan TBE 5X tampon solüsyonu hazırlanması için 54 g Trisma (Sigma, ABD), Borik asit ( AppliChem, Almanya), 20 ml 0,5 M Ph:8 EDTA (AppliChem, Almanya) distile su ile 1000 ml ye tamamlanarak hazırlanır. Homojen şekilde eriyip berrak bir görünüm alan tampon-agar karışımının % 5 lik stok solüsyonundan 3 µl Etidyum Bromid( Sigma, ABD) eklenir. Karıştırılarak tarakları yerleştirilmiş jel tabağına (Thermo Midicell, ABD) dökülür. Agaroz jelin donması için yaklaşık 30 dk beklenir. 53

67 Jelin donmasından sonra taraklar çıkartılır, jel tabağı ile birlikte elektroforez tankına ( Thermo Maxicell, Primo, ABD) yerleştirilir. PCR örneklerinden 20 µl alınarak, 1,5 µl BBF ile homojen hale getirilerek, agaroz jele yüklenir. Polimeraz zincir reaksiyonu sırasında amplifikasyonun doğru gerçekleştiğini anlayabilmek için agaroz jele 4µl standart boyları belirlenmiş olan markör (ФX174 DNA Hae III BioLabs, ABD) yüklenir ve 80 V akımda dk yürütülür. Ultraviyole ışık (Spectroline, ABD) altında incelenir ve fotoğraflanır. 490 bç 190 bç Şekil 3.1. ACE( I/D) insersiyon/delesyonu için elde edilen PCR ürünlerinin Agaroz Jel elektroforez fotoğrafı. İlk örnek markerdır Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Analizi Gerçek zamanlı PCR uygulamasında erime eğrisine göre analiz temeline dayanan Light Cycler ( Roche Molecular Biochemicals, Manheim, Almanya) cihazı kullanılır FV 1691 G A, Protrombin G-A ve MTHFR 677 C-T Gen Değişimlerinin Belirlenmesi FV geninde 1691 G A ve Protrombin geninde G-A ve MTHFR geninde ortaya çıkan 677 C-T pozisyonlarındaki baz değişimlerinin belirlenmesinde gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu prensibine uygun olarak tasarlanmış özel bir cihaz olan Light Cycler ( Roche Diagnostics, GERMANY ) ile gerçekleştirilir. Uygulamada borosilikattan yapılmış olan kapiller tüpler ve Faktör V 1691 G-A, Protrombin G-A polimorfizm belirleme kiti (Roche Diagnostics, GERMANY) ve MTHFR 677 C-T polmorfizm belirleme kiti ( Roche Molecular Biochemicals) kullanılır. Faktör V geninin 222, 54

68 Protrombin geninin 291, MTHFR geninde ise 269 baz çiftlik fragmanlar insan genomik DNA sı kullanılarak diziye özgü primerler ile çoğaltılmıştır. Light Cycler cihazında FVL, Protrombin ve MTHFR polimorfizmleri analizinde kullanılan kit içerikleri tabloda gösterilmiştir. Çizelge 3.1. Light Cycler cihazında kullanılan FVL kit içerikleri ve reaksiyonda kullanılan miktarlar (FVL Kit for use with the Light Cycler 1.2. Instrument manuel) Reaktifler Reaktif İçerikleri FVL MD Mix (FVL Mutation Dedection Mix) <0,01% FVL primer forward and reverse <0,01%FVL HybProbe Probe Red 640 <0,01%FVL HybProbe Probe Fluorescein Brij35 FVL R Mix (FVL Reaction Mix) FVL DIL (FVL Diluent) DNA MgCl 2 Tris HCl Buffer <0,01%Taq DNA polimerase, GMP grade <0,07% datp,dctp,dgtp,dutp,dttp Brij35 MgCl 2 H 2 O, PCR - grade (also used negative control) 55

69 Çizelge 3.2. Light Cycler cihazında kullanılan PT G-A kit içerikleri ve reaksiyonda kullanılan miktarlar (PT Kit for use with the Light Cycler 1.2. Instrument manuel) Reaktifler Reaktif İçerikleri Protrombin G-A MD Mix (Protrombin GA Mutation Dedection Mix) <0,01% Protrombin G-A Brij35 MgCl 2 primer forward and reverse <0,01% Protrombin G-A HybProbe Probe Red 640 <0,01% Protrombin G-A HybProbe Probe Fluorescein Protrombin G-A R Mix (Protrombin G-A Reaction Mix) Protrombin G-A DIL (Protrombin G-A Diluent) DNA Tris HCl Buffer <0,01%Taq DNA polimerase, GMP grade <0,07% datp,dctp,dgtp,dutp,dttp Brij35 MgCl 2 H 2 O, PCR - grade (also used negative control) Çizelge 3.3. Light Cycler cihazında kullanılan MTHFR kit içerikleri ve reaksiyonda kullanılan miktarlar Reaktifler Reaktif İçerikleri MTHFR MD Mix (MTHFR Mutation Dedection Mix) <0,01% MTHFR primer forward and reverse <0,01%MTHFR HybProbe Probe Red 640 <0,01%MTHFR HybProbe Probe Fluorescein Brij35 MTHFR R Mix (FVL Reaction Mix) MTHFR DIL (MTHFR Diluent) DNA MgCl 2 Tris HCl Buffer <0,01%Taq DNA polimerase, GMP grade <0,07% datp,dctp,dgtp,dutp,dttp Brij35 MgCl 2 H 2 O, PCR - grade (also used negative control) 56

70 Çizelge 3.4. Faktör V geni genotiplemesi için kullanılan primer dizileri ve hibridizasyon propları Primer ve Prob dizisi Oryantasyon PCR Ürünü Factor V 1691G-A 220 bç 5 -TGCCCAGTGCTTAACAAGACCA-3 Sense 5 -CTTGAAGGAAATGCCCCATTA-3 Antisense 5 -GGCGAGGAATACAGGTAT-3 -floresan Sense 5 -LC-Red705-TGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTG-3 -PHO (Mutasyon prob) Sense (Anchor prop) Çizelge 3.5. Protrombin geni genotiplemesi için kullanılan primer dizileri ve hibridizasyon propları Primer ve Prob Dizisi Oryantasyon PCR Ürünü Protrombin G-A 291 bç 5 - CCGCTGGTATCAAATGGGG-3 Sense 5 - CCAGTAGTATTACTGGCTCTTCCTG-3 Antisense 5 -CTCAGCGAGCCTCAATG-3 floresan sense (Mutasyon prob) 5 -LC-Red640-TCCCAGTGCTATTCATGGGC-3 PHO sense (Anchor Prop) Çizelge 3.6. MTHFR 677 C-T geni genotiplemesi için kullanılan primer dizileri ve hibridizasyon probları Primer ve Prob dizisi Oryantasyon PCR ürünü MTHFR 677 C-T 167 bç 5 -TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA 3 Sense 5 -AGGACGGTGCGGTGAGAGTG -3 Antisense 5 -TGAGGCTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA GGTGTCT 3 -Flu Sense (mutasyon prob) 5 -LC 640-CGGGAGCCGATTTCATCAT 3 -PHO (TIB Molbiol, Berlin, Almanya) Sense (Anchor probe 57

71 TGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAATA GGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCG/AAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTA ACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCTAGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATT TCCTTCAAG Dizi 2. FV 1691 G-A değişiminin tespit edilebilmesi için RT-PCR ile çoğaltılmış dizi. primerler altı çizili olarak gösterilmiştir. TCTAGAAACAGTTGCCTGGCAGGGGAATACTGATGTGACCTTGAACTTGACTCTATTGGAAACCTCATCT TTCTTCTTCAGAGCCCCTTTAACAACCGCTGGTATCAAATGGGCATCGTCTCATGGGGTGAAGGCTGTGAC CGGGATGGGAAATATGGCTTCTACACACATGTGTGTTCCGCCTGAAGAAGTGGATACAGAAGGTCATTGA TCAGTTTGGAGAGTAGGGGGCCACTCATATTCTGGGCTCCTGGAACCAATCCCGTGAAAGAATTATTTTTG TGTTTCTAAAACTATGGTTCCCAATAAAAGTGACTCTCAGCAAGCCTCAATGCTCCCAGTGCTAT Dizi 3.Protrombin G-A değişiminin tespit edilebilmesi için RT-PCR ile çoğaltılmış dizi. Primerler altı çizili olarak gösterilmiştir. GAGCTTTGAGGCTGACCTGAAGCACTTGGCAGGTTACCCCAAAGGCCACCCCGAAGCAGGGA GCTTTGAGGCTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGAGC/TCGATTTCATCATC ACGCAGCTTTTCTTTGAGGCTGACACATTCTTCCGCTTTGTGAAGGCATGCACCGACATGGGCA TCACCTTGAACAGGTGGAGGCCAGCCTCTCCTGACTGTCATCCCTATT Dizi 4.MTHFR 677 CT değişiminin tespit edilebilmesi için RT-PCR ile çoğaltılmış dizi. Primerler altı çizili olarak gösterilmiştir. 58

72 Şekil 3.2. RT- PCR, FV 1691 G-A ve Protrombin G-A primerlerinin bağlanarak çoğalttıkları gen bölgesi Yabanıl Allel Homozigot Mutant Allel Heterozigot Allel Şekil 3.3. Erime Eğrisi Analizi: Dizide (Örn.Faktör V Leiden) oluşabilecek genotiplerin görüntüsü 59

73 4.ARAŞTIRMA BULGULARI Tromboz ile ilişkilendirmiş yaş aralığı 0 ile 18 arasında olan 362, yaş aralığı 70 ve üzeri olan 209 birey ile herhangi trombotik hastalık ile ilişkilendirilmemiş yaş aralığı 0 ile 18 arasında olan 332, yaş aralığı 70 ve üzeri 266 sağlıklı birey çalışma grubu olarak belirlenmiştir. FV 1691 G-A, PT G-A ve MTHFR 677 C-T baz değişimleri gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu tekniği kullanılarak taranmıştır. ACE Genindeki İnsersiyon/ Delesyon değişimi (I/D), yaş aralığı 0 18 arasında olan 288, yaş aralığı 70 ve üzeri olan 203 hasta birey ile yaş aralığı 0 ile 18 arasında 307, yaş aralığı 70 ve üzeri olan 251 sağlıklı birey ile klasik PCR tekniği kullanılarak taranmıştır Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu Bulguları Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu, Roche Diagnostics firması tarafından üretilen Light Cycler cihazında yapılmıştır. FV 1691 G-A, PT G-A ve MTHFR 677 C-T değişimleri için bireylerden alınan DNA örnekleri kit protokolüne göre cihazda okutulmuştur. A B C Şekil 4.1. FV 1691 G-A Gerçek zamanlı PCR analizi A: Homozigot CC aleli; B: Heterozigot CT; C: Homozigot mutant AA genotip görüntüsü 60

74 A B C Şekil 4.2. PT G-A Gerçek zamanlı PCR analizi A: Homozigot CC aleli; B: Heterozigot CT; C: Homozigot mutant AA genotip görüntüsü A B C Şekil 4.3. MTHFR 677 C-T Gerçek zamanlı PCR analizi. A: homozigot CC alleli; B: Heterozigot CT; C: Homozigot mutant TT genotip görünümü 4.2. Polimeraz Zincir Reaksiyonu Bulguları ACE genine ait PCR ürünleri %1,5 lik agaroz jelde 80V da 15 dk yürütülmüştür. 490bç 190bç Şekil 4.4. ACE( I/D) insersiyon/delesyonu için elde edilen PCR ürünlerinin Agaroz Jel elektroforez fotoğrafı. 61