-1- Biüret Yöntemi. ANALĐZ ĐÇĐN GEREKLĐ EKĐPMANLAR Mikro pipet (1000 µl) Makro küvet (3 ml) 1 Vorteks Analitik terazi Spektrofotometre (540 nm)

Transkript

1 1 GĐRĐŞ Protein tayin kiti takip edilerek hazırlanmıştır. Protein tayin kiti kullanılarak örneklerde hızlı, güvenilir ve kolay bir şekilde protein miktarı saptanabilmektedir. Protein tayin kitinde gerçekleştirilen reaksiyon aşağıdaki verilmiştir. Protein + Cu ++ Alkali ph Cu Protein Kompleksi Biüret metodu, peptid bağlarının alkali çözeltilerde bakır ile kompleks oluşturmasını temel alarak örnek içerisindeki çözünür protein miktarının belirlenmesi için kullanılabilecek bir metottur. Biüret reaktifinde (kuvvetli bir baz çözeltisinde bakır sülfat) bulunan Cu ++ iyonları, bir veya daha fazla sayıdaki peptid bağı ile reaksiyona girmekte ve mavi-mor renkli bir kompleks oluşturmaktadır. Protein miktarı arttıkça çözelti rengi koyulaşmaktadır. Renk yoğunluğu takip edilerek ortamdaki protein miktarı ölçülebilmektedir. Biyozim Protein Analiz Kiti nde yüksek saflıkta kimyasallar kullanılarak kısa sürede, yüksek doğrulukta ve tekrarlanabilir sonuçların üretilebilmesi mümkün kılınmıştır. Yöntem mümkün olduğunca basitleştirilmiş ve her aşamasında kullanıcı kolaylığı ön planda tutulmuştur. ANALĐZ ĐÇĐN GEREKLĐ EKĐPMANLAR Mikro pipet ( µl) Mikro pipet (1000 µl) Makro küvet (3 ml) 1 Vorteks Analitik terazi Spektrofotometre (540 nm) ANALĐZ KĐTĐ ĐÇERĐĞĐ Biyozim Protein analiz kiti; sodyum hidroksit, bakır sülfat, sodyum-potasyum tartarat, potastum iyodat. 1 nolu şişe (# ): Protein analiz çözeltisi (25 analiz/şişe) Sodum hidroksit Bakır Sülfat Sodyum-potasyum tartarat Koruyucu Stabilizatör 2 nolu şişe (# ): Protein standardı Albümin 1 Tek kullanımlık plastik küvetlerin kullanılması tavsiye edilmektedir. -1-

2 ÇÖZELTĐLERĐN HAZIRLANMASI 2 Protein analiz kitinde tüm kimyasallar kullanıma hazır olarak sunulmuştur. Aşağıdaki prosedür gerçekleştirilerek çok kısa bir sürede ölçüme başlanabilmektedir. Analiz çözeltilisinin hazırlanması: 1 nolu şişe üzerine 50 ml saf su ilave edin ve kuvvetli bir şekilde 1 dk süresince çalkalayınız. Bu süre sonunda analiz çözeltiniz hazır olacaktır. 2 Standart protein çözeltisinin hazırlanması: 2 nolu şişede bulunan protein standardını kullanarak, saf suyla 100 g/l, 75 g/l, 50 g/l ve 25 g/l çözeltilerini hazırlayınız. Hazırladığınız dört farklı derişimdeki protein çözeltilerini kalibrasyon grafiğinin üretilmesinde kullanacaksınız. 3 STABĐLĐTE Analiz kimyasalları oda sıcaklığında 12 ay saklanabilmekte ve bu süre içerisinde herhangi bir problemle karşılaşılmadan kullanılabilmektedir. ÖRNEK HAZIRLAMA Örneğin berrak ve homojen olması gerekmektedir. Berrak ve homojen olmayan örneklerde uygun prosedürler kullanılarak berrak ve homojen hale getirilmelidir. Örneğin 150 g/l den fazla protein içermesi durumunda % 0.9 luk NaCl çözeltisi ile seyreltilmesi gerekmektedir. Seyreltme işlemi, aşağıdaki tabloya uygun olarak gerçekleştirilir. Protein derişimi (g/l) Örnek + Etanol Miktarı Seyreltme Faktörü < > ANALĐZ BĐLGĐLERĐ Spekrofotometre dalga boyu: 540 nm Küvet: 1 cm standart (Plastik veya cam) Spekrofotometre sıfır ayarı : Kör çözeltisi ANALĐZ PROSEDÜRÜ 1. Çözeltileri prosedüre göre hazırlayınız. 2. Test tüplerini numaralandırınız (kör, standart ve örnekler). 2 Analiz çözeltisi 50 analiz gerçekleştirmek üzere hazırlanmıştır. Pek çok UV-Vis spektrofotometrede standart 10 mm ışık yoluna sahip olan kuvetler kullanılması durumunda 2.0 ml çözelti hacmi yeterli olmaktadır. Bu hacmin kullanacağınız spekrofotometrede sağlıklı ölçüm yapmak için yeterli olup olmadığını kontrol ediniz ve yeterli olmaması durumunda analiz çözeltisinin hacmini arttırınız. 3 Kalibrasyon grafiğinin hazırlanmasında kullanılmak üzere hazırlanan standart protein çözeltilerinin günlük olarak hazırlanması tavsiye edilmektedir. Yapılan denemelerde 2-8ºC de saklanan standart çözeltilerin 1 hafta süresince herhangi bir problemle karşılaşılmadan kullanılabileceği saptanmıştır. -2-

3 3 3. Test tüplerine ml örnek veya standart çözelti koyunuz. 4. Test tüplerinin ve analiz çözeltilisinin oda sıcaklığına gelmesini sağlayınız. 5. Tüplere 1 ml protein analiz çözeltisi (1 nolu şişe) ilave ediniz ve karıştırınız. 6. Tüplere oda sıcaklığında (20-25 ºC) 10 dk inkübe ediniz. 7. Kör çözeltisini kullanarak spektrofotometreyi sıfırlayınız nm de absorbans değerlerinizi ölçünüz, ölçümlerde ışık yolu 10 mm olan cam veya plastik küvet kullanınız. 4 Analizin kolay takip edilebilmesi için aşamalar tabloda özetlenmiştir. KÖR ÖRNEK Örnek veya standart ml Saf su ml - Tüplerin ve analiz çözeltisinin oda sıcaklığına gelmesini sağlayınız. Protein analiz çözeltisi (1 nolu şişe) 2.0 ml 2.0 ml Tüplere oda sıcaklığında (20-25 ºC) 10 dk inkübe ediniz. Kör çözeltisini kullanarak spekrofotometreyi sıfırlayınız. 540 nm de absorbans artışını ( A) ölçünüz. KALĐBRASYON GRAFĐĞĐNĐN ÇĐZĐLMESĐ VE ÖRNEK PROTEĐN DERĐŞĐMĐNĐN HESAPLANMASI Farklı derişimlerde hazırlanan protein standart çözeltileri kullanılarak derişimabsorbans grafiğini çiziniz ve eğilim çizgisini orijinden geçiriniz. 5, 6 Eğilim çizgisinin L eğimini (M, abs x g protein ) saptayınız. SF: Seyreltme faktörü. Absorbans artışı ( A) Protein derişimi (g/l) = X SF Protein kalibrasyon grafiğinin eğimi (M) 4 Tek kullanımlık plastik küvetlerin kullanılması tavsiye edilir. 5 Kalibrasyon grafiğini günlük ve hazırlanan her analiz çözeltisi için yeniden çiziniz. 6 Eğilim çizgisinin korelasyon katsayısının (r 2 ) in üzerinde olması gerekmektedir. Bu değerden düşük bir korelasyon değeri elde etmeniz durumunda hazırlamış olduğunuz standart çözeltilerin hazırlanması aşamasında veya analiz aşamasında bir hata yapılmıştır. Olabilecek hataları gözden geçiriniz ve ölçümünüzü tekrarlayınız. -3-

4 4 DOĞRUSALLIK SINIRI, HASSASĐYET ve ÖLÇÜM SINIRI Analiz çözeltisinin g/l derişiminde doğrusal olarak kullanılabileceği saptanmıştır (Şekil 1). Protein analiz kiti 5 g/l ölçüm sınırı değerlerine sahiptir. Düşük oranda protein içeren örneklerde; örnek miktarı arttırılarak ve/veya analiz sürecinde düşük oranda seyreltme yapılarak analizin hassasiyeti arttırılabilir, ölçüm sınırı düşürülebilir. 0.8 Absorbans y = 0.005x R 2 = Protein (albümin) derişimi, g/l Şekil 1. Protein kalibrasyon grafiği DOĞRULUK Protein analiz kitinin ölçüm doğruluğunu saptamak için iki farklı protein derişiminde beş tekrarlı ölçüm alınmış ve ölçümler arasındaki standart sapma değerleri hesaplanmıştır. Standart sapma (ss) değerleri kullanılarak yüzde değişim katsayısı (%DK= ss/ortalama X 100) hesaplanmıştır. Her iki protein derişimi için de %DK değerinin % 5 deneysel hata sınırlarının altında kaldığı saptanmıştır. Protein derişimi (g/l) Standart Sapma % DK 150 ± ± Biyozim tayin kiti kullanılarak tekrarlanabilir doğru sonuçlar üretilebilmektedir. Aynı örnek için gerçekleştirdiğiniz ölçümlerde % 5 in üzerinde farklılığın olması durumunda analiz sürecinde gerçekleştirdiğiniz aşamaların gözden geçirilmesi gerekmektedir. -4-

5 Muhtemel hata kaynakları aşağıda verilmiştir. 1. Yanlış mikro pipet kullanımı, 2. Analiz sıcaklığının kontrolsüz olması, 3. Çözeltilerin iyi karıştırılmaması, homojen olmaması, 4. Örneğin homojen olmaması, bulanık veya renkli olması, 5. Reaksiyon ortamının temiz olmaması. 5 UYARI-I Analiz sürecinde belirtilen inkübasyon sürelerine uyunuz ve reaksiyon ürünlerini bekletmeden bir sonraki aşamaya geçiniz veya absorbans ölçümünü yapınız. Protein reaktif renginin değişmesi çözeltinin bozulduğunun göstergesidir. Renk değişimi gözlenen çözeltileri kullanmayınız. Kontrol örneklerinde sonuç üretilmesi analiz reaktiflerinin bozulduğunun göstergesidir. Bu tür reaktifleri kullanmayınız. Analiz kimyasallarının ve çözeltilerinin gözle veya deriyle temasına izin vermeyiniz. Analiz kimyasallarını ve çözeltilerini herhangi bir şekilde koklamayınız ve içmeyiniz. Protein analiz kiti içerisinde derişik baz çözeltisi bulunmaktadır. Derişik baz çözeltileri kullanılırken dikkatli olunmalıdır. Vücuda temas etmesi durumunda temas eden bölge bol su ile yıkanmalıdır. UYARI-II Bu kitapçıkta; ulusal ve uluslararası yayımlarda yer alan, doğruluğu kesin olarak kabul edilmiş bilgiler yer almakta ve ürünlerimiz bu bilgiler doğrultusunda üretilmektedir. Kullanım koşulları bizim kontrolümüz dışında olduğundan, analiz sonuçlarının doğruluğuyla ilgili üretici firma tarafından herhangi bir garanti verilmemektedir. REFERANSLAR 1. Peters. T. and Biamonte. G.T., Selected Methods for the Small Clinical Chemistry Laboratory. Faulber. W.R., and Meites. S., Ed. 2. Jacques-Silva, M.C. and Rocha, J.B.T., Protein measurement at practical classes for students of pharmacy: a student-centered approach, Biochem.&Mol. Biol.Edu., 28, , (2000). 3. Zaiaa, D.A.M., Verri Jr., W.A. and Zaia, C.T.B.V., Determination of total proteins in several tissues of rat: a comparative study among spectrophotometric methods, Microchem. J., 64: , (2000). -5-

6 6 Notlar -6-