REKOMBİNANT E.coli KÜLTÜRLERİ İLE ENZİM ÜRETİMİNİN KİNETİK ÖZELLİKLERİNİN İNCELENMESİ. Dilek KAZAN, Amable HOKTAÇSU ve Agnes ÇAMURDAN

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "REKOMBİNANT E.coli KÜLTÜRLERİ İLE ENZİM ÜRETİMİNİN KİNETİK ÖZELLİKLERİNİN İNCELENMESİ. Dilek KAZAN, Amable HOKTAÇSU ve Agnes ÇAMURDAN"

Serhat Akar
8 yıl önce
İzleme sayısı:

1 REKOMBİNANT E.coli KÜLTÜRLERİ İLE ENZİM ÜRETİMİNİN KİNETİK ÖZELLİKLERİNİN İNCELENMESİ Dilek KAZAN, Amable HOKTAÇSU ve Agnes ÇAMURDAN Boğaziçi Üniversitesi. Mühendislik fakültesukimya Mühendisliği Bolümü Bebek. Is tanbuljtürkiye A STUDY OF KINETIC PARAMETERS OF ENZYM PRODUCTIVITY OF RECOMBINANT E.coli CULTURE S U M M A R Y The recent developments in molecular biology open the way to the production of valuable proteins (in bio reactors using geneticaly engineereed microorganisms.in.literature.cultured characteristics o f recombinant microorganisms and stability of plasmids have been investigated by many authers. However there are only few experimental and theoretical studies to determine kinetic parametersfor the cloned gene productivity of recombinant microorganisms and kinetic models. The objective o f this study is experimental investigation of enzyme productivity at different growth rate. Enzyme productivity and total RNA are also determined. ÖZET Moleculer biyoloji alanında son yıllardaki gelişmeler ile çok değerli proteinlerin üretimi mümkün olmuştur.yapılan bir çok çalışmada enzim üretimi için kullanılan rekombinant mikroorganizmaların yap ısı.plazmid kararlılığı incelenmiş olmasına rağmen en yüksek enzim üretiminin hangi koşullarda elde edileceği ve kinetic parametrelerin belirlenmesi incelenmemiştir. Bu çalışmada rekombinant mikroorganizma kuliamlarak enzim üretimi deneysel olarak incelenmiş ve değişik büyüme hızlarında enzim verimliliği ve toplam RNA miktan belirlenmiştir. g ir iş Moleküler biyoloji alanında son yıllardaki gelişmeler genetik yapısı incelenmiş mikroorganizmalar ( geneticilly engineered mikroorganisms ) kullanılarak çok değerli proteinlerin üretimini mümkün kılmıştır.bu m ikroorganizm alar " rekom binant DNA teknolojisi " ile üretilmektedir. Bun unla birlikte bu değerli proteinlerin endüstriyel olarak daha büyük çapta üüretimi optimizasyonu gerekli kılmaktadır.enzim üretiminin verimliliği için ise mikroorganizmanın büyüme hızının ve bunun enzim üretimine etkisinin incelenmesi gerekmektedir. Gene tik olarak ise optimizasyon rekombinant mikroorganizmanın kararlılığı ile ilgilidir.. j Literatürde,rekombinant mikroorganizmanın özellikleh-ve plazmid kararlılığı konusunda bir çok çalışma yapılmıştır. C. Parker (1) ve C.A.Sardoninİ (2)i şletme şartlarının büyüme hızına etkisini ve büyüme hızının plazmid kararlılığı ile ilişkisini inceelemiştir.siegel ve çalışma arkadaşları (3) iki kademeli sürekli bir sistemde enzim üretimini incelemiş ve bu konuda bir model geliştirmiştir.bu çalışmaların yanında plazmid kararlılığı deneysel ve teorik olarak bir çok araştırmacı tarafından 28.9

2 incelenmiştir.(4 )Bu çalışmalar göstermiştirki enzim üretiminin verimliliği konusunda yok denecek sayıda az çalışma yapılmıştır.bu çalışmada ise enzim üretiminin verimliliği ve toplam RNA miktarı deneysel olarak incelenmiştir. DENEL BÖLÜM Deneylerde "puc 13" plazmidi içeren E.coli JM109 straini,büyüme ortamı olarak minimal besi yeri "M9 kullanılarak bjaktam az enzimi üretilmiştir.mikroorganizmanm büyüme hızı glukoz konsantrasyoonu değiştirilerek elde edilmiştir. Büyüme hızı absorbansm ve kuru hücre ağırlığının zamanla değişimi ölçülerek saptanmıştır. Glukoz miktan Nelson" metodu kullanılarak belirlenmiş tir.bjaktamaz miktan "Macro Iodimetrik" yöntem ile.toplam RNA miktarı ise Orcinol" metodu ile saptanmıştır. SONUÇLAR VE TARTIŞMA Mikroroganizmanın büyüme hızının enzim üretimine etkisini incelemek amacı ile yapılan deneylerin tümü sabit sıcaklık ( 37 oc ) ve ph ( 7.2-7A ) değerinde gerçekleştirilmiştir.büyüme hızının değişimi besi yerinin içerdiği glukoz konsantrasyonu değiştirilerek elde edilmiştir.deneyler 5 değişik glukoz konsantrasyonunda (2,4,8,16 ve 32 gr/1) gerçekleştirilmiş ve enzim aktivitesi, hücrenin kuru ağırlığı ölçülmüştür."şekil 1-3", 2 gr/l glukoz konsantrasyonunda elde edilen sonuçlan göstermektedir. Diğer konsantrasyonlardada aynı değişim gözlenmiştir. Grafiklerden görülmektedir ki en yüksek enzim miktarı logaritmik büyüme periyodunun sonunda elde elde edilmekte daha sonre hücre sayısındaki azalmaya bağımlı olarak azalmaktadır Glukoz miktarının mikroorganizmanın büyüme hızına etkisi incelendiğinde ise " Şekil 4 " maksimum büyüme 16 gr/i glukoz konsantrasyonunda elde edilmiş,daha yüksek konsantrasyonlarda glukozun büyümeyi inhibe etmeesinden dolayı azalmıştır,buna bağımlı olarak spesifik ve bulk enzim aktiviteleri " şekil 5 "de de görüldüğü gibi '16 gr/1 ' glukoz konsantrasyonunda en yüksek değerine ulaşmıştır. "Şekil 6" değişik büyüme hızlannda RNA konsantrasyonundaki değişimi göstermektedir. Şekilden görüldüğü gibi büyüme hızının artmasına bağımlı olank RNA konsantrasyonu artmaktadır.çünki RNA hücrenin en aktif bölümüdür. Jens Nielsen ve çalışma arkadaşlaarı (6).Hander.A. ve çalışma arkadaşlarının elde ettiği sonuçlar incelendiğindede aynı değişim gözlenmiştir. A o Şekil 1. 2 gr/l de Kuru Hücrenin Zamanla Değişimi Şekil 2. 2 gr/l de Glukoz Konsantrasyonunun Zamanla Değişimi

3 1 ö ı 6 4 n Şekil 3. 2 gr/l de Enzim Activitesinin Zamanla Değişimi 40 *3 15 O glujkoz kon. (gr/l) Şekil 4. En Yüksek ve Ortalama Büyüme Hızının Glukoz Konsantrasyonu ile Değişimi 292 i

4 B *"* oeö ««< d « glııkoas kon.(gr/l) 40 Şekil 5, Enzim Actlvitesinİn Glukoz Konsantrasyonu ile Değişimi u M A 1W & -»N *4 5 En yüksek büyüme hizi (l/saat) Şekil 6. RMA Miktarının En Yüksek Büyüme Hızı ile Değişimi 293

5 TEŞEKKÜR Bu çalışmada bizi destekliyen " Boğaziçi Oniversİtesi Araştırma Fonu na teşekkür ederiz. KAYNAKLAR 1. C.Parker," Effect of Growth Rate and Expression Level on Plasmid Stability ", Biotechnology and Bioengineering. 29 ( 1987} C.A.Sardonini, " A Model for Growth of S.cerevisiae Containing a Recombinant Plasmid in Selective Media ", Biotechnology and Bioengineering. 29 { 1987) R.Siegel aand D.D.Y.Ryu, A Segregated Model and Product Synthesis in Binary Fission Recombinant Microorganisms ", Biotechnology and Bioengineering. 27 ( 1985) Jin-Ho Seo, " Effects of Recombinant Plasmid Content on Growth Properties and Cloned Gene Product Formation in E.coli ", Biotechnology and Bioengineering. 27 (1985) J.Nielsen.A.G.Pedersen,K.Strudsholm.and J.Villadsen. " Modelling Fermentations with Recombinant Microorganisms ::Formulation of a Struuctured Model ", Biotechnology and Bioengineering. 37 (1991)

Benzer belgeler

Rekombinant DNA Teknolojisi-II

BYM613 Genetik MühendisliM hendisliği Rekombinant DNA Teknolojisi-II Hacettepe Üniversitesi Biyomühendislik BölümüB 2012-2013 2013 Güz G z DönemiD Dr. Eda Çelik-AKDUR edacelik@hacettepe.edu.tr İçerik (2