Rahim ağzı kanseri hücreleri doku kültürü mikroskopik görüntüsü.

Transkript

1 Doç.Dr.Engin DEVECİ

2 HÜCRE KÜLTÜRÜ

3

4 Hücre Kültürü Araştırma Laboratuvarı, çeşitli hücrelerin invitro kültürlerini yaparak araştırmacılara kanser, kök hücre, hücre mekaniği çalışmaları gibi konularda hücre içi ve hücreler arası biyokimyasal olayların moleküler düzeyde incelenebilmesi için devamlı olarak hücrelerin temin edilmesi ve bu hücrelere istenilen deneysel uygulanmaların yapılması için kurulmuştur. Rahim ağzı kanseri hücreleri doku kültürü mikroskopik görüntüsü.

5

6 Hücre kültürü besiyerleri laboratuar ortamında hücrelerin normal metabolik aktivitelerini sürdürebilmeleri için gerekli olan mikroçevreyi sağlayan besleyici solusyonlardır. Hücre kültürü besiyerleri içeriklerindeki aminoasit, karbonhidrat, vitamin ve iyonlarla hücrelerin gelişimini desteklerler.laboratuar ortamında hücrelerin çoğaltılabilmesi için uygun ph sıcaklık ve nemin sağlanması çok önemlidir. Hücre kültürü besiyerleri içeriklerindeki iyonlarla gerekli ozmolarite ve ph ı da sağlarlar

7 HÜCRE KÜLTÜRÜ Hücre kültür ortamının hazırlanması ve içeriği Beslenme Pasajlama Sayım Dondurma

8 Katı (agarlı) besiyerinde sayım, canlı hücrelerin koloni oluşturması ve bu kolonilerin sayılarak «her canlı hücre 1 koloni oluşturur» prensibi ile materyaldeki canlı hücre sayısının hesaplanması esasına dayanır. Bu amaçla sayım yapılacak materyalden belirli bir miktar alınır ve besiyerine aktarılır. Koloni oluşması için gerekli inkübasyon süresinin sonunda Petri kutusundaki koloniler sayılarak materyaldeki canlı hücre sayısı hesaplanır. Ölü hücreler üreyip koloni meydana getiremeyeceği için bu yöntemde sadece canlı hücreler sayılır.

9

10 Hücre Kültür ortamında kullanılan cihazlar Steril çalışma kabini CO2 inkübatörü yada CO2 tankı İnverted mikroskobu Santrifüj Vakum hattı yada pompası Otoklav Sıvı azot tankı

11 Hücre Kültürü Primer Kültürler;Doğrudan dokudan elde edilen hücre kültürleridir.elde edildikleri dokunun özelliklerini taşırlar Hücre Hatları;Primer hücrelerin spontan mutasyonu,kimyasal madde uygulanması ile mutasyon oluşturularak elde edilen ölümsüz hücre tipleridir.

12

13 Kültür Ortamlarının Temel Bileşenleri İnorganik tuzlar Karbonhidratlar Aminoasitler Vitaminler Yağ asitleri ve Lipidler Proteinler ve Peptidler Serum

14 Hücre Kültür Ortamları DMEM(Dulbecco's Modification of Eagles Medium);çoğu memeli hücresinin üremesini destekler RPM 1640 (L-glutaminli);Özellikleri hemapoetik sistem hücrelerinin üretilmesinde kullanılır Ham s F10 ve F12 (Besleyici karışım) F10-insan diploid hücreler,sıçan,tavşan F12-Sıçan hepatosit,prostat Fischer s medium-lenfoblast Iscove-Eritroblast,makrofaj

15 Besleme İşlemi Ekimi yapılan hücrelerin yapışması beklendikten sonra besleme amacı ile ortam değiştirir. Hücreler zemini kapladığında ise hücreler ya pasajlanır yada dondurulur.

16 Hücre Kültürlerinin Hazırlanması A-Pasajlama (subkültür) Hücrelerin pasajlanabilmesi için hücre kültür flakslarının yüzeyini kaplamış olmalıdır.böyle flakslara konfulent flakslar denir.pasajlama işlemi hücreler sıkışık konumda olduğu için yapılır.ve daha geniş alana yayılır.pasajlama işlemi besi ortamı içerisindeki hücrelerin nutrientleri tüketmesinden dolayı üreme hızlarının düşmesini ölümlerini önlemek amacı ile yapılır

17 Pasajlama işlemi tutunarak çoğalan hücrelerde ve süspanse kültürlerde farklı yapılır: Süspanse kültürlerde pasajlama yapılırken; kültür eşit şekilde santrifüj tüplerine dağıtılır ve santrifüj edilerek kullanılmış besi ortamı atılır.daha sonra uygun besi ortamıyla dilue edilerek platelere ya da flasklara ekim yapılır. Bazı hücre türlerinin pasajlaması yapılırken kullanılmış besi ortamından bir miktar tekrar besi ortamına eklenir.

18 B-Hücrelerin Dondurulması Hücre kültürünün uzun süre devam etmesi kontaminasyon ve üreme hızının düşüşü gibi olumsuzluklara yol açar.bunun önüne geçebilmek için hücreler dondurulur. Dondurma işleminin başarısı,çözdürme işleminin sonunda hücre canlılık oranının yüksek olması ile orantılıdır

19 Dondurma Prosedürü Su banyosu 37C ye ısıtılır. Hücre besi ortamı ve serum su banyosunda 37 C ye ısıtılır Hücre Pasajlanması protokolünde belirtildiği şekilde hücre pelleti elde edilir. Hücre pelleti, 1 ml dondurma ortamı içinde süspande edilir ve cryovial adı verilen tüplere konulur.hücrelerin bulunduğu tüpler dondurma kabına konulur ve -80C de bir gece bekletilir. Ertesi gün sıvı azot tankına transfer edilir.

20 C- Hücrelerin çözülmesi Başka laboratuardan gönderilmiş yada üzerinde yapılan çalışmaya daha sonra devam edilmek üzere dondurulmuş olan hücre kültürleri,yeni kültürler üretilmesi amacı ile tekrar çözülürler

21 Kan lenfosit hücreleri için kültür süresi genellikle 72 saattir. Fibroblast kültür süresi hücrelerin canlılık oranına, sayısına ve aktivasyonuna bağlı olarak değişmekte ortalama gün veya daha uzun sürebilmektedir. Kan lenfosit kültürü için 37 C lik etüv, fibroblast kültürleri için 37 C, %5 CO2 li etüv ortamına gerek vardır. Kültürün son 2 saatinde hücreleri mitoz aşamasında durdurmak için kültürlere kolsemid ilavesi yapılırfibroblast kültürlerinde hücrelerin flask tabanında tutunarak çoğalmaları beklenir. Hücre kolonileri belirli bir yoğunluğa ulaşana kadar kontrol edilir ve medium değişimleri yapılır.yeterli hücre elde edileceğine karar verildiğinde harvest işlemi başlatılır

22 1. Örnek materyalin (tümör dokusu, biyopsi materyali, kemik iliği, periferik kan, veya ascite ) laboratuara teslimi. 2. Materyalden enzimatik ve mekanik yollarla tümör hücre süspansiyonunun elde edilmesi. 3. Hücrelerin sayılması, 96 kuyucuklu plaklara ( hücre/kuyucuk) ekimi ve takibinde hücrelerin hekimin karar verdiği veya Karar Lab.ın her tümör tipi için belirlenmiş ilaç panel listesindeki kemoterapötik ilaçların farmakokinetik verilere göre belirlenmiş 6 farklı dozu ile hücre kültür ortamında muamele edilmesi