HLA Tiplendirmesinde Yeni Nesil Dizileme. Dr. Türker DUMAN

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "HLA Tiplendirmesinde Yeni Nesil Dizileme. Dr. Türker DUMAN"

Süleiman Dalkılıç
8 yıl önce
İzleme sayısı:

1 HLA Tiplendirmesinde Yeni Nesil Dizileme Dr. Türker DUMAN

2 MHC MHC bölgesi Kr. 6p21 de lokalize olan 4 mega baz yaklaşık 220 gen Genomunun en yoğun bölgesidir, genomun büyüklük olarak yaklaşık % 0.1 ine karşılık gelirken bu bölgedeki genler tüm genlerin % 0.6 sını oluşturur. Bölgedeki genlerin bir çoğu adaptif immün cevaptan sorumludur, genlerin yaklaşık %20 si immünite ile ilişkilidir Human lökosit antijeni (HLA), bu genetik bölgenin çekirdekli hücrelerin yüzeyinde eksprese olan ve alloreaktiviteden sorumlu hücre yüzey glikoproteinlerini kodlayan bölümüdür. HLA genleri genomun en polimorfik genleri

1 ine karşılık gelirken bu bölgedeki genler tüm genlerin % 0.6 sını oluşturur.

3 MHC bölgesinde bulunan genler

5 HLA genlerinin doku ve organ transplantasyonunda önemli bilinmektedir Transplantasyonda doku reddi immün sistemin yabancı antijene karşı normal bir yanıtıdır.

6 HLA Tiplendirmesi HLA Tiplendirmesindeki amaç bu alellerin ve kodladıkları antijenlerin belirlenmesidir. HLA bölgesindeki polimorfizmleri belirlemek için çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Terasaki ve Mc Clelland tarafından bulunan hücresel temelli serolojik yöntemler yaklaşık 50 yıldır kullanılmaktadır bu yöntemlerin çeşitli teknik dezavantajları ve bu olağanüstü çeşitliliği karşılamada yetersiz kalmaktadır Son 30 yılda rekombinant DNA teknolojisi, Sanger zincir sonlanma dizileme yöntemi, Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi moleküler genetik yöntemlerin kullanılmasıyla bu sıra dışı alelik çeşitlilik ortaya konulabilmiştir

Terasaki ve Mc Clelland tarafından bulunan hücresel temelli serolojik yöntemler yaklaşık 50 yıldır kullanılmaktadır bu yöntemlerin çeşitli teknik

Sınıf I zar içinde sabitlenmiş bir ağır zincir ve beta-2-mikroglobulin oluşan heterodimerdir. Ağır zincirde 2 ve 3. ex sınıf I moleküllerinde peptid bağlama özgünlüğü sorumludur.

7 Sınıf I zar içinde sabitlenmiş bir ağır zincir ve beta-2-mikroglobulin oluşan heterodimerdir. Ağır zincirde 2 ve 3. ex sınıf I moleküllerinde peptid bağlama özgünlüğü sorumludur. Sınıf II molekülleri, Alfa ve Beta zincirlerinden oluşan bir heterodimerdir. DR Beta zinciri peptide bağlanma özgüllüğünü veren polimorfizmileri içerir. pp zincirin birinci domaini kodlayan 2. ekzon alel farklılıklarının büyük kısmından sorumludur. HLA klas II tiplendirmesinde 2. ekzona odaklanmıştır

Sınıf II molekülleri, Alfa ve Beta zincirlerinden oluşan bir heterodimerdir.

8 Moleküler Yöntemler Yaygın DNA temellidir Serolojik olarak ayırt edilemeyen fakat fonksiyonel olarak ayrı olan HLA alellerini tiplendirmek için geliştirilmiştir yılında Southern Blot ve RFLP yöntemiyle başlamıştır PCR yönteminden sonra giderek yaygınlaşmıştır PCR-SSP PCR-SSO PCR-SBT Sanger sekanslama en yüksek çözünürlük sunar ve referans yöntem olarak kabul edilir.

1987 yılında Southern Blot ve RFLP yöntemiyle başlamıştır PCR yönteminden sonra giderek

9 Sanger Dizileme Doğruluk ve uzun okuma aralığı ( ) yaklaşık 30 yıldır genotiplendirme için altın standart olarak kabul edilmektedir. Yüksek maliyet, düşük verimlilik, yüksek iş gücü özellikle büyük bölgelerin sekanslamasında sıkıntı yaratmaktadır.

10 HLA tiplendirmesinde Sanger HLA bölgesindeki polimorfizm yüzdesi yüksek çözünürlükteki tiplendirmeyi zorlaştırmaktadır. Tiplendirme de belirsizlik (ambiquity) Polimorfik bölgelerdeki nükleotidlerin cis- trans pozisyonu amplifiye edilen bölge dışındaki polimorfizmlerden kaynaklanmaktadır

Tiplendirme de belirsizlik (ambiquity) Polimorfik bölgelerdeki

11 Yeni Nesil Dizileme (NGS) Sanger yönteminin kısıtlamaları daha ucuz ve hızlı sekans teknolojilerine olan ihtiyacı arttırmıştır Bu ihtiyaç yeni nesil dizileme yöntemlerinin doğmasına yol açmıştır NGS platformları yüksek hacimde paralel dizileme yaparak milyonlarca DNA fragmentini eş zamanlı bir şekilde sekanslar. Bu sayede tüm genomun bir günden kısa sürede sekanslanması mümkündür.

doğmasına yol açmıştır NGS platformları yüksek hacimde paralel dizileme yaparak milyonlarca DNA

12 HLA tiplendirmesinde NGS NGS intronların da dahil olmak üzere büyük bölgeleri Uygun maliyet Uygulama kolaylığı Hızlı dizileme HLA için klonal amplifikasyon yaparak cis-trans pozisyon bilgisini vermesiyle HLA tiplendirmesinde avantajlar sağlamaktadır

dizileme HLA için klonal amplifikasyon yaparak cis-trans

13 NGS Farklı NGS platfomları geliştirilmiştir. Sekanslama aşaması için günümüzde yaygın olarak kullanılan platformlardan öne çıkan bazıları Roche 454 İllumina Miseq İon-torrent

14 Pirosekanslama İlk yüksek verimli (high-throughput) sekanslama teknolojisi, Roche firması tarafından 2005 yılında piyasaya sürülen 454 prosequencing cihazıdır (Margulieset 2005). Bu cihaz pirosekanslama tekniği denilen bir yöntem ile çalışmaktadır. Pirosekanslama sentezleyerek sekanslama prensibine dayanmaktadır. Sanger sekanslamadan farkı, dideoksinükleotid ile zincir sonlanma tekniği yerine nükleotid birleşmesi sonucunda salınan pirofosfatın belirlenmesine dayanmasıdır.

Bu cihaz pirosekanslama tekniği denilen bir yöntem ile çalışmaktadır.

15 DNA küçük fragmanlara ayrılır ve dizileme primerlerini taşıyan adaptörler eklenir. Adaptörleri taşıyan DNA fragmanları mikroreaktörler içerisinde emülsiyon bazlı klonal amplifikasyon Ardışık olarak akan nükleotitlerinin tamamlayıcı nükleotidin DNA ya bağlanması polimeraz pirofosfat (PPi) açığa çıkmasını sağlar. ATP sülfirilaz PPi'ı kantitatif olarak ATP'ye dönüştürür ATP, lüsiferaz enzimi aracılığıyla lusiferinin oksilusiferine dönüşmesini sağlar. Oksilusiferin görülebilir bir ışık yaratır Bu ışığın şiddeti ATP miktarıyla doğru orantılıdır ve bu sayede tek nükleotid tekrarları tespit edilir. Bu ışığı yaratan kemilüminesan sinyalin hangi nükleotidin bağlanması sırasında oluştuğu tespit edilir. Ortaya çıkan bu ışık CCD kamera tarafından kaydedilir

pirofosfat (PPi) açığa çıkmasını sağlar. ATP sülfirilaz PPi'ı kantitatif olarak ATP'ye dönüştürür ATP, lüsiferaz enzimi aracılığıyla lusiferinin oksilusiferine dönüşmesini sağlar.

16 Roche 454 genotiplendirmede kullanılan ilk yeni nesil sekanstır Fakat sangere göre maliyet ve verim açısından çok fazla bir ilerleme değildir. Daha kısa okuma uzunluğuna sahip NGS platformlarında 454 e göre daha düşük maliyet ve daha yüksek veri avantajı vardır.

17 ILLUMİNA Illumina platformu polimeraz temelli sentezleyerek sekanslama ve köprü amplifikasyonu yöntemini kullanmaktadır. Illumina firması tarafından piyasaya sürülen ilk cihaz Genome Analyzer dır. Daha sonra yüksek kapasiteli HiSeq ve ticari laboratuvarlar için MiSeq cihazları da aynı firma tarafından piyasaya sürülmüştür. Illumina NGS Sistemi HLA dışı uygulmalarda kullanılan en yaygın NGS platformudur. * Bu cihazlar da adaptör bağlanmış DNA kütüphanelerine ihtiyaç duymaktadır, sekanslanacak bölgeler adaptörler yardımı ile çoğaltılmaktadır. Reaksiyon, yüzeyinde oligonükleotidlerin bulunduğu flow cell adı verilen özel aparatlarda gerçekleşmektedir. Teknik üç temel aşama içermektedir. Bunlar; hedef bölgelerin seçimi (capture), seçilen bu bölgelerin sekanslaması ve veri analizidir *Liu L et al. J Biomed Biotechnol 2012:2012:251364

Illumina NGS Sistemi HLA dışı uygulmalarda kullanılan en yaygın NGS platformudur.

19 Ion-Torrent DNA'nın polimerizasyonu sırasında ortaya çıkan Hidrojen iyonlarının saptanmasına dayanır. Tek bir Kalıp DNA dizisini içeren mikrokuyuya tek tip nükleotid akışı uygulanır. Verilen nükleotid kalıp ipliğe komplementer olduğu durumda yeni oluşan ipliğin yapısına katılır ve hidrojen iyonu salınımı olur. Hidrojen iyonlan hipersensitif iyon sensorleri tarafından algılanır. Kalıp DNA'da nükleotid tekrarlarının varlığı durumunda tek siklusta birden fazla nükleotid yeni ipliğin yapısına girer, salınan hidrojen iyonları artar ve daha fazla elektronik sinyal elde edilmesiyle DNA dizisi belirlenir

Verilen nükleotid kalıp ipliğe komplementer olduğu durumda yeni oluşan ipliğin yapısına katılır ve hidrojen iyonu salınımı olur.

22 NGS ve Sanger temelli dizilemede çözünürlüğün karşılaştırılması -Lange et al. BMC Genomics 2014,15:63

23 Veri Analizi Kısa okuma uzunluklarına sahip Roche, Illumina, Iontorrent NGS platformlarının tek bir DNA küçük parçalara ayrılarak sekanslanmaktadır Bu küçük baz dizileri daha sonra bilinen bir referans genom kullanılarak yada bilinen HLA alellerinin verileri ile kıyaslanarak birleştirilmektedir Elde edilen sekansların kalitesini belirleyebilmek için doğru bir DNA referansı gereklidir HLA bölgesinin hiper polimorfik doğası polimorfizmleri doğru sıralanabilmeleri için zorluk oluşturabilmektedir

24 HLA Database HLA veri bankası bugüne kadar HLA nın daha polimorfik bölgelerine odaklanmıştır. NGS yaygınlaştıkça ve dizileme bölgeleri genişledikçe veribankasına yeni alellerin girişi artacaktır 2010 yılında güncellenen HLA numenkülatorü yeni bölgelerden gelebilecek dizi bombardımanını karşılamaya uygun Bu güne kadar tecrübeler sınıf1 için ex 2,3 ve sınıf 2 için ex2 bölgelerine dayanan HLA uyum algoritmaları üzerinde büyük bir etkisi olmayacağını düşündürmektedir Sekans verilerindeki artışla beraber klasik ex lar dışındaki polimorfizmlerin etkilerinin klinik olarak araştırılmasını gerektirmektedir.

Benzer belgeler

HLA Tiplendirmesi PCR-SSP. Türker Duman PhD

HLA Tiplendirmesi PCR-SSP. Türker Duman PhD HLA Tiplendirmesi PCR-SSP Türker Duman PhD Büyük Doku Uygunluk Kompleksi (Major Histocompatibility Complex - MHC) İlk olarak farklı fare suşlarında deri naklinin reddiyle tanımlanan genetik bölgedir Alloreaktiviteden