Nefrologlar için transplantasyon temel immünoloji. Dr. Fatma Savran Oğuz İ.Ü İstanbul Tıp Fakültesi Doku Tipleme Laboratuvarı

Transkript

1 Nefrologlar için transplantasyon temel immünoloji Dr. Fatma Savran Oğuz İ.Ü İstanbul Tıp Fakültesi Doku Tipleme Laboratuvarı Antalya 20 Ekim 2017

2 Sunum Planı İmmün tanıma HLA alelleri Anti HLA antikorları CXM (CDC-CXM, Flow CXM) PRA Luminex Virtual XM DSA

3 İmmün Tanıma HLA moleküllerince sunulan yabancı peptidin T hücrelerince tanınmasıdır. TCR Yabancı peptid MHC/HLA molekülü Hücresel ve hümoral immün cevabı ortaya çıkarırlar.

4 T lenfosit aktivasyonu; Antijen sunan hücre yüzeyi T hücre yüzeyi MHC/antijen kompleksinin, T cell reseptör (TCR)/CD3 tarafından tanınması ve kostimulatör yolakların aktive olmaları gereklidir. Ch. 17

5 T hücreleri ve ASH arasındaki etkileşim Hücre Yüzey molekülleri B7 CD40 CD28 CD11a/CD18 İntersellüler adezyon molekülleri ICAM-1 B7/CD28/CTLA-4 ko-stimulatör yoludur. CD28, B7 ligandına bağlanarak T hücrelerini aktive eder

6 Ligand-reseptör çifti ko-stimulatör olarak görev görür. B7/CD28/CTLA-4 ko-stimulatör yoludur. CD28, B7 ligandına bağlanarak T hücrelerini aktive eder Bu aktivasyon T hücre çoğalması, sitotoksik lenfositlerin oluşumu ve lenfokin/sitokinlerin üretimi ile sonuçlanarak immun reaksiyonları potansiyalize eder

7

8 İmmun Yanıtın İnhibisyon ve Regülasyonu; TCR sinyalizasyonu inhibe ederek, IL-2 üretimini bloke ederek, T hücre siklusunu baskılayarak, CD4+ CD25+ regülatör T lenfosit (Treg) oluşumunu sağlayarak, T hücre anerjisine ve T hücre apoptozisine yol açarak sağlanır.

9

10 Transplantasyon öncesi immünolojik tetkikler 1. Kan Grubu Tayini 2. HLA fenotip /genotipinin tayini Moleküler yöntemler 3. Anti-HLA Antikor taramaları PRA (Luminex) Single Antijen Bead (Luminex) Crossmatch CDC Flowsitometri

11 HLA gen bölgesi yüksek oranda polimorfik bir bölge olup, Sınıf I ve II HLA alleleri olmak üzere toplam farklı allel içermektedir ( 2017). Düşük rezolüsyonlu Allel grubunu belirler ör: HLA-A*01 HLA Yüksek rezolüsyonlu Allelik düzeyde tiplendirme ör: HLA-A*01:01 HLA allellerinin sıklıkları ve dağılımları popülasyonlar arasında, etnik kökene göre farklılık gösterir.

12 İki DR beta lokusu taşıyan kromozomlarda bazı HLA-DR allelleri sık olarak birlikte görülür DRB1*04 DRB1*07 DRB1*09 HLA-Kalıtım DRB4 DR53 DRB1*03 DRB1*11 DRB1*12 DRB1*13 DRB1*14 DRB3 DR52 DRB1*15 DRB1*16 DRB5 DR51

13 HLA uyumu böbrek graft sağkalımı için önemlidir

14 Transplantasyon sonrası De novo DSA ile kötü graft sağkalım ilişkisi HLA uyumu graft rejeksiyonu sonrası yüksek sensitizasyonu önler

15 HLA uyumu rejeksiyon sonrası hastaları aşırı sensitize olmaktan korur HLA uyumsuzluğu ne kadar fazla ise antikor oluşumu da o kadar fazladır. Bekleme listesindeki hastaların sensitizasyon durumu

16 HLA genleri çok polimorfik, HLA antijenleri çok fazla Tam uyumlu donor bulmamız zor Pekçok hasta HLA uyumsuz donorden graft alır Her MM antijene karşı antikor oluşmaz rejeksiyon olmaz Bir hastanın non immunojenik HLA MM tahmin etmek mümkün mü? Sensitize hastalar için kabul edilebilir veya edilemez MM leri antikor reaksiyon testleri yapmadan öngörmek mümkünmüdür?

17 Biz genellikle HLA antijenine karşı ortaya çıkan antikor spesifitelerinden bahsederiz Örnek : anti-hla-a1 anti-hla-b7 anti-hla-dr1 Fakat antikorlar neyi görürler?

18 HLA Antikorları Önemlidir HLA antikorları allograft rejeksiyon trans ransplant kaybı HLA antikorları epitopları tanırlar HLA epitopları transplantasyonda önemlidirler Anijenite, epitopların antikor ile reaktivitesi İmünojenite, antikor yanıtını indükleme yeteneğii

19 HLA-ABC 270, HLA-DRB1/3/4 147, HLA-DQB1 57, HLA-DQA1 24, HLA-DPB1 43, HLA-DPA1 15, MICA 67 Toplam 623 polimorfik eplet belirlenmiştir. Duquesnoy R. Transplant Immunology 31 (2014) 1 6

20 Anti-HLA antikorları nasıl saptanır? Antijen havuzu, fenotip paneli=panel reaktif antikor (PRA) Hastanın serumundaki tüm antikorlar DSA: Donör spesifik antikor Cross-match CDC ve Flow CM PRA testi Luminex Single Antijen Bead Luminex

21

22 Nasıl belirliyoruz? HLA antikorları Tarama (PRA) Tanımlama (PRA) Tek antijen boncuk (SAB ) Ortalama floresan yoğunluğu (MFI değerleri)

23 PRA Yüksek oranda sensitize hastalar, %85 Eurotransplant Kalite Kontrol Programı aynı serumun %PRA değerinin farklı laboratuvarlar arasında %5-80 değişiklik gösterdiğini, HLA antikor spesifisitesinin ise oldukça uyumlu olduğunu cpra reaktif HLA antijenlerinin popülasyonda bulunma olasılığı hesaplanır. PRA pozitifliği daha gerçekçi

24 Antikor testleri Bir hastanın antikor durumundaki değişikliği tespit etmenin en iyi yolu hastadan her ay kan örneği alıp, antikor testi yapmaktır. PRA Anti-HLA antikor testi için önerilen aralıklar, 3 ayda bir ya da 6 ayda bir Hastalar, tercihen diyalizlerinin ertesi günü olacak şekilde, 6 aylık aralıklarla anti-hla antikor tayini için kan vermek üzere yönlendirilmelidir.

25 Nakil sonrası dönemde, anti-hla antikor tayini pek çok laboratuarda rutin bir uygulama olmamakla birlikte, merkezler özellikle nakil sonrası 1., 7.,14.,21.,28. gün, 3.ay, 6. ay ve 12. aydaki serum örneklerini toplamak konusunda hassas olmalılardır.

26 XM Serolojik Yöntem ( Mikrolenfositotoksisite ) Flow-Sitometri ELISA

27 CM modifikasyonları Alıcının serumunun seri dilusyonları yapılır (½, 4,8,16,32,64) Antihuman Globulin (AHG) Donor hücreleri üzerindeki her bir DSA bağlanır. Kompleman komponentleri ile ilişkili total Fc reseptor sayısının amplifiye olmasını sağlayarak, kompleman aktivasyonu ve hücre lizisi artar

28 DSAb varlığında Negatif CM mümkün mü? Antikor titresi Kompleman aktivasyonu Kompleman aktive etmeyen Ab olabilir Ab ile bağlanabilecek spesifik Ag donor lenfositleri üzerinde çok düşük ifade edilebilir

29 Flow Sitometri Cross- Match Daha hassas olan flow sitometri cross-match (FC-XM), bir çok nakil merkezinde DSA tespitinde kullanılan hücre tabanlı mevcut en iyi testlerden birisidir

30 Flow Sitometrik Cross Match Alıcı serum Donör lenfositleri Alıcı serum Floresan işaretli Ab Anti IgG Negatif crossmatch Pozitif crossmatch

31 Neden FCXM? Düşük düzeydeki HLA Sınıf I antikorlarını Sınıf II antikorlarını Antikorun hedef hücresini T- XM ve B XM Tüm IgG alt gruplarını saptar.

32 Mean Fluorescence Intensity (Ortalama Floresans Yoğunluğu- MFI): Belirli sayıdaki boncuktan salınan floresansın aritmetik ortalamasıdır. Serumdaki antikor yoğunluğunu kantite eder.??? Negatif MFI değeri: <1000 Zayıf pozitiflik MFI değeri: Orta pozitiflik MFI değeri: Kuvvetli pozitiflik MFI değerleri:

33 Medyan kanal kayması (MCS): Sekonder antikordan yayılan floresans detektör tarafından toplanır ve elektriksel bir sinyale dönüştürülür. Elektriksel uyarılar, özel yazılım algoritmaları kullanılarak sayısal bir değere dönüştürülür. Analiz: negatif kontrol karşısında test serumunun ortalama floresan yoğunluğunun (MFI) medyan kanal kaymasının (MCS) hesaplanması

34 <60 medyan kanal kayması (MCS) T FCXM (-) <100 medyan kanal kayması (MCS) B FCXM (-) >150 medyan kanal kayması (MCS) T/B FCXM (+) > 300 medyan kanal kayması (MCS) kuvvetli T/B FCXM (+)

35

36 Flow Sitometrik XM reaksiyon paternleri T hücre B hücre Yorumlama Negatif Negatif HLA antikoru YOK veya çok düşük titre Negatif pozitif Öncellikle Sınıf II antikoru Negatif Zayıf pozitif Zayıf Sınıf I veya II antikoru pozitif pozitif Kuvvetli Sınıf I antikoru veya Sınıf I ve Sınıf II birlikte pozitif Negatif non-hla reaksiyonu? Transplantation Immunology methods and protocols 2013

37

38 cpra Anti HLA antikorları SAB ile saptanıyor Unacceptable program (HLA-A-B-DR için 5000 MFI HLA-C ve DQ için MFI) Alıcı/verici için HLA -A,-B,C-,DRB1, DRB3/4/5 DQB1 tiplemesi FXM Cutoff T ve B için 47, 80 Kuvvetli pozitif MCS >100 T ; >200 B Zayıf pozitif MCS< 100 T ; < 200 B için

39 Baranwal, IJMR,2017

40

41 Sanal Cross Match Tek antijen boncuklar kullanılarak elde edilen ayrıntılı HLA spesifitelerini (son 1 ay içindeki serum) Potansiyel bir donörün HLA doku tipi ile karşılaştırılması bu donörle yapılacak cross-match sonucunun öngörülmesidir

42 Sanal cross-match, nakil öncesi risk tahmini ve organ dağıtımında önemlidir. (özellikle yüksek oranda sensitize hastalar için)

43 Sanal cross-match uygulaması sayesinde, pre-liminer cross-match ihtiyacı ortadan kalkmış Soğuk iskemi süresi azalmıştır

44 Sanal Cross Match Negatif bir CM sonucunu öngörebilir mi? Kabul edilebilir bir sonucu öngörebilir mi? Tüm organ nakillerinde uygulanabilir mi? Sanal XM Çalışma Grubu ( Robert Bray et al )

45 EVET, Antijenler ve Antikorlar (A,B,C,DRB1,DRB3,4,5,DQB1,DQA1,DPB1,DPA1) iyi tanımlanacak Her laboratuvarın proses ve prosedürü tanımlayan bir politikası olacak Antikor varlığı veya yokluğu birden fazla yöntem ile birden fazla örnekte teyit edilecek Non HLA komponentleride tanımlanacak Endotelyal hücre antikorları,mica- antikorları,glutatyon S transferaz antikorları,anjiotensin reseptör antikorları,minor HLA antikorları

46 Transplant merkezi ile protokol yapılacak Laboratuvar gerektiğinde prospektif CM yapabilecek Alıcının eski serumları gerektiğinde değerlendirilecek Transplantın ilk günü serum alınacak

47 DSA saptanması Tek antijen boncuk (SA bead) dayalı Solid faz yöntemleri

48 DSA karakterizasyonu yapılabilir mi? Kompleman bağlayıcı DSA IgG alt sınıflaması Çalışma tasarımları ve sonuçlardaki heterojenite nedeni ile bu tekniklerin klinik uygulamalarda nasıl kullanılacağına dair bir konsensus yok Amico P. American Journal of Transplantation 2015

49 Solid Faz Immunoassay-Luminex

52

53 Ortalama floresan yoğunluğu (MFI) Lumineks tek antijen eksprese eden boncuklar HLA antikor spesifisitesini mükemmel bir şekilde tanımlamaktadır. Tek bir HLA eksprese eden bireysel boncuklar

54 Luminex Modifikasyonları C4d assay Kompleman fikse eden ve etmeyen antikorların ayrımında kullanılır. Kompleman aktivasyonu gerekir Kompleman regüle edici faktörlerden etkilenir C4d+ antikorların varlığının böbrek ve kalp graft ömrü ile ilişkili olduğunu gösteren yayınlar mevcut

55 Luminex Modifikasyonları C1q assay Komplemana bağlanan ve klasik yolağı aktive etme yeteneğine sahip antikorlar saptanır. Kompleman aktivasyonu gerekmez Kompleman regüle edici faktörlerden etkilenmez. Standart miktarda hc1q hasta serumuna eklenir; sonra SAB ler eklenir; en son PE konjuge anti hc1q antikorları eklenir

56 Luminex Modifikasyonları C1q assay Daha çok IgG antikoru saptar (CDC den ) Kompleman fikse eden IgM leri de saptar. Kardiyak ve renal transplant rejeksiyon ve C1q antikor ilişkisini.

57 Testin hassasiyeti: Klinik risk ve test hassasiyeti arasındaki ters ilişki Klinik anlamlılık: Taylor et al,. Hum Immunol, 2009

58 Aşırı hassas bu yeni testler bekleme listesindeki sensitize hasta yüzdesini önemli oranda etkilemektedir 100 % sensitize hastalar CDC ELISA Lumineks MFI>5000 Lumineks MFI>1000

59

60 HLA ve non HLA antikorları Transplant öncesi; Nakil geçmişi Kan transfüzyonu, Hamilelik Mekanik destek Kalp cihazı HLA DSA ya da Non HLA antikorları Süre AMR ile ilişkili Faktörler Transplant Transplant sonrası; Özgüllük, Kararlılık, Kompleman bağlama yeteneği, izotip /alt sınıf, Yoğunluk, Afinite, ve Glikosilasyon De novo DSA ya da Non HLA antikorları Histoloji Disfonksiyon Endotelyal ödem hücre artışı, Mikrovasküler inflamasyon, Makrofaj infiltrasyonu, Kompleman birikimi +/- Sonuç: 1)Stabil Fonksiyon: a) DSA (+) b) IgG2, IgG4 c) C1q-, C4d- 2) Subklinik AMR a) DSA (+) b) IgG2, IgG4 c) C1q-, C4d± 3) Klinik disfonksiyon A) Akut AMR a) DSA (+) b) IgG3, IgG1 c) C1q+ Cd4+ B) Kronik AMR a) DSA + b) IgG2, IgG4 c) C1q±, C4d±

61 TEŞEKKÜRLER